Chestnut Studying
摘要
With the increasing prevalence of antimicrobial-resistant bacterial infections, there is interest in using bacteriophages (phages) to treat such infections. However, the factors that govern bacteriophage pharmacokinetics in vivo remain poorly understood. Here, we have examined the contribution of neutrophils, the most abundant phagocytes in the body, to the pharmacokinetics of i.v. administered bacteriophage in uninfected mice. A single dose of LPS-5, a bacteriophage recently used in human clinical trials to treat drug-resistant Pseudomonas aeruginosa, was administered i.v. to both immunocompetent BALB/c and neutropenic CD1 mice. Phage concentrations were assessed in peripheral blood and spleen at 0.25, 1, 2, 4, 8, 12, and 24 hours after administration by plaque assay and qPCR. We observed that the phage clearance was only minimally affected by neutropenia. Indeed, the half-lives of phages in blood in BALB/c and CD1 mice were 3.45 and 3.66 hours, respectively. These data suggest that neutrophil-mediated phagocytosis is not a major determinant of phage clearance. Conversely, we observed a substantial discrepancy in circulating phage levels over time when measured by qPCR versus plaque assay, suggesting that significant inactivation of circulating phages occurs over time. These data indicate that alternative factors, but not neutrophils, inactivate i.v. administered phages.
随着耐抗菌细菌感染的日益流行，人们对使用噬菌体（噬菌体）治疗此类感染产生了兴趣。然而，人们对影响噬菌体体内药代动力学的因素仍然知之甚少。在这里，我们研究了嗜中性粒细胞（人体内数量最多的吞噬细胞）对未感染小鼠静脉注射噬菌体药代动力学的影响。给免疫功能正常的 BALB/c 小鼠和中性粒细胞增多的 CD1 小鼠静脉注射单剂量的 LPS-5，这是一种最近在人类临床试验中用于治疗耐药铜绿假单胞菌的噬菌体。在给药后 0.25、1、2、4、8、12 和 24 小时，通过斑块检测和 qPCR 评估外周血和脾脏中的噬菌体浓度。我们观察到，噬菌体清除率受中性粒细胞减少症的影响很小。事实上，噬菌体在 BALB/c 和 CD1 小鼠血液中的半衰期分别为 3.45 和 3.66 小时。这些数据表明，中性粒细胞介导的吞噬作用并不是噬菌体清除的主要决定因素。相反，我们观察到通过 qPCR 与斑块检测法测量的循环噬菌体水平随着时间的推移存在很大差异，这表明循环噬菌体会随着时间的推移发生显著失活。这些数据表明，替代因子而非中性粒细胞会使静脉注射的噬菌体失活。
实验结果1
LPS-5 是一种尾部噬菌体，用于治疗耐药性感染
校准研究，以评估作者评估噬菌体浓度的能力。作者选择研究噬菌体 LPS-5，它是一种抗假单胞菌噬菌体，最近被纳入噬菌体疗法人体临床试验，即耶鲁大学的囊性纤维化细菌噬菌体研究（CYPHY；ClinicalTrials.gov NCT04684641）。LPS-5 是Pakpunavirus家族的成员，利用假性 LPS 进行病毒进入。图 1 显示了 LPS-5 的代表性透射电子显微镜照片，以及在铜绿假单胞菌PAO1 的草坪上显示 LPS-5 斑块形态的图像。
实验结果2
血液和脾脏中噬菌体滴定的校准曲线
作者首先试图评估斑块检测法和定量 PCR (qPCR) 的线性、准确性和精确性，以测量免疫功能正常的 BALB/c 小鼠和中性粒细胞 CD1 小鼠血清和组织中的噬菌体浓度范围。将已知量的 LPS-5（10 3、10 4、10 5、10 6、10 7、10 8PFU/样本）添加到 PBS（生理盐水）、全外周血或切除的脾脏组织中。加入噬菌体后，将脾组织匀浆。然后通过斑块检测法（图 2，A-C 和 G-I）或 qPCR（图 2，D-F 和 J-L）进行分析。
