预印版丨组织微环境对炎症反应的控制

酸性 pH 可调节基因特异性炎症反应

    在小鼠急性炎症模型中，向野生型小鼠（WT）腹腔内注射亚致死剂量的 LPS 会引发 TLR4 依赖性全身炎症反应。因此，注射后 6 小时血液 pH 值显著下降（图 1B）。24 小时后，肝脏、小肠、肾脏、脑干、下丘脑和大脑皮层等多个组织出现严重酸中毒（pH 值小于 6.5），强调了酸性 pH 值与急性炎症反应之间的联系。在体外，WT 骨髓衍生巨噬细胞（BMDMs）在 LPS 刺激 24 小时后将细胞外环境酸化至 pH 6.5（图 1C），此时存在生理水平的缓冲系统（23.8 mM 碳酸氢盐）。值得注意的是，这种 pH 值不会对 BMDMs 的存活率产生不利影响，也不会阻碍 LPS 暴露引发的 TLR4 内化。因此，作者在 pH 6.5 的条件下调节 BMDMs，以进一步研究酸性条件对巨噬细胞炎症反应的影响。

    巨噬细胞对 LPS 刺激的转录反应受 TLR4 信号通路、表观遗传机制以及反馈和前馈遗传回路的调控。在对 LPS 的反应中，转录诱导基因可分为一级反应基因（PRGs）和二级反应基因（SRGs），这取决于后者对新合成蛋白质的依赖程度。PRGs 可根据激活动力学进一步细分为早期反应组和晚期反应组。为了评估对炎症反应的总体影响，作者分析了 LPS 暴露后 4 小时早期 PRGs（Cxcl1、Il1b、Nfkbia、Tnf、Tnfsf9）、晚期 PRGs（Ifnb1）和次级反应基因（Ifit1、Il6、Il12b、Saa3）的表达情况。作者发现，在 pH 6.5 条件下调节 BMDMs 会对炎症基因产生特异性影响，这种影响与 PRGs 和 SRGs 的分类无关（图 1D）。Cxcl1、Ifit1、Nfkiba、Tnf 和 Vcam1 的转录对 pH 值相对不敏感，而 Edn1、Il1b、Il6、Il12b 和 Saa3 则在 pH 值为 6.5 时受到显著抑制。值得注意的是，Ifnb1、Tnfsf9、Adm 和 Il23a 的诱导作用大大增强，在 pH 值为 6.5 时平均增强 20 倍。不同的实验条件，包括 LPS 浓度（10 至 1000 毫微克/毫升）和 pH 值调节持续时间（4 至 12 小时），都显示了酸性 pH 值对基因特异性调控的类似模式。此外，基因表达的时程分析显示，pH 调节基因之间存在类似开关的模式（图 1E）。值得注意的是，分别编码内皮素-1 和肾上腺髓质素的 Edn1 和 Adm 在 pH 值为 7.4 和 6.5 时表现出不同的激活作用。这两种肽分别通过血管收缩和血管扩张对血管产生拮抗作用。基因对酸性环境的特异性敏感性和对立生理功能的调节表明，巨噬细胞可能会根据环境线索协调出一种质地不同的炎症反应，而不仅仅是调整免疫激活的程度。

