Chestnut Studying
摘要
Innate immune responses are linked to key metabolic pathways, yet the proximal signaling events that connect these systems remain poorly understood. Here we show that phosphofructokinase 1, liver type (PFKL), a rate-limiting enzyme of glycolysis, is phosphorylated at Ser775 in macrophages following several innate stimuli. This phosphorylation increases the catalytic activity of PFKL, as shown by biochemical assays and glycolysis monitoring in cells expressing phosphorylation-defective PFKL variants. Using a genetic mouse model in which PFKL Ser775 phosphorylation cannot take place, we observe that upon activation, glycolysis in macrophages is lower than in the same cell population of wild-type animals. Consistent with their higher glycolytic activity, wild-type cells have higher levels of HIF1α and IL-1β than Pfkl S775A/S775A after LPS treatment. In an in vivo inflammation model, Pfkl S775A/S775A mice show reduced levels of MCP-1 and IL-1β. Our study thus identifies a molecular link between innate immune activation and early induction of glycolysis.
先天性免疫反应与关键的新陈代谢途径有关，但人们对连接这些系统的近端信号事件仍然知之甚少。在这里，我们发现在几种先天性免疫刺激下，肝型磷酸果激酶 1（PFKL）这种糖酵解的限速酶在巨噬细胞中的 Ser775 处发生磷酸化。这种磷酸化会增加 PFKL 的催化活性，生化试验和对表达磷酸化缺陷 PFKL 变体的细胞进行的糖酵解监测表明了这一点。通过使用 PFKL Ser775 磷酸化不能发生的遗传小鼠模型，我们观察到巨噬细胞在激活后的糖酵解率低于野生型动物的相同细胞群。与较高的糖酵解活性相一致，野生型细胞在 LPS 处理后的 HIF1α 和 IL-1β 水平高于Pfkl S775A/S775A。在体内炎症模型中，Pfkl S775A/S775A小鼠的 MCP-1 和 IL-1β 水平降低。因此，我们的研究确定了先天性免疫激活与糖酵解早期诱导之间的分子联系。
实验结果1
先天性免疫刺激诱导 PFKL 在 Ser775 处磷酸化
