Nature Chemical Biology丨衣康酸对糖酵解相关蛋白的修饰——基于 S-糖基化的半胱氨酸分析

用 1-OH-Az 检测衣康酸的修饰作用

    为了分析衣康酸在蛋白质组中靶向的半胱氨酸，作者首先在基于凝胶的检测中评估了两种广泛使用的硫醇反应探针：IA-炔和 α,β-不饱和酮（UK）-炔(5)。Raw 264.7 细胞裂解物被 100 μM 的 IA-alkyne 或 UK-alkyne 标记，衣康酸的竞争性不断增加，并通过铜（I）催化的叠氮-炔环加成与叠氮-Cy3 共轭。凝胶内荧光扫描显示，在浓度高达 2 mM 时，两种探针都不能被衣康酸有效竞争，这可能是由于代谢物的亲电性较弱。考虑到过-O-乙酰化的非天然单糖与 IA 和 UK 相比亲电性降低，作者认为它们与衣康酸的弱反应谱更适合进行竞争性分析。结果表明，250 μM 的衣康酸可以有效地竞争Ac4ManNAz 的标记（图1a）。然而，Ac4ManNAz 的总体标记效率很低，导致对蛋白质组中半胱氨酸的覆盖范围有限。

    为了调整Ac4ManNAz 的反应活性以提高半胱氨酸组的覆盖率，作者测试了另一种基于单糖的探针，3,4,6-O-Ac3ManNAz（1-OH-Az，4），其假设是乙酰基的水解是 S-糖基化的前提条件（图1a）。1-OH-Az 在 C-1 位具有游离羟基时，与纯化蛋白质（图1b）和细胞裂解液（图1c）的反应性确实增强了。用 IA 阻断游离硫醇可消除标记信号，这表明探针主要与硫醇反应（图1d）。不出所料，用不可水解的乙基（1-Et-3,4,6-O-Ac3ManNAz,6）封盖 C-1 羟基会完全取消探针的反应性。更重要的是，尽管反应活性增强，1-OH-Az 仍能与衣康酸保持较强的竞争性。

1-OH-Az 是一种独特的半胱氨酸组分析探针

    接下来，作者进行了TOP-ABPP实验，以评估 1-OH-Az 的半胱氨酸组覆盖率。使用含有可酸解的二烷氧基二苯基硅烷连接体（烷基-AC-生物素）的炔基生物素标签，作者从 1-OH-Az 处理过的细胞裂解液中选择性地捕获叠氮修饰的肽段进行富集，并通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析。作者共鉴定出 1,395 个被 1-OH-Az 修饰的半胱氨酸。有趣的是，98.3% 的修饰半胱氨酸的加合物质量与探针的二乙酰化形式Ac2ManNAz 相对应。在所有亲核残基（Cys、Asp、Glu、His、Lys、Ser、Thr 和 Tyr）中，修饰主要发生在半胱氨酸上（93%），这证实了 1-OH-Az 是一种用于半胱氨酸分析的高选择性探针（图1e）。

    1-OH-Az 的整体半胱氨酸组覆盖率远高于Ac4ManNAz，这与凝胶分析结果一致。作者将 1-OH-Az 标记的半胱氨酸与之前使用 IA-alkyne探针进行的 80 多项独立 isoTOP-ABPP 实验所获得的 9,376 个活性半胱氨酸数据集进行了比较。除了常见的 970 个半胱氨酸外，1-OH-Az 探针还针对 359 个蛋白质上的 401 个半胱氨酸，这可能是它与 IA-alkyne 探针在衣康酸竞争方面表现不同的原因（图1f）。值得注意的是，根据 DrugBank 数据库（www.drugbank.ca，图1f），1-OH-Az 新鉴定的这些蛋白质中有 87% 被认为是不可配体的。由于这些新发现蛋白质的分子功能多种多样，并与多种疾病有关，因此 1-OH-Az 探针原则上可用于发现以这些活性半胱氨酸为锚的具有深远治疗潜力的新配体。