已知的 pH 传感器无法解释 pH 依赖性炎症反应

    在已知的 pH 传感器中，Gpr65、Gpr68、Hif1a 和 Hif2a 在 BMDMs 和组织常驻巨噬细胞中大量表达（图 1F）。作者在体外研究了 Gpr65-/- 、Gpr68-/- 、Hif1a flox/flox lyz2 Cre 和 Hif2a flox/flox lyz2 Cre 小鼠分化的 BMDMs 中 pH 依赖性炎症反应。然而，作者的研究结果表明，无论是 Gpr65、Gpr68、Hif1a 还是 Hif2a 对于观察到的基因特异性 pH 依赖性调控都不是必需的（图 1G-I）。在 pH 值为 6.5 时，GPR65 和 GPR68 都能激活环磷酸腺苷（cAMP）的产生。为了排除受体冗余的可能性，作者用 100 μM 二丁酰-cAMP（一种细胞渗透性 cAMP 类似物）处理 BMDMs，观察到其对 pH 依赖性基因表达无明显影响。这些发现表明，所观察到的反应与既定的 pH 感知机制无关。尽管酸性 pH 值可能广泛影响生化反应和蛋白质相互作用，但 pH 值为 6.5 时基因的特异性激活和抑制意味着转录不太可能受到普遍干扰。为了进一步验证这一点，作者用喜树碱处理 BMDMs，喜树碱是一种 DNA 拓扑异构酶抑制剂，可通过抑制 Pol II 广泛抑制巨噬细胞的炎症反应。喜树碱抑制了 pH 不敏感基因和 pH 敏感基因的激活。因此，作者推测一种新的特异性 pH 感知机制控制着炎症基因的表达。

解卷积模型揭示了 pH 值依赖性炎症程序

    作者比较了 pH 7.4、pH 7.4 LPS 4 h、pH 6.5 和 pH 6.5 LPS 4 h 时 BMDMs 的大量 RNA-seq（图 2A），以全面描述 pH 依赖性和 pH 非依赖性炎症反应的特征。应用严格的阈值（折叠变化 > 3 和 q 值 < 0.05），作者确定了 522 个基因在 pH 值为 7.4 时被唯一诱导，85 个基因在 pH 值为 6.5 时被唯一诱导，突显了酸性 pH 对基因特异性炎症反应的影响。然而，在 pH 7.4 和 pH 6.5 条件下共同诱导的 308 个基因中，许多基因的激活和表达在数量上存在差异。为了定量了解酸性 pH 如何调控炎症反应，作者采用了一种线性去卷积模型，该模型最初是为剖析转录因子之间的调控相互作用而开发的。该模型认为，两种信号（如 LPS 刺激和酸性 pH）可通过三种可能的逻辑控制基因表达：独立于 pH 的 LPS 调节（LPS）、独立于 LPS 的 pH 调节（pH）以及依赖于 LPS 和 pH 之间协同或拮抗作用的调节（INT）（图 2B）。这三种调控的总和（称为 “表达成分”）等于观察到的基因表达差异。应用线性去卷积模型可同时整合所有四种实验条件，以评估 LPS、pH 值及其相互作用如何促进各基因的表达。表达分量接近 0 表示缺乏调控，而正值或负值则表示激活或抑制，或者 LPS 和酸性 pH 起协同或拮抗作用。