以往的研究表明，在先天性免疫刺激（如TLRs8）作用下，巨噬细胞中的糖酵解活性会迅速增强。为了详细了解先天性免疫刺激诱导的糖酵解，作者在用各种 TLR 激动剂和重组 TNF 处理 1 小时后，对小鼠骨髓巨噬细胞（mBMDM）进行了糖酵解压力测试。作者的研究发现，在注射葡萄糖后，未受刺激和受刺激的细胞的ECAR都会明显增加。值得注意的是，与未受刺激的细胞相比，受刺激细胞的 ECAR 明显更高。此外，寡霉素是线粒体 ATP 合成的强效抑制剂，它的加入进一步加剧了 PAMP 和 TNF 刺激细胞的 ECAR 增加（图 1a）。在人单核细胞衍生巨噬细胞（hMDM）中也观察到了类似的结果。糖酵解的快速增加表明，TLR 信号可能会诱导糖酵解途径中的一种限速酶发生翻译后修饰，从而起到异位开关的作用。为了探讨这一假设，作者分析了之前发表的用LPS 刺激 mBMDM 的磷酸化蛋白质组数据集。在这里，作者发现 PFKL 是 mBMDM 中磷酸化增加的前十个蛋白质之一（图1b）。具体来说，在 LPS 处理 30 分钟后，作者发现巨噬细胞中 PFKL 的 C 端尾部的丝氨酸残基 775 发生了强磷酸化（图1b）。PFKL 是 PFK1 酶复合物的一部分，它负责糖酵解途径的第一步，催化 6- 磷酸果糖（F6P）和 ATP 向 1,6-二磷酸果糖（F1,6BP）和 ADP 的转化（图1c）。在哺乳动物体内，PFK1 由三种不同的异构体22 组成同构或异构四聚体，分别由不同的基因位点编码： PFKP（血小板）、PFKL（肝脏）和 PFKM（肌肉）。虽然这三种同工酶具有高度的序列同一性，但它们的 C 端延伸部分却有所不同，这与它们的活性调节有关。有趣的是，PFKL 中的 Ser775 残基在脊椎动物中高度保守。此外，PFKL 是 PFK1 在巨噬细胞中的主要表达异构体（图1d），这表明 PFKL 可能在先天性免疫反应中控制糖酵解过程中发挥关键作用。
为了研究巨噬细胞活化是否真的会触发 PFKL 在 Ser775 处的磷酸化，作者针对特异性含有磷酸化 Ser775 的 C 端 PFKL 肽或其未磷酸化的对应物提出了抗体。由此获得的单克隆抗体在免疫印迹中对Ser775磷酸化的PFKL或总PFKL产生特异性信号。通过免疫印迹研究 PFKL Ser775 磷酸化水平发现，静息 mBMDM 中的信号相当微弱（图1e）。然而，用各种 TLR 配体（如 LPS、R848、Pam3CSK4 和 poly(I:C)）处理 mBMDM 后，PFKL Ser775 磷酸化显著增加，而 PFKL 的总水平保持不变（图1e）。在 hMDM 中也有类似的发现。静止的 hMDM 几乎没有磷酸化-Ser775 PFKL 信号，而 R848、LPS 或Pam3CSK4的刺激会导致 PFKL Ser775 磷酸化显著增加（图1f）。此外，同时激活 TLR2 和 dectin-1 的紫杉醇和 TNF 也导致 mBMDM 中 PFKL Ser775 磷酸化显著增加（图1g）。总之，这些发现表明 TNF 和 TLR 激活会诱导原代巨噬细胞中 PFKL 在 Ser775 处磷酸化，这可能是 TNF 和 TLR 诱导早期糖酵解爆发的关键机制。
实验结果2
PFKL Ser775 磷酸化受 IKK 复合物或 PKCδ 调节
TLR 信号转导的顶端事件之一是激活 TAK1 和 IKK 激酶复合物，TAK1 和 IKKβ 蛋白激酶依次参与激活。此外，也有人认为 PI3K-Akt 轴在驱动树突状细胞的糖酵解反应中起着重要作用24 ，尽管人们对 TLR 激活下游参与这一途径的精确信号事件还不太了解。为了研究这些激酶复合物的参与情况，作者用特异性 TAK1（Takinib）、IKKβ（TPCA-1）、PI3K（Wortmannin）或 AKT（MK2206 2HCl）抑制剂处理 mBMDM，然后研究 TLR 刺激后 PFKL Ser775 的磷酸化情况。为了检测这些抑制剂的活性和特异性，作者还检测了 IKK 复合物下游 p65 的磷酸化（Takinib 和 TPCA-1），以及 AKT 在残基 T308 和 S473 的磷酸化。结果发现，当 TAK1 和 IKKβ 受到抑制时，PFKL Ser775 磷酸化明显减弱，而 PFKL 磷酸化的减弱与 p65 磷酸化的减弱相当（图2a、b）。使用这些抑制剂时，AKT 磷酸化也同样减弱（图2a、b）。