北理工开发生物传感器实现香兰素高效生产

科技 2024-09-04 16:30 上海

在食品、化妆品和制药行业中，香兰素作为一种广泛使用的香精化合物，其天然来源的供应受限且价格昂贵。传统的香兰素生产方法包括植物提取、化学合成和微生物合成，但都存在成本高、安全性问题或效率低等挑战。特别是从低成本的莽草酸生物合成香兰素的过程中，由于关键酶咖啡酸O-甲基转移酶（COMT）活性低，导致生产效率受到显著限制。

图1. 开发生物传感器筛选甲基转移酶高效合成香兰素

2024年8月29日，来自北京理工大学生命学院的郭淑元教授和孙丽超助理教授在《ACS Synthetic Biology》杂志发表了题为“Pathway-Adapted Biosensor for High-Throughput Screening of O-Methyltransferase and its Application in Vanillin Synthesis”的研究论文，该团队设计了一种适应COMT介导的香兰素合成途径的生物传感系统，通过进化醛类转录因子YqhC，获得了一个双重响应的变体MuYqhC，它对产物香兰素有正响应，对底物有负响应，对中间产物无响应。利用基于MuYqhC的香兰素生物传感器，研究团队成功鉴定出一种COMT变体Mu176，其转化率比野生型COMT提高了7倍。该变体能将3 mM的原儿茶酸转化为2.38 mM的香兰素，转化率达到79.33%。通过在枯草杆菌中应用Mu176，将莽草酸的香兰素产量提高了2.39倍。进一步优化生产底盘，增加S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的供应和前体浓度，将香兰素滴度提高到1 mM，这是迄今为止在枯草杆菌中从莽草酸合成香兰素的最高水平。

图2. 将莽草酸转化为香兰素的代谢途径

在莽草酸到香兰素的生物合成途径中，首先通过莽草酸脱氢酶（SDH）和3-脱氢莽草酸脱水酶（DSD）将莽草酸转化为原儿茶酸（PCA），接着PCA在咖啡酸O-甲基转移酶（COMT）的作用下转化为香草酸，最后香草酸被羧酸还原酶（CAR）还原成香兰素。特别地，实验数据显示，COMT对PCA的转化率达到了14%，而从原儿茶醛（PAH）到香兰素的转化率几乎可以忽略，表明COMT更倾向于催化PCA生成香草酸。此外，CAR对香草酸的转化效率高达87.80%，而对PCA的转化效率仅为12.60%，从而证实了莽草酸到香兰素的主要代谢通路是通过香草酸而非PAH。

图3. 使用YqhC变体建立香兰素生物传感系统

接下来，研究人员利用Alphafold服务器预测了YqhC的二聚体结构，并模拟了其与DNA结合的构象变化。YqhC的每个单体具有两个螺旋-转角-螺旋（HTH）结构域，这些结构域在醛类配体的结合下发生构象变化，从而激活yqhD基因的表达。通过突变YqhC基因并筛选出对香兰素有正响应、对PCA有负响应的变体MuYqhC，研究人员建立了一个对香兰素合成途径具有特异性响应的生物传感器。MuYqhC对3 mM香兰素的响应呈现线性，RFP/OD₆₀₀值增加了1.72倍，Km值为0.39 mM。相比之下，对PCA的响应则表现为随着浓度增加RFP/OD₆₀₀值降低，表明MuYqhC对PCA有负响应。此外，MuYqhC对莽草酸和香草酸几乎无响应，这使得该生物传感器在香兰素发酵过程中具有高度的特异性和灵敏度。

图4. YqhC基生物传感器的配体和DNA对接分析

研究人员通过模拟YqhC开放和闭合构象状态下与香兰素的结合模式，探讨了YqhC及其变体MuYqhC的配体结合特性。在开放构象中，香兰素位于YqhC N-末端和C-末端结构域之间的沟槽内，其中Tyr66、Lys78和Arg119是与香兰素相互作用的关键残基。Arg119与香兰素的醛基形成氢键，而Tyr66与香兰素的苯环形成π-π堆叠，Lys78则与香兰素的甲氧基形成氢键。这些相互作用共同稳定了配体在结合口袋中的位置。闭合构象中，香兰素被包裹在内部口袋中，并通过Arg119进一步稳定。通过设计这些关键残基的单点突变体，研究证实Tyr66和Arg119对于配体响应至关重要。此外，MuYqhC中Ser279和Ala282的突变导致HTH-2结构域进一步插入DNA主沟，增强了与DNA的结合亲和力，从而提高了对香兰素的敏感响应。

图5. 使用MuYqhC基生物传感器筛选提高转化率的COMT变体

接下来，研究人员构建了COMT基因的随机突变库，通过易错PCR技术生成不同变体，然后将含有这些变体的质粒转化到含有MuYqhC生物传感器的JM109菌株中。在含有5 mM PCA的培养基中进行发酵，通过测量发酵液产生的香兰素激活生物传感器，进而诱导红色荧光蛋白（RFP）的表达。通过荧光筛选，研究者成功筛选出多个RFP/OD₆₀₀值高于野生型VanCOMT的COMT变体，其中一个变体Mu176表现出3倍于野生型的荧光增强，表明其具有更高的香兰素产量。在后续的验证实验中，Mu176变体在转化3 mM PCA时，能够产生2.38 mM的香兰素，转化率达到79.33%，显著高于野生型COMT的10.33%，证实了Mu176在提高香兰素合成效率方面的潜力。

图6. COMT与PCA和SAM的对接分析

进一步，研究人员通过分子对接模拟深入揭示了COMT变体Mu176与底物PCA和辅酶SAM的相互作用机制。模拟结果显示，与野生型VanCOMT相比，Mu176的结合口袋表面积增大，为PCA和SAM提供了更适宜的结合环境。具体来说，Mu176中Met182的突变导致了结合口袋的微小构象变化，使得PCA与催化残基His271的距离从4.0 Å缩短至3.1 Å，同时PCA的羧基与His168的距离也从7.2 Å减少到5.7 Å。这些变化优化了PCA的定向，使其更接近催化活性中心，从而加强了与底物的接触并提高了催化效率。此外，Mu176中的Lys287Glu突变虽位于催化口袋之外，但对口袋大小和催化残基的微环境产生了影响，进一步增强了与PCA的相互作用。

图7. 在枯草杆菌中将莽草酸转化为香兰素

最后，研究人员通过在枯草杆菌中重构SAM循环，增强了SAM的供应，从而提高了COMT的活性。研究中，过表达mtnN和LuxS基因，将SAH转化为Hcys的步骤，使得从PCA到香草酸的转化率提高了4.33%。接着，研究人员将Mu176变体应用于BsΔ11菌株，与CAR和PPTase共表达，实现了从PCA到香兰素的高效转化，转化率达到19.67%。此外，通过在BsΔ1120菌株中整合莽草酸到PCA的生物合成途径，并进一步增加SAM循环，使得从莽草酸到香兰素的转化率达到了14.67%。最终，通过提高莽草酸的浓度，BsΔ1120SA18菌株的香兰素产量达到了1 mM，这是目前报道的最高产量。

总之，这项工作通过生物传感器技术的创新应用和酶工程的巧妙结合，不仅提高了香兰素的生产效率，还为其他生物合成途径的优化提供了新的策略和思路。这项工作强调了合成生物学在推动工业生物技术发展中的关键作用，并展示了通过理性设计和系统优化实现生物制造过程改进的巨大潜力。

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