    总体而言，超过 92% 受 pH 或 LPS 显著调控的基因都能很好地通过 3 组分线性模型捕获（R 2 > 0.9）（图 2C）。作者确定了 1620 个至少有一个显著表达成分（p<0.05，无效假设成分>2 倍）的基因，并将其分为 20 个群组，每个群组至少包含 5 个基因（图 2D）。在受 LPS 和 pH 独立调控的基因中，第 1-4 组代表酸性 pH 或 LPS 的独立激活或抑制，而第 5-8 组则代表这些独立调控的组合。例如，第 3 组包括 Nfkbib、Nfkbid 和 Nfkbie，第 5 组包括 Nfkbia 和 Nkfbiz。它们受 LPS 诱导，与 pH 值无关，但在 pH 值依赖性基础表达方面存在差异，它们都属于 NF-kb 信号通路。第 9-14 组包括受 pH 和 LPS 拮抗调节的基因，包括炎症细胞因子（Il6、Il12a、Il12b、Il18）、趋化因子（Ccl5、Ccl8、Ccl12、Cxcl9、Cxcl10、Cxcl11）、急性期蛋白（Oas1、Oas2、Oas3、Saa3）和炎症效应因子（Edn1、Nos2）。最后，第 15-18 组包括受 LPS 和酸性 pH 协同调控的基因，如 Adm、Ifnb1、Tnfsf9、Il23a 和 Adora2b。为了研究富集在 pH 依赖性和独立反应中的潜在免疫功能，作者将这 20 个基因簇根据其相互作用成分合并为 pH 不敏感、pH 拮抗或 pH 协同组。大约 40% 的 LPS 调节基因对 pH 不敏感。在 pH 值调节基因中，LPS 诱导反应和 LPS 抑制反应中的拮抗作用占主导地位（分别为 88% 和 86%）。由于 LPS 诱导的转录程序是先天性炎症反应的模型系统，因此作者重点研究了三组 LPS 诱导的基因：pH 不敏感基因（pHIN）、pH 抑制基因（pHANTI）和 pH 协同基因（pHSYN）。pH IN 基因在 TLR 信号转导、T 细胞活化、整合素相互作用中独特地富集，并在先天性免疫反应和抗微生物防御中表现出最强的富集（图 2E）。大多数 LPS 诱导的整合素和 NF-kb 调节因子受 LPS 调节，与 pH 值无关（图 2F）。相反，pH ANTI 基因在 MHC I 呈递、IL-1 信号转导、趋化作用中得到了独特的富集，并在细胞因子受体相互作用、抗病毒和适应性免疫反应中表现出最强的富集（图 2E）。酸性 pH 强力抑制了大多数抗原递呈基因和细胞因子的激活（图 2F）。有趣的是，pHSYN 基因虽然数量最少，但却富集于血管形态发生和 T 细胞分化中（图 2E）。这些分析表明，先天防御程序的激活对 pH 值不敏感，而免疫系统其他分支的协调和招募则取决于组织微环境。

    TLR4 诱导的基因受两种信号适配体 MyD88 和 TRIF 的调控（图 2G）。Myd88 会招募 IL-1 受体相关激酶（IRAKs）和 TRAF6，启动转录激活因子 NF-kB。相反，TRIF 促进 TRAF3 依赖性激活 TBK1，TBK1 使转录因子 IRF3 磷酸化，从而调节干扰素 beta 和其他干扰素诱导的基因。作者发现，p65（NF-kB）的共识结合主题在 pH IN 和 pHANTI 基因中都有富集，而 IRF3 主题只在 pH ANTI 基因中富集（图 2G）。然而，在 BMDMs 中，LPS 诱导的 NF-kB 抑制调节因子 Ikba 降解、IRF3 磷酸化以及通过 STAT1 磷酸化的 I 型干扰素自分泌信号传导在 pH 7.4 和 pH 6.5 之间均显示出相似的动力学（图 2H）。此外，p65 和 IRF3 的核定位在两种 pH 水平下都是相似的（图 2I）。这些发现表明，对 pH 值敏感的基因和对 pH 值不敏感的基因在转录水平而不是信号转导水平上受到不同的调控。

pH 值在染色质水平上调节基因表达

    与 NF-κB 相比，IRF3 的激活动力学有所延迟（图 2H）。观察到的 IRF3 主题富集表明pHIN和pHANTI基因的激活动力学可能存在差异。在 pH 7.4 条件下，作者发现pHIN基因在 LPS 刺激后 2 小时内达到完全活化，而pHANTI基因的诱导作用很小，仅在 4 小时达到峰值（图 3A）。有趣的是，pHSYN基因表现出了最快速和短暂的激活（图 3A）。LPS 抑制的基因也表现出类似的 pH 依赖性动力学。因此，酸性 pH 可能是pHANTI基因激活所需的一个时间限制步骤。LPS 诱导的 SRGs 通常由于需要新的蛋白质合成而延迟激活49，与 PRGs 相比，作者的数据发现 SRGs 具有很强的 pH 依赖性。然而，用环己亚胺（CHX）阻断 BMDMs 中蛋白质的合成对pHANTI基因的影响程度与酸性 pH 的影响程度不同（图 3B）。另一方面，阻断蛋白质合成几乎完全复制了pHSYN基因的激活（图 3B），这表明酸性 pH 可能抑制了诱导的转录抑制因子，从而促进了pHSYN基因的激活。