衣康酸修饰的细胞组剖析

    接下来，作者用 1-OH-Az 进行了竞争性 isoTOP-ABPP 实验，以量化目标半胱氨酸上的衣康酸修饰（图2a）。先用 250 μM 衣康酸预处理蛋白质组，然后用 200 μM 1-OH-Az 标记。按照 isoTOP-ABPP 方案，使用一对同位素标记的可酸解连接体（isoTCL）对所得样本进行分析。总体而言，在 766 个被量化的半胱氨酸中，有 412 个（53.8%）的竞争比 (R250) 超过 1.5（图2b）。为了增加分析的可信度，作者又进行了一次 1 mM 衣康酸竞争性 isoTOP-ABPP 实验，发现 794 个定量半胱氨酸中有 496 个（62.5%）的竞争比（R1,000 ）超过 2.5。作者对这两个数据集进行了交叉检验，并将具有浓度依赖性竞争比的 260 个重叠半胱氨酸指定为衣康酸的最终靶点（图2c）。为了进行比较，作者还使用 IA-alkyne 探针进行了平行竞争分析。尽管 IA-alkyne 探针的反应活性更高，靶向的半胱氨酸也更多，但作者仅分别鉴定出 65 和 50 个半胱氨酸具有有效竞争（例如，R250 ≥1.5 和R1,000 ≥2.5）。在两种探针通常定量的半胱氨酸中，1-OH-Az 的竞争比通常要高得多（图2d）。

    作者的分析成功地鉴定出了 8 个半胱氨酸中的 6 个，这些半胱氨酸以前曾被表征为内源性衣康酸修饰，这表明作者的化学蛋白质组数据质量很高。为了进行验证，Raw264.7 细胞分别瞬时转染了两个已确定的衣康酸靶标--甲基化组蛋白 50（WDR77）和延伸因子 2（EEF2），并在富集前后对裂解液进行了免疫印迹分析。对于这两种蛋白，1-OH-Az 的标记都被衣康酸有效竞争，而 IA-炔探针则没有表现出实质性的竞争（图2e）。作者使用pLogo37评估了这些衣康酸修饰半胱氨酸的序列主题，发现修饰位点侧翼的特定氨基酸没有明显富集。对这些衣康酸修饰蛋白的生物信息学分析表明，它们主要分布在包括代谢过程、转录和翻译在内的生物通路中，表明衣康酸在调控细胞生理方面发挥着更广泛的作用。

衣康酸修饰并抑制关键的糖酵解酶

    作者发现，参与糖酵解途径的三种关键酶被衣康酸修饰，包括ALDOA、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和l-乳酸脱氢酶A（LDHA）（图3a）。在这三种酶中，ALDOA 位于糖酵解的最上游位置，通过将 β-d-果糖-1,6-二磷酸转化为 d-甘油醛-3-磷酸和磷酸二氢丙酮发挥重要功能。

    作者首先证实，在 LPS 刺激的 Raw264.7 细胞中，ALDOA 的 Cys73 和 Cys339 被衣康酸内源修饰（图3b）。这两个半胱氨酸是在竞争性异TOP-ABPP实验中用强衣康酸竞争定量的。ALDOA 的 C339Y 以前曾在一名溶血性贫血症患者体内发现基因突变，导致酶的不稳定性，这表明该半胱氨酸在功能上非常重要。由于这两个半胱氨酸在空间上相互靠近（图3c），作者推测它们上的衣康酸修饰可能会影响 ALDOA 的酶活性。