另一方面，尽管 AKT 磷酸化在很大程度上被阻断，但阻断 PI3K 和 AKT 的活化对 PFKL 磷酸化水平没有影响（图2c、d）。对人类巨噬细胞的研究也得出了类似的结果。因此，增加 Takinib 和 TPCA-1 的剂量会完全抑制 PFKL 磷酸化以及 AKT 磷酸化（图2e、f）。相反，Wortmannin 虽然完全阻断了 AKT 磷酸化，但对 PFKL 磷酸化没有影响（图2g）。TAK1和IKKβ抑制也抑制了PFKL在zymosan刺激下的磷酸化，zymosan同时激活了TLR2和dectin-1（图2h）。为了探究 dectin-1 信号传导的特殊作用，作者还使用 Go 6983 阻断蛋白激酶 C（PKC），PKC 是 dectin-1 通路下游的关键信号传导元件。用 Go 6983 处理zymosan 刺激的细胞可减少 PFKL Ser775 磷酸化，其程度与 IKK 抑制相似（图2i），而它并不影响其他 TLR 激动剂诱导的 PFKL 磷酸化。
为了验证 IKKβ 和 PKC 参与了 PFKL Ser775 的磷酸化，作者还在过表达 IKKβ 或 PKCδ 的功能增益设置中检测了 PFKL Ser775 的磷酸化。本研究选择了 PKCδ，因为它在zymosan 诱导的原代单核细胞和mBMDM的活化中起着关键作用。在 HEK293T 中过表达这些构建体表明，IKKβ 能以剂量依赖性方式诱导 PFKL Ser775 磷酸化。这种诱导与 PKC 无关，因为 Go 6983 并不影响这一过程。虽然单独过表达 PKCδ 只引起 PFKL Ser775 磷酸化的轻微增加，但加入 PKC 激活剂 PMA 能显著提高 PKCδ 诱导的 PFKL Ser775 磷酸化，这表明瞬时表达的 PKCδ 处于自抑制状态，需要上游信号才能激活。此外，只有 Go 6983 能降低这种效应，而 TPCA-1 则不能，这表明 PKCδ 触发的 PFKL Ser775 磷酸化依赖于与 IKKβ 不同的途径。
使用激酶磷酸化预测工具表明，PKCδ 和 IKKβ 都极有可能是 PFKLSer77528 的激酶。在考虑的 303 个激酶中，PKCδ 在小鼠 PFKL Ser775 位点上的排名高达 9 位，在人 PFKL Ser775 位点上的排名高达 15 位。因此，作者使用重组 PKCδ 和人 PFKL 进行体外激酶试验，进一步验证了 PKCδ 是否直接磷酸化 PFKL。免疫印迹分析显示，加入 PKCδ后，野生型 PFKL（PFKLWT）在 Ser775 处的磷酸化水平呈剂量依赖性增加（图2j）。相反，在最高剂量的 PKCδ 作用下，以丙氨酸取代 Ser775 的 PFKL 点突变体（PFKLS775A）未检测到任何信号（图2j）。综上所述，这些结果表明 TLR 诱导的 PFKL 磷酸化发生在 IKK 复合物的下游，与 AKT 信号无关。此外，在 dectin-1 的刺激下，PFKL 在 Ser775 处的磷酸化需要 PKCδ。此外，作者还证实 PKCδ 可直接使 PFKL 在 Ser775 处磷酸化。
实验结果3
Ser775 的磷酸化可增强 PFKL 的催化活性
作者的假设是，位于 PFKL 调控域的 Ser775 的磷酸化会影响其活性，因为已知调控域可调节 PFKL 激酶的活性。针对这一假设，作者希望研究不可磷酸化的 PFKL 突变体对糖酵解活性的影响。为此，作者在 HEK293T 细胞中删除了PFKL（PFKL-/-，图3a），并对这些细胞进行了糖酵解压力测试。PFKL-/-细胞显示出正常的基础 ECAR，但与 WT 细胞相比，它们在添加葡萄糖后的糖酵解率明显降低（图3b）。在这些条件下，使用寡霉素抑制线粒体 ATP 的产生不会进一步增加 ECAR，但PFKL-/-细胞的糖酵解率却显示出类似的缺陷（图3b）。在这些细胞中，作者使用强力霉素诱导系统重新表达了PFKLWT或PFKLS775A。