    激活动力学延迟的第二种可能涉及染色质重塑。鉴于酸性 pH 与细胞系中组蛋白乙酰化和新陈代谢的调节有关，作者进行了 ATAC-seq 和 ChIP-seq 研究，以检测与转录激活相关的染色质可及性和组蛋白修饰（H3K27Ac 和 H3K4me3）。作者首先确定了在两个生物重复中被 LPS 显著诱导（> 4 倍，pH 7.4 LPS 与 pH 7.4 的比较）或在 pH 7.4 时保持稳定（< 2 倍）的 ATAC-seq 峰。在诱导峰，作者观察到 LPS 在 pH 7.4 和 6.5 诱导的 ATAC-seq、H3K27ac 和 H3K4me3 有类似的增加，而平衡峰在所有检查条件下保持不变。有趣的是，ATAC-seq 信号在 pH 值为 6.5 时轻微升高，这表明酸性 pH 并不限制染色质的可及性。全局 H3K27Ac 和 K3K4me3 信号的一致水平也与酸性 pH 对基因的特异性控制一致。接下来，作者分析了pHIN、pHANTI和pHSYN基因特有的染色质变化（图 3C）。与基因组图谱类似，所有三个基因组在 pH 6.5 时 TSS 处的 ATAC-seq 信号都升高了，并且在 pH 7.4 和 6.5 时 LPS 后也显示出类似的升高。作者观察到 H3K27Ac 没有一致的差异，但在 pH 值为 6.5 的pHANTI基因中，LPS 诱导的 H3K4me3 增加有选择性地减少，特别是在紧靠 TSS 下游的基因体内（图 3C、D），这与转录活性降低一致。耐人寻味的是，pHANTI基因在基线时表现出较低的 H3K27Ac 和 H3K4me3 信号，尽管基线表达水平和染色质可及性相似。总之，全局组蛋白修饰缺乏 pH 依赖性差异以及染色质可及性和 TSS 处 H3K27Ac 变化的可比调控都表明，酸性 pH 可能会影响远端调控元件控制基因激活的活性。

    要在巨噬细胞的全基因组范围内确定特定增强子与基因之间的关联具有挑战性。因此，作者转而研究 pH 依赖性基因和独立基因的例子。在Il6和Edn1基因位点，基因诱导与跨越数十万个碱基对的多个远端增强子的激活相关--在LPS刺激4小时后，ATAC-seq和pH值为7.4的H3K27Ac峰值增大（图3E）。值得注意的是，这些增强子上的 H3K27Ac 信号在 pH 值为 6.5 时完全消失，同时染色质可及性以及 p65 和 IRF3 的 ChIP-seq 结合也减少了。与pHANTI基因的例子不同，pHIN基因Nfkbia在不同pH条件下显示出一致的表观遗传标记，pHSYN基因Ifnb1在基因TSS处显示出升高的H3K27Ac和H3K4me3，以及在-15kb增强子处增强的IRF3结合（图3E），这证明酸性pH可能会全面阻碍组蛋白修饰或表观遗传重塑。为进一步探究这一问题，作者用 C646 抑制了组蛋白乙酰转移酶（HAT）p300，用泛抑制剂 TSA 抑制了组蛋白去乙酰化酶（HDAC）。总体而言，抑制 HAT 的效果不如抑制 HDAC 的效果深远，但两者都不同于酸性 pH 的影响。TSA 强烈抑制了pHIN和pHSYN基因，而pHANTI基因的激活需要 HAT 和 HDAC 的活性。因此，结合表观遗传学分析和药理学扰动，作者的数据表明了一种对 pH 值敏感的表观遗传学机制，该机制专门影响依赖于增强子激活的炎症基因的激活。因此，TLR 信号立即诱导的基因对 pH 值差异不敏感，而依赖于 NF-κB、IRF3 和远端增强子激活的基因则受组织微环境的调控。一种属于pHANTI组的推定转录诱导抑制因子可能是在 pH 值为 7.4 时使Ifnb1、Adm和其他pHSYN基因失活所必需的；而在 pH 值为 6.5 时，该抑制因子的缺失会导致这些基因的激活时间延长并增强（图 3F）。