    接下来，作者用 1 mM 的衣康酸处理活细胞，测定了醛缩酶的活性，不出所料，ALDOA 的酶活性确实受到了抑制，而蛋白质水平却没有受到影响（图3d）。作者进一步验证了衣康酸能抑制细胞裂解液（图3e）和纯化酶（图3f）中的 ALDOA 活性。衣康酸对 ALDOA 的抑制作用主要取决于其形成共价迈克尔加合物的能力，因为对照化合物琥珀酸甲酯没有亲电的α，β-不饱和羧酸基团，所以没有抑制作用（图3e，f）。为了评估内源性衣康酸是否会影响 ALDOA 的活性，作者敲除了 LPS 刺激巨噬细胞中的 IRG1，以降低衣康酸的水平。结果观察到 ALDOA 活性大幅增加，表明内源性衣康酸确实能够抑制炎症巨噬细胞中的 ALDOA 活性（图3g）。

    除了 ALDOA 的 Cys73 和 Cys339 外，作者还通过竞争性 isoTOP-ABPP 分析确定了 LDHA 的 Cys84 和 GAPDH 的 Cys245，前者也被先前的研究确定为内源性衣康酸的修饰位点。作者的活性测定结果表明，衣康酸在活细胞和细胞裂解液中都能显著抑制 LDHA 的活性，但不能抑制 GAPDH 的活性。同样，衣康酸而非琥珀酸甲酯也能抑制纯化的 LDHA 的活性，而且在 IRG1 敲除后，LDHA 在 LPS 刺激的巨噬细胞中的活性也增加了。综上所述，这些结果表明衣康酸分别通过共价修饰ALDOA和LDHA的半胱氨酸来抑制其活性，从而可能对糖酵解产生深远影响。

衣康酸主要通过改变 ALDOA 来损害糖酵解作用

    作者接下来测试了衣康酸是否能调节炎症巨噬细胞的整体糖酵解过程。作者通过检测未受刺激和受刺激的 Raw264.7 细胞的葡萄糖消耗量和乳酸盐产生量来监测糖酵解通量。衣康酸大大降低了葡萄糖的消耗量和乳酸的产生量，表明它在巨噬细胞中起着糖酵解抑制剂的作用（图4a）。在小鼠 BMDMs 中也观察到了类似的效果（图4b）。此外，随着内源性衣康酸的产生被 IRG1 敲除抑制，整体糖酵解水平急剧增加（图4c）。为了研究衣康酸抑制时糖酵解中间产物水平的变化，作者使用13C 标记的葡萄糖进行了稳定同位素追踪实验。在测得的所有糖代谢产物中，只有 3-磷酸甘油醛（G3P）和乳酸下调，这与衣康酸抑制 ALDOA 和 LDHA 的模型一致（图4d）。作者还观察到13C 标记的葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸（G6P）的积累，这表明衣康酸可能会损害葡萄糖的分解代谢（图4e）。

    为了进一步探讨衣康酸修饰 ALDOA 与抑制糖酵解之间的关系，作者通过 RNA 干扰敲除了内源性 ALDOA 的表达，并通过瞬时转染在 Raw264.7 细胞中过表达野生型（WT）或双突变型（C73S/C339S）蛋白。不出所料，ALDOA 被敲除后，葡萄糖消耗和乳酸生成的总体水平下降，与对照细胞相比，这些代谢参数对衣康酸处理的敏感性大大降低（图4f,g）。外源表达 WT 或突变体 ALDOA 都能恢复未处理细胞的葡萄糖消耗和乳酸产生水平（图4f,g）；然而，与表达 WT ALDOA 的细胞相比，过表达突变体 ALDOA 的细胞在糖酵解抑制方面对衣康酸表现出更强的抵抗力（图4f,g）。测得的醛缩酶活性密切模拟了这些细胞在有或没有衣康酸处理时的糖酵解状态（图4h）。这些数据共同支持衣康酸通过修饰 ALDOA 的 Cys73 和 Cys339 并抑制其酶活性来损害糖酵解。