在 qPCR 研究中，BALB/c 样本脾脏的中位准确率为 101%（范围为 90%-115%），血液的中位准确率为 93%（范围为 88%-94%），脾脏的不确定性为 6.4%，血液的不确定性为 0.7%。CD1样本的准确度中位数为：脾脏88%（范围：85%-91%），血液100%（范围：100%-102%），不确定性为：脾脏2.7%，血液0.8%。检测限被确定为 200 PFU/样品。合格下限 (LLOQ) 被确定为 1,000 PFU/样品。这些数据有力地证明了这些方法具有极佳的线性和可重复性。
免疫功能正常的 BALB/c 小鼠体内噬菌体 LPS-5 的 PK。在建立了评估小鼠组织中噬菌体水平的方法后，作者接下来试图确定噬菌体 LPS-5 在免疫功能正常小鼠体内的 PK。在这些研究中，作者使用了 BALB/c 小鼠，这是药理学研究中常用的一种成熟的小鼠品系。
实验结果3
生物分布和药代动力学实验示意图
利用这些动物，作者采用图 3 所示的方法检测了噬菌体的 PK。以单次剂量（0.1 mL/只小鼠，浓度为 1.0 ×10 11PFU/mL）尾静脉注射 LPS-5 噬菌体给 BALB/c 小鼠。动物分别在 0.25 小时、1 小时、2 小时、4 小时、8 小时、12 小时和 24 小时后被处死。使用斑块检测法和 qPCR 测量全血和脾脏匀浆中的噬菌体浓度（图 4，B 和 D）。绘制了随时间变化的浓度曲线，并进行了非室分析。
实验结果4
噬菌体 LPS-5 在 BALB/c（免疫功能健全）和 CD1（中性粒细胞减少）小鼠血液和脾脏组织中的药代动力学和生物分布
图 4A 显示了传统 BALB/c 小鼠静脉注射活性 LPS-5 后的斑块检测浓度-时间曲线。BALB/c 小鼠血液中活性噬菌体的最大浓度为 8.55 ×10 5PFU/mL，约为注射剂量的 0.01%，表明血液中噬菌体的清除速度极快（图 4B）。循环中的活性噬菌体呈现一阶消除，最终t1/2为 3.24 小时。24 小时后，血液中仍有极低浓度的活性噬菌体（C24= 539 PFU/mL）。活性噬菌体在脾脏组织中迅速达到高浓度（Cmax= 2.44 ×10 8PFU/g），并在 24 小时测量期间保持相对较高的浓度（C24= 4.91 ×10 6PFU/g）（图 4C）。
这些数据共同表明，噬菌体在给药后会迅速离开血液循环，并在包括脾脏在内的滤过器官中蓄积。这些数据表明，噬菌体是通过单核吞噬细胞系统从血液中清除的。
噬菌体 LPS-5 在中性粒细胞缺陷小鼠体内的 PK。作者随后探索了中性粒细胞减少对噬菌体 PK 和脾脏摄取的影响。在这些研究中，作者使用了成熟的 CD1 中性粒细胞小鼠模型。
同样，LPS-5噬菌体以单次剂量（0.1 mL/只小鼠，浓度为 1.0 ×10 11PFU/mL）尾静脉注射给 CD1 小鼠。然后在不同的时间点处死动物，并测定全血和脾脏匀浆中的噬菌体浓度。
总的来说，作者观察到 CD1 小鼠与 BALB/c 小鼠的 PK 曲线非常相似（图 4，E-H）。CD1 小鼠血液中噬菌体的Cmax为 3.75 ×10 6PFU/mL，约为注射剂量的 0.05%，再次表明清除速度极快。C24很低，为249 PFU/mL。与 BALB/c 小鼠一样，作者再次观察到 CD1 小鼠血液中活性噬菌体颗粒的一阶清除，血液中的t1/2为 3.94 小时（图 4C）。在测量的持续时间内，脾脏组织中活性病毒颗粒的浓度下降了约 1 个对数，脾脏中的Cmax为 4.05 ×10 8PFU/g，C24为 4.33 ×10 7PFU/g（图 4D）。
与 BALB/c 小鼠一样，这些数据表明，在中性粒细胞减少的 CD1 小鼠中，LPS-5 噬菌体在给药后会迅速离开血液循环，并在脾脏等其他部位蓄积。
在比较嗜中性粒细胞 CD1 小鼠和传统 BALB/c 小鼠的数值时，作者注意到这些品系的Cmax、C24 和t1/2值相似（图 4，E-H）。例如，BALB/c 和 CD1 小鼠血液中噬菌体的t1/2分别为 3.24 小时和 3.94 小时。在中性粒细胞减少的小鼠血液和脾脏组织中，从给药时间推算到无穷大的 AUC（AUCinf）相对略微增加了 3 到 4 倍，但两组动物的总体 PK 相似。这些数据表明，中性粒细胞介导的吞噬作用并不是噬菌体清除的主要决定因素。
噬菌体在循环中失活。作者的数据显示，用 qPCR 与斑块检测法测量血液中的噬菌体数量时，噬菌体数量随时间的变化存在很大差异，尤其是在较晚的时间点。用 qPCR 测定的 BALB/c 小鼠血液中的C24为 1.89 ×10 4PFU/mL，而用斑块检测法测得的 C24 为 539 PFU/mL。两者相差约 35 倍。在 CD1 小鼠中，qPCR 测得的C24为 2,160 PFU/mL，而斑块检测法测得的为 249 PFU/mL。
这些数据表明，与功能性噬菌体和噬菌体片段的数量（通过 qPCR 测定）相比，循环中的因素会减少功能性噬菌体的数量（通过斑块检测法测得）。噬菌体在脾脏中保持活性的时间比在血液中长。斑块检测法测得的 BALB/c 小鼠脾脏中的AUC24为 1.01 ×10 9PFU/g，而血液中为 1.05 ×10 6PFU/mL。在中性粒细胞减少的 CD1 小鼠中也观察到了类似的结果。噬菌体在脾脏中保持活性的时间比在血液中长，这表明血液中的可溶性因子会使噬菌体颗粒失活。此外，作者还可以得出这样的结论：噬菌体在脾脏组织中保持活性的时间长于在血液中保持活性的时间。