BRD4的转录凝聚物对酸性pH值很敏感

    最近的研究表明，芽殖酵母 SNF5（SWI/SNF 染色质重塑复合物的核心成分）对细胞内 pH 值（pHi）很敏感。芽殖酵母SNF5 紊乱环上的两个组氨酸残基在 pH 值为 6.5 时发生质子化，这种质子化破坏了 SNF5 与核小体和转录因子的静电相互作用。在其生化特性的指导下，作者进行了生物信息学筛选，以确定可介导 pH 依赖性转录反应的哺乳动物蛋白。作者的筛选基于三个假设：1）pH 敏感蛋白必须在 pH 值 7.4 和 6.5 之间具有显著的质子化差异（Δ电荷）；2）任何具有显著Δ电荷的肽区都应位于非极性残基或无序区附近，且事先的结构限制最小；3）肽区富含脯氨酸（P）和谷氨酸（Q），类似于酵母 SNF5 中的无序环。作者首先扫描了小鼠基因组（UniProt）中 50,961 个已注释的蛋白质序列，以确定感兴趣的蛋白质区域（20 个氨基酸段中组氨酸残基大于 1 个）。然后，作者根据 IDR 共识得分61对其进行筛选，重点关注Δ电荷、PQ 富集和在 BMDMs 中的表达（图 4A）。BRD4是一种含溴结构域的蛋白质，以识别乙酰化组蛋白和调控发育与炎症过程中的重要转录程序而闻名46，被确定为最重要的候选蛋白。它有两个富含组氨酸、脯氨酸和谷氨酸（HPQ）的区域（图 4B）：AA 721-800，由 6 个连续组氨酸组成，毗邻一个含有 90% 聚 PQ 的 40 个残基非极性区域；AA 1001-1080，含有 9 个组氨酸和 39 个 PQ。这些区域的净电荷极少，位于 C 端 BRD4-IDR 内。含 IDR 的全长 BRD4 是 BMDMs 中表达量最高的同工酶。

    作者使用 pH 值敏感的荧光染料SNARF发现，在 pH 值为 6.5 的培养基中，BMDMs 细胞内的 pH 值降至 pH 6.6（图 4B），从而使 BRD4 暴露于酸性细胞内环境。由于 BRD4 通过其疏水的 IDR 形成转录凝聚物，作者假设组氨酸残基的 pH 依赖性质子化可能会破坏 BRD4-IDR 的疏水相互作用，而这种相互作用对凝聚物的形成至关重要。在 pH 值为 7.4 时，内源性 BRD4 在 BMDMs 中形成小而明显的病灶，而在 pH 值为 6.5 时，这些病灶大大减少（图 4C、D）。10%的1,6-己二醇（已知会破坏转录凝聚体）处理BRD4病灶的效果与酸性pH类似。在 pH 值为 6.5 时，BRD4 mRNA 和蛋白质的表达都保持稳定，这表明受 pH 值调节的是凝聚体而不是 BRD4 的表达。为了辨别信号传导和胞质内容物的潜在作用，作者在轻轻裂解质膜后分离了 BMDM 细胞核，并将其在 pH 值为 7.4 或 6.5 的条件下培养 0.5 小时，然后固定并成像。作者观察到了明显的 BRD4 病灶，尽管在分离的细胞核中数量少于活细胞（图 4F）。尽管存在形态上的差异，但作者发现在酸性pH条件下，BRD4病灶明显减少（图4G），这证明了核内在调节pH依赖性BRD4凝聚体的作用。