    作者还在 Raw264.7 细胞中通过敲除内源性 LDHA 和过表达其 WT 或 C84S 突变体进行了类似的实验。与 ALDOA 不同，敲除 LDHA 只影响乳酸的产生，而不影响葡萄糖的消耗。此外，与过表达 WT LDHA 的细胞相比，过表达 C84S 突变体的细胞对衣康酸介导的乳酸生成抑制更有抵抗力；然而，它们对葡萄糖的积累几乎没有影响。这些结果与 LDHA 催化糖酵解的最后一步--丙酮酸转化为乳酸--的事实一致，衣康酸对 LDHA 的抑制可能不会影响上游的葡萄糖分解代谢。最后，这些细胞中乳酸生成的抑制也与 LDHA 活性的抑制密切相关。这些结果共同证实，衣康酸分别通过修饰 ALDOA 和 LDHA 的半胱氨酸残基来抑制它们的活性，从而导致巨噬细胞中糖酵解功能受损。

ALDOA 抑制有助于炎症反应

    此前有报道称，富马酸二甲酯是一种亲电性药物，由富马酸衍生而来，其活性基团与衣康酸相似，可通过修饰 GAPDH 中的半胱氨酸并抑制糖酵解而发挥抗炎作用。鉴于促炎信号会刺激巨噬细胞中的新陈代谢重编程，使糖酵解增强，作者假设衣康酸也可能通过以反馈方式破坏糖酵解来发挥其抗炎作用。作者观察到，在敲除 ALDOA 后，白细胞介素（IL）-1β 在 LPS 刺激下的分泌被大幅抑制，这表明 ALDOA 是通过调节糖酵解介导巨噬细胞炎症反应的功能相关靶点（图5a）。此外，通过补充丙酮酸（糖酵解的下游中间产物）可以部分逆转敲除 ALDOA 的抗炎作用（图5a）。另一方面，类似的敲除 LDHA 并不能抑制 IL-1β 的分泌，这表明 LDHA 对炎症反应的贡献是有限的。综上所述，这些结果表明，ALDOA 是糖酵解过程中一个功能更相关的靶点，它能介导炎症反应。

    为了进一步研究糖酵解受损是否在介导衣康酸的抗炎作用中发挥作用，作者用低浓度（0.5 mM）或高浓度（10 mM）葡萄糖培养 Raw264.7 细胞，并测量衣康酸处理时 IL-1β 的分泌。在用更多葡萄糖处理因而糖酵解本身更活跃的细胞中，衣康酸抑制 IL-1β 分泌的效果要差得多（图5b）。考虑到 Raw264.7 细胞缺乏组装炎症小体和处理分泌的 IL-1β 所必需的凋亡相关斑点样蛋白（含有 CARD）适配蛋白，作者进一步验证了在 BMDMs 中也观察到了类似的效果（图5c）。此外，与衣康酸对醛缩酶和糖酵解活性的抑制作用降低（图4f-h ）相一致的是，当内源酶被沉默时，与过表达 WT ALDOA 的细胞相比，过表达突变体 ALDOA 的细胞对衣康酸诱导的抗炎作用（例如 IL-1β 分泌减少）的抵抗力更强（图5d）。这些数据表明，衣康酸的抗炎作用至少部分是通过修饰 ALDOA 的关键半胱氨酸、抑制其酶活性和抑制糖酵解介导的。

    考虑到之前有报道称衣康酸通过 KEAP1-NRF2 通路发挥抗炎作用，作者着手确定糖酵解障碍对衣康酸抗炎作用的贡献是否依赖于 NRF2。NRF2 的转录活性首先被 5 μMML38541（一种成熟的 NRF2 抑制剂）处理 72 小时后废止。在此条件下，仍可观察到衣康酸对糖酵解通量的抑制以及对 ALDOA 和 LDHA 活性的抑制。衣康酸在 NRF2 抑制条件下仍能保持其抗炎作用，而这种作用依赖于其对 ALDOA 的修饰（图5e）。综上所述，作者的研究结果表明，衣康酸通过抑制 ALDOA 而介导的抗炎作用独立于 KEAP1-NRF2 通路，它构成了一个新的负反馈回路，即衣康酸直接修饰 ALDOA 的关键半胱氨酸，抑制其酶活性并减缓受刺激的糖酵解（图5f）。