浙工大基于功能环酶工程高效合成维贝格龙中间体

科技 2024-10-23 16:30 上海

在化学合成领域，手性药物中间体的生物催化合成因其高效性和环境友好性而受到广泛关注。特别是对于治疗膀胱过度活跃症（OAB）的新药维贝格龙（Vibegron），其手性前体(2S,3R)-氨基羟基酯的合成尤为关键。然而，化学不对称合成的局限性促使科学家们寻求生物催化合成路径。羰基还原酶（CRs），一类能够利用NADH或NADPH作为辅酶，将前手性酮或醛不对称还原为手性醇的氧化还原酶，在这一过程中扮演着重要角色。然而，现有的CRs资源对于维贝格龙手性中间体的生物合成仍然稀缺，且报道的催化效率尚未达到工业要求。因此，探索具有高活性的CRs对于维贝格龙手性中间体的生物合成具有重要意义。

图1. 底物1a生物转化为维贝格龙手性中间体

2024年10月22日，来自浙江工业大学手性化学品生物制造国家与地方联合工程研究中心的郑裕国院士和柳志强教授在《Biotechnology and Bioengineering》杂志发表了题为“Improving the catalytic performance of carbonyl reductase based on the functional loops engineering”的研究论文，该团队通过功能环工程策略，成功提高了来自藻微小杆菌（E. algae）的羰基还原酶EaSDR6的催化性能。研究团队通过定向进化技术，获得了变异株M5（A138L/A190V/S193A/Y201F/N204A），其对目标产物的催化效率比野生型EaSDR6提高了868倍，达到了260.3 s⁻¹ mM⁻¹，同时保持了极高的立体选择性（>99% 对映体过量，e.e.；>99% 非对映异构体过量，d.e.）。通过分子动力学模拟和相互作用分析，研究人员揭示了M5变异株在与底物结合亲和力显著增强，尤其是在有机-水双相条件下，M5变异株在12小时内实现了300 g/L底物的>99%转化，这是目前报道的最高底物负荷量。

图2. 功能环区域在EaSDR6催化过程中的关键作用及其动态变化

研究人员首先深入分析了羰基还原酶EaSDR6中关键功能环区域的动态变化及其与底物1a的相互作用。通过对比底物未结合状态的野生型(WT)与底物结合状态的复合物(WT-1a)，研究发现环137-154和182-210在催化和底物结合中扮演着重要角色。分子动力学模拟结果显示，这两个环在WT-1a复合物中的均方根波动(RMSF)值低于WT，表明这些环可能在催化和底物结合过程中发挥密切作用。此外，通过序列保守性分析，这两个环的保守性较低，表明它们在进化过程中受到的选择压力较小，这为后续的蛋白质工程提供了潜在的热点残基。

图3. 通过CAST/ISM策略对EaSDR6进行定向进化，获得高活性变异株M5

接下来，研究人员通过丙氨酸扫描实验确定了9个关键位点，随后通过NNK密码子饱和突变产生了12个单点突变体，其中A190V变异体(M1)表现出显著的活性提升。基于M1的活性提升，研究者进一步构建了M2至M5的突变体，通过逐步增加突变位点，最终获得了M5变异体，其相对WT的催化活性提升了66倍，达到了26.5 U/mg。这一过程中，K_m值也从WT的3.1 mM逐步降低至M5的0.2 mM，表明变体对底物1a的亲和力显著增强。

图4. EaSDR6及其变异株M5的催化机制和关键催化距离分析

进一步，研究人员阐释了EaSDR6及其变异株M5对底物1a的催化机制，并通过分子对接结果揭示了关键的催化距离。在催化过程中，底物1a首先由S137稳定，随后Y150的羟基通过K154的协助转移至底物1a的羰基氧原子，与此同时，NADPH向底物的羰基碳原子提供氢原子，将其转化为羟基。模拟中，两个关键“催化”距离（d1和d2）作为反应发生前的关键指标，其中d1代表Y150与底物羰基氧原子间的距离，而d2代表NADPH与底物羰基碳原子间的距离。在WT与底物1a的复合物中，这些距离分别为4.2 Å和4.7 Å，而在M5变异株中，这些距离缩短至3.2 Å和3.1 Å，表明M5变异株更易于形成对底物1a的催化攻击构型，从而提高了催化效率。

图5. M5变异株与底物复合物表现出更高的催化构象比例和氢键数量

接着，研究人员通过分子动力学模拟比较了野生型EaSDR6和变异株M5与底物1a复合物的“催化”构象图和氢键分析。在模拟过程中，M5-1a复合物展现出了比WT-1a更高的“催化”构象百分比（10.25%对比4.39%），这表明M5变异株更倾向于与底物1a形成反应前状态，增强了其催化反应的准备状态。此外，整个100 ns的MD模拟过程中，M5与NADPH之间的氢键数量始终多于WT，特别是在系统达到平衡后的50 ns，这可能反映了M5变异株在底物结合口袋周围的结构调整，增强了与NADPH的结合以及质子转移效率。在100 ns后的结构比较中，M5变异株的活性口袋体积略有减小（528 Å³），表明其底物亲和力得到了显著增强。

图6. 关键氨基酸突变对M5变异株底物结合口袋结构和催化效率的影响

研究人员通过对比野生型EaSDR6与M5变异株的复合物结构，发现M5中A138L、A190V、S193A、Y201F和N204A这些突变显著优化了底物结合口袋的体积和疏水性，从而增强了与底物1a的亲和力。具体来说，A138L突变扩大了口袋C的空间，减少了与苯环的不利水分子作用力；A190V和S193A突变放松了α-Helix7的氢键网络，增加了与底物1a的疏水相互作用；Y201F和N204A突变将口袋A中的亲水残基转变为疏水残基，有利于底物1a的结合和稳定。这些结构调整导致关键催化距离d1和d2缩短至3.2 Å和3.1 Å，远小于野生型的4.2 Å和4.7 Å，从而促进了质子从Y150向底物1a的羰基氧转移以及NADPH向底物1a的羰基碳的氢化物转移。

图7. 不同底物浓度下的不对称还原反应性能及其立体选择性

最后，研究人员探究了野生型EaSDR6和变异株M5在不同底物浓度下进行不对称还原反应的性能。在100 g/L的底物浓度下，野生型仅在24小时内实现了39.2%的转化率，而M5变异株在6小时内就达到了完全转化。当底物浓度提高到200 g/L时，M5在10小时内实现了>99%的转化率，而在最高的300 g/L底物浓度下，M5在12小时内也达到了>99%的转化率，这代表了目前报道的最高底物负荷量。此外，M5在整个反应过程中保持了极高的立体选择性(>99% e.e., >99% d.e.)，没有检测到底物1a的其他非期望构型产物。这些结果表明，通过功能环区域工程改造的M5变异株不仅提高了催化效率，还增强了工业应用的潜力，为维贝格龙中间体的大规模生物合成提供了一个高效、高选择性的生物催化剂。

总之，这项工作不仅通过功能环工程策略显著提高了羰基还原酶的催化性能，而且为维贝格龙中间体的大规模生物合成建立了一个稳健的框架。这一成果不仅为类似底物的羰基还原酶催化效率提升提供了宝贵的见解，还加速了工程化羰基还原酶在维贝格龙工业相关中间体的生物催化生产中的应用。这标志着在生物催化领域，通过理性设计和定向进化技术，可以有效地解决工业生产中的效率和选择性问题，为未来手性药物的生产提供了新的策略和方法。

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