    为了进一步研究BRD4凝聚体的动态变化，作者生成了表达小鼠mCherry-BRD4融合蛋白（293TBRD4）的稳定293T细胞系，用于活细胞成像。起初，作者注意到 mCherry-BRD4 的反应不一致，这可能是由于细胞间 pH 缓冲能力的差异造成的。用质子离子诱导剂 2-4-二硝基酚（2,4-DNP）处理 293T 细胞可平衡细胞外和细胞内的 pH 值，大大降低了 BRD4 凝聚物的异质性。为了监测动态变化，作者用 2,4-DNP 在 pH 值为 7.4 的条件下处理293TBRD4细胞 30 分钟，然后突然将培养基切换到 pH 值为 6.5 的条件下。值得注意的是，BRD4 凝聚物在 10-12 分钟内大部分溶解，回到 pH 7.4 后，BRD4 凝聚物再次出现并在 1 小时内恢复（图 4H）。与此相反，仅表达 mCherry 的细胞显示出恒定的荧光信号，不受 pH 值变化的影响，这与之前关于荧光蛋白 pH 值敏感性的研究结果一致。

对 BRD4 功能的干扰在很大程度上重现了 pH 依赖性反应

    鉴于 BRD4 冷凝物的 pH 依赖性变化是可逆的，作者研究了 pH 正常化后对炎症反应的影响是否可以逆转。在 pH 值为 6.5 的条件下培养过夜后，BRD4 冷凝物明显减少，在 pH 值为 7.4 的条件下培养 4 小时后，BRD4 冷凝物完全恢复（图 5A、B）。随着 BRD4 冷凝物的变化，pH 值被抑制的基因在 pH 值为 7.4 的条件下几乎完全恢复了激活（图 5C）。为了检测 pH 依赖性基因是否受 BRD4 调控，作者分析了Brd4-/-BMDMs 对 LPS 的转录反应。作者应用去卷积模型识别了 LPS 诱导的依赖 BRD4 和独立 BRD4 的基因，发现依赖 BRD4 的基因在酸性条件下受到更多抑制（图 5D）。同样，以 BRD4 的溴域为靶点的竞争性抑制剂（JQ-1、iBET 和 MS-645），或用 1% 的 1,6-HD 破坏凝集物，都会持续抑制pHANTI基因（图 5E）。因此，pH 依赖性炎症调控在功能上与 BRD4 缩聚物有关。

    组氨酸是 pH 值 7.4 和 6.5 之间Δ电荷的主要来源。作者发现，BRD4-IDR独特地富含组氨酸（图 5F），而全长BRD4和小鼠蛋白质组的IDR都缺乏组氨酸富集。此外，通过生物信息学筛选发现的两个 HPQ 区域在脊椎动物中是保守的（图 5G）。为了研究组氨酸残基上的质子化是否直接导致了 pH 依赖性冷凝物，作者合成了一个BRD4HA突变体，将 BRD4-IDR 中的 21 个组氨酸换成了丙氨酸，以消除大部分 pH 依赖性Δ电荷。作者生成了表达小鼠mCherry-BRD4WT或mCherry-BRD4HA的稳定 293T 细胞系，由于序列高度同源性，这两种小鼠 BRD4 变体在人类 293T 细胞中都出现了凝聚物。为了尽量减少内源性人类 BRD4 的影响，作者在 siRNA 敲除 hBRD4 后 24 小时进行了活细胞成像。在这些实验中，作者观察到mBRD4WT凝聚体（36 个细胞）的数量在 pH 值为 6.5 时的 2-5 分钟内开始减少，到 30 分钟时稳定在原始数量的 25%。与此相反，用丙氨酸取代mBRD4HA中的组氨酸完全消除了 pH 依赖性变化（45 个细胞）（图 5H）。这些数据有力地支持了BRD4通过其富含组氨酸的IDR直接感知细胞内pH值，从而动态调节转录凝聚物以控制基因表达。

基因特异性机制是 pH 依赖性调控的基础

    BRD4与pH敏感基因和pH不敏感基因结合并调控它们（图5E）。那么，依赖于 pH 值的 BRD4 凝聚物如何能特异性地影响炎症基因的子集呢？鉴于 pH 敏感基因增强子的明显变化，作者推测 pH 依赖性凝聚物可促进增强子的重塑和激活，从而控制严重依赖于这些过程的基因激活。

