天津大学改造假单胞菌高效转化木质素合成4-乙烯基苯酚衍生物

科技 2024-10-31 16:32 上海

木质素是自然界中储量最大的天然可再生芳香化合物资源，是仅于纤维素的，的第二大天然生物聚合物。木质素生物增值利用有望实现生物质炼制经济可行性、促进“双碳”目标的实施与生物经济发展。4-乙烯基苯酚衍生物（4VPs），包括4-乙烯基苯酚（4VP），4-乙烯基愈创木酚（4VG）和4-乙烯基丁香酚（4VS），是一类在食品，香料，制药和聚合物等工业领域拥有广泛应用的高值芳香族化合物。特别是由于其在248 nm深紫外光下的光透过性和高灵敏性，4VPs成为用于KrF光刻技术的光刻胶材料的主要成分，在芯片产业具有重要应用。传统上，4-乙烯基苯酚衍生物的生产主要依赖对应的羟基肉桂酸在高温高压下的化学法脱羧或Knoevenagel缩合反应。幸运的是，在酚酸的毒性压力下，多种细菌和真菌进化出了对羟基肉桂酸的非氧化代谢途径，在这一过程中，羟基肉桂酸直接被酚酸脱羧酶（PAD）催化脱羧，转化为4-乙烯基苯酚衍生物。因此，利用合成生物学的技术和手段，开发在温和条件下将芳香木质素转化为4VPs的细胞工厂无疑为木质素增值和4VPs生产提供了一条绿色安全可持续的原子经济性途径。

图1. 《Chemical Engineering Journal》文章上线截图

2024年10月，来自天津大学化工学院合成生物学前沿科学中心的元英进院士、李炳志教授和刘志华副教授在《Chemical Engineering Journal》杂志发表了题为“One-Pot Bioconversion of Lignin to 4-Vinylphenol Derivatives”的研究论文，刘若盈博士生为论文第一作者。该团队通过合成生物学菌株构建、代谢工程调控、发酵分离和阳离子聚合等技术策略开发，成功建立了木质素高效增值为生物基聚苯乙烯的原子经济转化途径，实现P. putida KT2440细胞工厂高效合成4VPs。研究发现，脱羧酶是关键实现这一途径的关键限速酶，通过筛选和异源表达酚酸脱羧酶，成功从木质素衍生的芳香族前体中生产出了4VPs；为了进一步提高4VPs的产量，研究人员利用木质素衍生物和4VPs在双相体系中分配系数差异，开发了三丁酸甘油酯/水双相发酵体系，成功解除了芳香底物和芳香产物4VPs对菌株异质的普遍性难题，4VP、4VG和4VS的滴度分别达到了235.3、203.0和35.8 g/L。针对木质素底物异质特殊性，进一步设计细胞工厂可通过一锅生物转化同时将H、G和S型芳香族前体转化为4VPs。该细胞工厂还表现出了对真实木质素水解液的优异的生物转化能力，生产4VPs滴度达14.7 g/L。利用阳离子聚合法成功得到了两种具有良好热稳定性的聚4-乙烯基苯酚衍生物。因此，该研究展示了其彻底改变木质素生物增值模式和生产功能性聚苯乙烯材料的潜力。

图2. 理性设计P. putida KT2440从木质素衍生物中积累芳香族前体的路径

研究人员首先基于合成生物学策略通过敲除改造木质素生物转化途径，并建立关键脱羧酶酶筛选与异源表达策略，构建了4VPs的异源合成路径。结果表明来自Bacillus licheniformis和Bacillus pumilus的PAD和工程酶SAD可以有效催化木质素衍生的对香豆酸，阿魏酸和芥子酸脱羧转化为相应的4VPs。然而，OD₆₀₀显示出高产4VP和4VG的菌株受到了严重的抑制作用。

图3. 通过表达酚酸脱羧酶（PAD）实现从木质素衍生物中高效生产4VPs

研究人员发现工程菌株在单水相中生产4VPs的存在一个极值，即4VPs与工程菌持续接触，产物毒性使得工程菌株不能完全转化木质素衍生物。因此，为了进一步提高工程菌株生产4VPs的性能和产品滴度，根据木质素底物和4-乙烯基苯酚衍生物在水相和有机相中不同的分配动力学行为，研究人员筛选了多种有机萃取相构建双相发酵体系，结果表明，甘油三丁酸酯拥有适合工业生产的物理化学性质，并且可以获得最高的产品滴度和较高的原位萃取效率，成为构建双相体系的最佳选择。

图4. 双相萃取系统有效的提高了工程菌株生产4VPs的性能

对4VPs的生产体系进行优化后，限制其产量的另一关键因素是底物的可用性。为了最大程度提到4-乙烯基苯酚衍生物的滴度，研究人员继续在双相甘油三丁酸酯/水双相体系中以高浓度木质素衍生物为前体进行生物生产，得到了235.3 g/L的4VP和203.0 g/L的4VG，代表了微生物摇瓶发酵生产4VP的最高水平。此外，为克服真实木质素的异质性问题，构建三种底物一锅法生产4VPs，细胞工厂最终实现了从混合芳香底物合成创纪录的211.4 g/L的4VPs滴度。

图5. 细胞工厂在原位双相萃取体系中高效一锅法生产4VPs

最后，研究人员采用玉米秸秆增溶策略分离解聚木质素，得到适合用于微生物转化的可溶性木质素并进行4VPs的生产。细胞工厂从真实木质素水解液中生产了14.7 g/L的4VPs。因此，该细胞工厂证明了其即使在严苛的条件下，如含有浓缩木质素水解液和有机覆盖相，也能保持优异的生产性能。同时，鉴于4VPs是石油基苯乙烯的生物基替代品，有望成为新型聚苯乙烯材料，特别是可用作KrF光刻技术的抗蚀剂基质，研究人员对4VPs进行了阳离子聚合，以探索它们作为单体制备聚合物的应用潜力。结果发现，聚4-叔丁氧基苯乙烯的分子量分布，重均分子量为2959，多分散系数为1.7。聚4-乙烯基愈创木酚的分子量分布，重均分子量为1147，多分散系数为1.2。热重分析结果表明两种聚合物都拥有良好的热稳定性。因此，本研究成功实现上游木质素生物增值为4-乙烯基苯酚衍生物和下游4-乙烯基苯酚衍生物的聚合，建立了木质素升级为生物基功能性聚苯乙烯的技术路线。

图6. 细胞工厂转化真实木质素水解液为4VPs并制备相应聚合物

总之，这项工作为突破木质素生物转化途径缺失，产物合成效率低和木质素异质性难题，从原子经济性生物转化的角度出发，构建了木质素生物增值为4-乙烯基苯酚衍生物的生物合成路径，实现了4-乙烯基苯酚衍生物的高滴度微生物生产，构建了木质素全组分利用的生物体系，提出了克服木质素异质性的生物转化新方案，研究为木质素生物增值研发提供了全新方案。

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