虽然PFKLWT和PFKLS775A的表达水平相当（图3c），但与表达PFKLWT的细胞相比，表达PFKLS775A的PFKL-/-细胞的糖酵解活性明显降低（图3d、e）。这些结果表明，Ser775的磷酸化增强了PFKL的活性，从而增加了糖酵解。为了在体外研究PFKLWT和PFKLS775A的酶活性，作者在 HEK293T 细胞中表达了这些酶，然后使用亲和标签纯化了它们。然后，作者利用液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）测定了 F1,6BP 随时间产生的情况，从而测定了它们的催化活性。通过比较初始反应速率，作者发现PFKLS775A突变体的酶活性约为野生型的一半（图3f）。为了估算在这些异源表达条件下磷酸化的PFKLWT酶的数量，作者使用磷酸化特异性 Ser775 PFKL 抗体进行了免疫沉淀实验，并测定了未被 p-Ser775 PFKL 抗体结合的 PFKL 总量（图3g）。这样，作者发现约有 30% 的PFKLWT酶被磷酸化（图3h）。总之，作者的研究结果表明，Ser775 的磷酸化会增强 PFKL 的活性，为先天性免疫刺激后 PFKL 活性的调节提供了机理基础。
实验结果4
Pfkl S775A 小鼠模型的产生和特征描述
为了探索 PFKL Ser775 磷酸化在原代细胞和体内的作用，作者设计了一种小鼠模型，在这种模型中，PFKL 不能再在 Ser775 处发生磷酸化。为此，作者利用 CRISPR/Cas9 技术将小鼠胚泡中的 PFKL Ser775 诱变为 Ala775。培育出的小鼠含有 Ser775Ala PFKL 的双等位突变（PfklS775A/S775A ）（图4a）。与 WT 小鼠相比，PfklS775A/S775A小鼠没有表现出任何严重的发育缺陷，两组小鼠的体重和脾脏重量也没有差异（图4b-d）。为了研究 WT 和PfklS775A/S775A小鼠免疫细胞的数量和组成，作者对脾脏和骨髓细胞进行了流式细胞术分析。研究发现，与 WT 小鼠相比，PfklS775A/S775A小鼠骨髓中 CD4+T 细胞、NKp46+ NK 细胞和 CD11c+ MHCII+树突状细胞的百分比都显著下降。相反，CD11b+ Ly-6G+中性粒细胞的百分比明显增加（图4e、f），而 CD8+T 细胞、CD19+ B 细胞和 CD11b+ F4/80+巨噬细胞的百分比则不受影响。与 W型小鼠相比，PfklS775A/S775A小鼠的脾脏中 NKp46+NK 细胞、CD11b+ F4/80+巨噬细胞和 CD11b+ Ly-6G+中性粒细胞（图 4g、h）的比例明显更高。与 WT 小鼠相比，CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、CD19+ B 细胞和 CD11c+ MHCII+树突状细胞。作者还检测了血清中的几种促炎细胞因子，包括 IL-1α、IL-1β、IL-6 和 IL-27。然而，WT 小鼠和PfklS775A/S775A小鼠在这些细胞因子方面没有发现差异。总之，这些观察结果表明，至少在本文分析的稳态条件下，磷酸化诱导的 PFKL 活性减弱不会导致免疫系统出现重大紊乱。然而，骨髓和脾脏中性粒细胞数量的适度但一致的增加表明，PfklS775A/S775A小鼠的粒细胞生成可能会增加。
为了研究 PFKL Ser775 磷酸化在体内炎症中的作用，作者在腹腔 TNF 注射模型中研究了它的作用。血清细胞因子分析表明，与 WT 小鼠相比，注射 TNF 的PfklS775A/S775A小鼠的单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和 IL-1β 水平明显降低（图4i、j）。其他细胞因子（如 IL-6 和 TNF）没有发现明显差异。白细胞（WBC）计数评估显示，与模拟处理的小鼠相比，WT 小鼠注射 TNF 后细胞数量明显减少（图4k）。