    首先，将增强子激活连接到基因启动子需要介质。BRD4 和 MED1 都会形成液-液相凝集物，并共同定位在不同的核病灶，以招募 RNA 聚合酶 II。然而，在 pH 值为 6.5 时，尽管 MED1 缺乏 HPQ 富集的 IDR，但这些凝聚体却大大减少了。值得注意的是，BRD4 和 MED1 的剩余点状物在空间上是分割的，这与 pH 7.4 时的强共聚焦形成了鲜明对比（图 6A、B）。这些 pH 依赖性变化也与 1,6-HD 对凝集物的化学破坏相一致（图 6A、B）。由于在 pH 敏感基因上观察到了 H3K27Ac 的减少，因此作者测试了组蛋白乙酰化的干扰结合是否会导致 BRD4 凝集物的类似扰动。令人惊讶的是，BRD4 和 MED1 冷凝物受到 JQ1、iBET 和 MS645 的不同影响，尽管它们都抑制了 LPS 诱导的炎症程序（图 5E）。酸性 pH 和 BRD4 抑制剂之间截然不同的表型也意味着染色质招募的改变并不是转录凝聚体 pH 依赖性溶解的原因。全局组蛋白乙酰化水平相当、BRD4 与看家基因的结合水平相当，以及之前的研究结果表明组蛋白乙酰化的依赖性可能因细胞类型而异，都证实了这一点。

    其次，增强子激活通常需要染色质重塑。含溴结构域蛋白 9（BRD9）是非经典 SWI/SNF 染色质重塑复合体（ncBAF）的一个亚基，它与 BRD4 共同定位在富含 NF-κB 和 IRF3 结合主题的干扰素刺激次级反应基因的增强子和启动子上。用 JQ1 抑制 BRD4 可在 BMDMs 和胚胎干细胞中置换 BRD9，而在体外并不直接抑制 BRD9。作者推测，在酸性 pH 条件下，BRD4 凝聚物的破坏会导致 BRD9 在调控 pH 敏感基因方面的招募缺陷。事实上，与pHIN基因相比，在特异性 BRD9 抑制剂（BRD9i）或 BRD9 降解剂（dBRD9）存在的情况下，pHANTI基因的激活明显降低（图6C）。在 BET 家族蛋白中，只有 BRD4 含有 HPQ 区域，这表明 pH 依赖性 BRD9 的招募可能是通过 BRD4 介导的。因此，作者表达了FLAG-IDRBRD4-mCherry 来检测 BRD9 的招募是否受 pH 影响。作者观察到FLAG-IDRBRD4-mCherry 与 BRD4 凝聚物整合。通过共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP），作者发现在 pH 值为 6.5 时，BRD9 与 BRD4 的共轭作用大大降低（图 6D）。结合 pH 敏感基因远端增强子的不同调控（图 3E），这些数据表明，依赖 pH 的 BRD4 凝聚物可能通过直接招募非经典 BAF 复合物激活增强子来调控巨噬细胞中的一部分炎症反应。

    BRD4、MED1和增强子的激活对RNA Pol II的伸长至关重要。作者推测，pH 敏感基因的 Pol II 延长在酸性 pH 条件下会受到选择性抑制，而激活延长可能会减轻抑制性炎症反应。BRD4 的 C 端片段与 pTEFb 相互作用，并被证明能释放暂停的 Pol II，而不依赖于 BET 溴域。利用永生化的 BMDM 细胞系（iBMDMs），作者确定了 iBMDMs 和 BMDMs 之间一致的 pH 敏感基因。过表达mCherry-IDBRRD4能显著逆转 pH 依赖性抑制并减少Ifnb1 的协同诱导，同时维持 pH 不敏感基因的正常激活（图 6F）。因此，作者得出结论：转录凝聚体整合了环境信号，通过染色质重塑对炎症反应进行基因特异性调控（图 6G）。利用 BRD4-IDR 可以逆转炎症反应的环境依赖性抑制。