然而，注射 TNF 的 WT 小鼠和PfklS775A/S775A小鼠的白细胞数量没有明显差异（图4k）。评估白细胞中淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞的比例发现，注射 TNF 的 WT 小鼠和PfklS775A/S775A小鼠的淋巴细胞和中性粒细胞比例相似（图4l、m）。然而，与注射 TNF 的PfklS775A/S775A小鼠相比，注射 TNF 的 WT 小鼠的单核细胞比例明显较低，而嗜酸性粒细胞比例较高（图4n、o）。这些发现表明，PFKL Ser775 磷酸化在 TNF 诱导的炎症过程中起着调节免疫反应的作用，尤其是在调节 MCP-1 和 IL-1β 水平方面。与此同时，外周血单核细胞数量也会受到不同程度的抑制，这种现象可能是继 MCP-1 水平变化之后出现的。
实验结果5
先天性免疫刺激后，Pfkl S775A/S775A巨噬细胞显示出迟钝的糖酵解反应
为了探索 PFKL 磷酸化是否有助于原代巨噬细胞在受到先天性免疫刺激时糖酵解的增强，作者使用从 WT 小鼠和PfklS775A/S775A小鼠分离的 mBMDM 进行了糖酵解压力测试。在静息状态下，WT 和PfklS775A/S775A巨噬细胞的糖酵解没有差异（图5a）。然而，在 LPS 处理 1 小时后，PfklS775A/S775A巨噬细胞的糖酵解和糖酵解能力比 WT 细胞降低了约三分之一（图5a、b）。此外，在 LPS 处理 24 小时后，作者观察到PfklS775A/S775A细胞中的糖酵解和糖酵解能力仍下降到 WT 细胞水平的 80% 左右（图5c、d）。在小鼠 TNF 刺激下也观察到了类似的结果，与PfklS775A/S775A巨噬细胞相比，WT 巨噬细胞在 TNF 处理 1 或 24 小时后表现出更高的糖酵解和糖酵解能力（图5e-h）。为了进一步研究 PFKL Ser775 磷酸化如何影响糖酵解对紫杉醇的反应，作者还使用稳定同位素示踪剂进行了代谢通量测定。作者用含有U-13C-葡萄糖的培养基处理 WT 小鼠和PfklS775A/S775A小鼠的 mBMDM，然后用质谱法量化细胞代谢物。在酶联免疫吸附素刺激后，作者观察到 WT 和PfklS775A/S775AmBMDM 中的糖酵解显著增加，因为两种细胞中由U-13C葡萄糖衍生的 F6P m + 6、F1,6BP m + 6、磷酸二氢丙酮（DHAP）m + 3 和 3-磷酸甘油醛（GA3P）m + 3 的总含量在刺激后都急剧增加（图5i-l）。值得注意的是，WT 细胞比PfklS775A/S775A细胞显示出更高水平的这些代谢物（图5i-l），表明 WT 细胞的糖酵解率更高。总之，这些结果表明，在原代巨噬细胞受到先天性免疫刺激时，PFKL 在 Ser775 处的磷酸化在增强糖酵解中起着重要作用。
实验结果6
Pfkl S775A/S775A巨噬细胞产生更多的 ROS 并显示出更高的杀菌活性
最近的研究表明，PFKL 的活性是调节巨噬细胞和中性粒细胞中 ROS 形成的关键开关。因此，通过异源激活 PFKL 来促进糖酵解已被证明会降低磷酸戊糖途径 (PPP) 的通量，从而限制 NADPH 的产生，进而限制吞噬体 NADPH 氧化酶 NOX2 产生 ROS 的能力。作者发现，ROS 的强效诱导剂齐莫散能引发 PFKL 在 Ser775 处的磷酸化（图1g），从而增强其催化活性（图3）。为了研究 PFKL Ser775 磷酸化对 ROS 生成的影响，作者刺激了 WT 和PfklS775A/S775AmBMDM，并测量了作为吞噬体 ROS 生成替代物的非线粒体耗氧量。为此，作者用鱼藤酮和抗霉素 A 处理细胞，以消除通过线粒体呼吸产生的耗氧量，然后用齐聚糖刺激细胞，实时测量 OCR。不出所料，酶联免疫吸附素刺激细胞后，耗氧量剧增，刺激后 20 分钟左右达到峰值。先前的研究显示 PFKL 活性与 ROS 生成之间存在负相关，与此相一致，PfklS775A/S775A巨噬细胞产生的 ROS 明显多于 WT 细胞。