BRD4的pH感应介导炎症激活的反馈控制

    为了了解炎症期间 pH 依赖性转录凝聚物的潜在功能，作者重新研究了 LPS 刺激时的 pH 变化。有趣的是，作者发现 BMDMs 的 pHi 迅速降低，并在 8 小时后趋于平稳，细胞外环境也随之酸化（图 1B）。这种酸性 pHi 不能简单地通过将 LPS 刺激的 BMDMs 在 pH 7.4 的培养基中培养 8 小时来恢复（图 7A），这表明酸性细胞内环境是由内在程序维持的。因此，只需激活先天感应途径，BRD4 和 MED1 冷凝物就会显著减少（图 7B 和 C）。作者发现，让经 LPS 处理的 BMDMs 接受 5 分钟的 500 nM nigericin 和 100 mM KCl 脉冲，然后在 pH 7.4 条件下进行调节，可在很大程度上将 pHi 恢复到 7.0（图 7A）。经此处理后，pHi的升高恢复了BRD4和MED1的凝聚及其共定位（图7B和C），这表明LPS在体外诱导的低pHi足以且必须抑制转录凝聚。在体内，作者检测了巯基乙酸盐诱导的腹腔巨噬细胞（pMac）对肌注 LPS 的反应。虽然 LPS 处理后 pMac数量减少，但与 PBS 处理的对照组相比，中等剂量 LPS 处理 24 小时后腹腔剩余的 pMac pHi 和 BRD4 点状突起显著减少（图7D,E）。总之，这些数据表明，体外和体内巨噬细胞的炎症活化采用了一种酸性细胞内环境，这种环境对于调节转录凝聚物是必要且充分的。由于酸性 pH 可抑制巨噬细胞的炎症反应，作者的数据表明，通过含 BRD4 的转录凝聚物感知 pH 可作为负反馈控制炎症反应。

    为了探索 BRD4 的 pH 传感在细胞生理学中的作用，作者推断 pH 传感器可能会调节细胞过程以控制 pHi，类似于平衡控制器。因此，作者检测了 BRD4 是否调节 LPS 诱导的细胞内酸化。有趣的是，JQ-1 处理可使 LPS 诱导的 BMDMs 酸化减轻 0.23 个 pH 单位（质子的 1.44 倍），而不会对对照的 BMDMs 产生影响（图 7F）。利用海马测定法，作者观察到 BMDMs 的糖酵解能力和糖酵解速率都因 LPS 刺激而增强，JQ-1 会抑制糖酵解的增加（图 7G、H）。同样，在 pH 6.5 条件下激活的 BMDMs 也显示出糖酵解功能降低。从机理上讲，作者发现六磷酸酶（HK1、HK2、HK3）催化葡萄糖磷酸化为 phopho-6- 葡萄糖，这是葡萄糖转化为能量的第一个化学反应，巨噬细胞中的 LPS 以依赖 BRD4 的方式诱导六磷酸酶转录。因此，BRD4 可作为 pHi 的传感器调节转录和代谢炎症反应。

BRD4 是多种细胞类型中的通用 pH 传感器

    最后，鉴于 BRD4 是在所有细胞类型中表达的关键基因，作者研究了其 pH 依赖性调控是否是各种细胞类型和物种的普遍现象。作者观察到，小鼠和人类原代巨噬细胞以及基质细胞系和上皮细胞系都表现出 pH 依赖性 BRD4 凝聚物（图 7I）。特别是，源自外周血单核细胞的人巨噬细胞中的 BRD4 和 MED1 显示出强烈的 pH 依赖性（图 7J、K）。值得注意的是，不同类型的细胞对细胞外 pH 值的敏感性可能不同，在体内酸性环境下可能表现出细胞类型依赖性反应。此外，作者还发现其他类型的核凝聚物，如 RNA 颗粒和应激颗粒对本文研究的 pH 条件并不敏感（图 7L）。因此，BRD4凝聚物的pH感应建立了一种独特的机制，可将细胞外环境和细胞内环境结合起来，调节炎症反应及其他反应。