为了研究这种 ROS 生成变化的功能相关性，作者研究了用活大肠杆菌挑战 WT 和PfklS775A/S775A巨噬细胞的杀菌活性。PfklS775A/S775A巨噬细胞比 WT 细胞具有更强的杀菌能力，这与 ROS 生成的增加是一致的。为了确定PfklS775A/S775A巨噬细胞中 ROS 水平的升高是否与 NADPH 生成的增加有关，作者评估了特定条件下的 NADPH/NADP+比率。作者的结果表明，与静息细胞相比，zymosan 处理会导致 WT 和PfklS775A/S775A巨噬细胞中该比率的降低，这表明 zymosan 激活了 NADPH 氧化酶。与 WT 巨噬细胞相比，在PfklS775A/S775A巨噬细胞中观察到的降幅稍大。使用 DPI（一种强效 NADPH 氧化酶抑制剂）进行预处理可减轻紫檀素处理后的 NADPH 消耗，从而导致与未预处理细胞相比的比率升高。这一比率在PfklS775A/S775A巨噬细胞中的增加幅度略大。总之，作者的数据表明，PfklS775A/S775A巨噬细胞产生的 ROS 水平升高。然而，由于 WT 和PfklS775A/S775A巨噬细胞中 NADPH/NADP+比率的变化很小，作者得出结论，在PfklS775A/S775A巨噬细胞中，除了通过 PPP 的通量增加外，还有其他机制导致 ROS 生成增加。
实验结果7
LPS 诱导的 HIF1α 和 IL-1β 生成需要 PFKL Ser775 磷酸化
研究表明，糖酵解可促进巨噬细胞的促炎功能。其发生机制之一是糖酵解诱导的 HIF1α 稳定，它是 IL-1β 合成所必需的，但不是其他促炎细胞因子。与 HIF1α 在糖酵解过程中稳定的观点一致，免疫印迹分析表明，与PfklS775A/S775AmBMDM 相比，WT mBMDM 在 LPS 处理下的 HIF1α 水平明显更高（图6a）。通过研究Il1b、Tnf和Il6 的表达，作者进一步发现PfklS775A/S775AmBMDMs 的Il1b表达明显下降（图6b），而Tnf和Il6的表达保持不变。这些数据在蛋白质水平上也得到了证实，原-IL-1β水平明显降低（图6c），而 TNF 和 IL-6 的分泌量在两组之间相同。此外，作者还研究了Nos2 的表达，Nos2 是另一个表征良好的 HIF1α 靶基因，作者观察到在 LPS 刺激 24 小时后，与 WT mBMDM 相比，PfklS775A/S775A中Nos2 的 mRNA 水平显著降低（图6d）。有研究表明，糖酵解可抑制 HIF1α 的 PHD 依赖性羟基化，导致其降解，从而稳定 HIF1α32 。为了证实在 LPS 刺激的 WT 和PfklS775A/S775AmBMDM 之间观察到的 HIF1α 水平差异是由于 PHD 活性不同所致，用辛基-α-酮戊二酸（辛基-α-KG）对细胞进行预处理，辛基-α-KG 可在细胞内转化为 α-KG，从而克服琥珀酸等内源性代谢产物对 PHD 的抑制作用。不出所料，与在PfklS775A/S775A细胞中观察到的结果相比，活化的 WT 细胞需要更多的辛基-α-KG 来降低 HIF1α 和 pro-IL-1β 的水平（图6e），这表明 WT 细胞中糖酵解代谢对 PHD 的抑制活性更高。为了探索相反的情况，作者使用了 PHD 抑制剂 DMOG 来稳定 HIF1α。用 DMOG 预处理后，HIF1α 的顶部条带增加，而底部条带消失，这表明较低的条带确实是 HIF1α 的降解产物（图6e）。当施加相同量的 DMOG 时，WT 细胞对 LPS 的反应产生了更多的 HIF1α （图6e），这与糖酵解代谢和 DMOG 共同稳定 HIF1α 的观点一致。总之，这些研究结果表明，PFKL Ser775 磷酸化在稳定 HIF1α 并进而调控促炎基因（特别是Il1b和Nos2）表达方面起着关键作用。此外，这种活性可能是通过依赖糖酵解的 HIF1α 稳定来介导的。
