Nature子刊丨腺苷-星形胶质细胞-小胶质细胞，脓毒症脑病新机制

全身性炎症会增加血液和大脑中的腺苷水平

    外周注射高剂量 LPS（如 5 毫克/千克，因此本研究中将 1 毫克/千克称为低剂量）是一种广泛使用的诱导小鼠脓毒症全身炎症的方法。已知脓毒症患者或志愿者注射低剂量LPS后血浆腺苷水平会升高。在小鼠模型中，作者也发现注射 LPS 后 2 小时血浆腺苷水平升高，6 小时达到峰值，随后在 12 和 24 小时降至基线水平（图1a，b）。以前的研究表明，全身性炎症会破坏 BBB 的完整性，而作用于内皮 A1 和 A2a AR 的腺苷类似物会导致 BBB 开放。作者还观察到，通过埃文斯蓝（EB）外渗实验评估，外周给药腺苷本身可增加 BBB 的通透性（图1c）。为了进一步将腺苷增加与全身炎症中的 BBB 破坏联系起来，作者进行了 EB 外渗实验，以研究 LPS 注射后 BBB 完整性的动态变化。在每个分析时间点之前两小时给小鼠静脉注射 EB（图1a）。耐人寻味的是，作者的实验在 2 hpi 就检测到了 BBB 的破坏，这种破坏与血液中的腺苷变化类似，在 6 hpi 达到峰值，并在 12 和 24 hpi 下降（图1d）。此外，已有研究表明，外周注射 LPS 可在 24 小时内激活大脑中的各种神经胶质细胞和周细胞以及多种细胞因子。在作者的实验中，作者还观察到炎症相关基因（如Ccl2、Ccl5、Cxcl1、Cxcl10、Tnf、Il6、Il1a 和Il1b）、星形胶质细胞（Gfap和Lcn2）或小胶质细胞反应（Itgam）在小鼠大脑皮层中的表达增强。炎症相关蛋白的表达峰值出现在注射后 2 到 6 小时之间，与此同时，血浆腺苷增加，BBB 被破坏，这是全身炎症的迹象。

    为了研究全身性炎症是否也会诱发脑实质细胞外腺苷水平的升高，作者对表达于躯体感觉皮层星形胶质细胞的新型基因编码 G 蛋白偶联受体（GPCR）-激活型（GRAB）腺苷传感器（GRABAdo1.0）（图1e）进行了活体双光子激光扫描显微镜（2P-LSM）观察。作者检测到 GRABAdo1.0的荧光强度（F.I.）在 2 hpi 时就已增加，在 6 hpi 时达到高峰水平（图1f, g），这表明 LPS 诱导的全身性炎症可增加脑细胞外腺苷水平，这与之前使用大鼠脑内生物传感器记录的研究结果一致。接下来，作者研究了血液中的外周腺苷是否能直接诱导脑细胞外腺苷水平的升高。在 2P-LSM 实时成像过程中，作者向表达 GRABAdo1.0 的小鼠静注腺苷（20 mg/kg）并辅以磺胺 101（SR101，红色荧光）（图1h）。注射腺苷后，作者能够检测到 GRABAdo1.0 F.I. 的增加，这与血管中 SR101 F.I. 的增加是同步的，而单独注射 SR101 并不能增加 GRABAdo1.0F.I. （图1i, j）。此外，当作者注射不同剂量的腺苷（5-20 mg/kg，图1k）时，作者观察到 GRABAdo1.0F.I. 的增加呈剂量依赖性，这表明外周腺苷的增加可以直接提高脑内细胞外腺苷的水平。综上所述，作者确定了外周LPS挑战后血液和躯体感觉皮层中腺苷水平的动态变化。虽然 LPS 治疗后脑细胞外腺苷水平升高的潜在来源仍未确定，而且之前的研究也没有证据表明腺苷能在正常情况下通过 BBB，但作者目前的研究结果有力地表明，外周 LPS 注射会诱导血浆腺苷快速升高，这可能会导致脑细胞外腺苷水平升高，并在全身炎症的早期阶段导致快速神经炎症反应，从而破坏 BBB 功能。

外周腺苷给药通过 A1ARs 诱导星形胶质细胞反应和神经炎症

    为了评估腺苷是否会诱发神经炎症反应，作者给 “野生型”（wt）对照（ctl）小鼠注射了腺苷（5 mg/kg，静脉注射，6 次，间隔 1 小时），并在第一次注射后 6 小时通过 qPCR 分析了小鼠大脑皮层的基因表达水平（图2a）。由于腺苷在血液中的存活时间较短（约 1 小时），作者对其进行了多次注射。有趣的是，腺苷注射后，Lcn2（炎症反应性星形胶质细胞的标记物）上调（图2b）。此外，其他一些促炎细胞因子/趋化因子基因，如Ccl2、Cxcl1、Il1a和Tnf也对腺苷的应用迅速做出反应，表达水平升高（图2b）。由于血浆腺苷水平在注射 LPS 后迅速升高，并在 6 hpi 达到峰值，作者给ctl 小鼠注射了 NECA（1 mg/kg，一种非选择性腺苷类似物，半衰期 = ~5 h），并分析了细胞因子在 6 hpi 的表达情况（图2a）。作者观察到，NECA 处理后，Cxcl1、Cxcl10、Ccl2、Tnf、Il6和Lcn2等多种细胞因子也上调（图2b）。此外，作者给ctl小鼠注射了CPA（1 mg/kg，一种选择性A1AR激动剂，半衰期约为0.5 h），在6 hpi时也检测到了细胞因子和其他与炎症/胃细胞活化相关的蛋白质上调（图2a，b）。此外，当作者将 CPA 与低剂量 LPS（1 毫克/千克，LPSlow）联合注射时，与仅注射 LPS 的小鼠相比，所有测试的细胞因子或趋化因子的表达水平都显著增加（图2c）。另一方面，在高剂量（5 毫克/千克，LPShigh）LPS 攻击小鼠的皮层中，给予 DPCPX（1 毫克/千克，8-环戊基-1,3-二丙基黄嘌呤，一种选择性 A1AR 拮抗剂）可抑制神经胶质细胞和神经元的活化，并减少几种炎症因子（如：Ccl2、Tnf、Tnf、Ccl2、Tnf）的表达、 Ccl2、Tnf、Lcn2、Il6 和Cxcl10）的表达（图2c）。总之，作者的研究结果有力地表明，A1AR 信号传导直接导致了神经炎症的诱导。

    最近的转录组学研究表明，A1AR 是星形胶质细胞中表达最丰富的 ARs。为了确定星形胶质细胞特异性 A1ARs 对腺苷诱发的神经炎症的贡献，作者将具有星形胶质细胞特异性基因重组时间控制的 GLAST-CreERT2 小鼠与缺失的Adora1小鼠杂交，从而产生了可诱导的星形胶质细胞Adora1cKO 小鼠（图2d）（为简单起见，之后将其称为Adora1cKO 小鼠）。此外，作者还杂交了 RiboTag 小鼠，这样就能从大脑皮层的 Cre 表达细胞中特异性地直接纯化 mRNAs（mRNARiboTag），避免了细胞分选过程中固有的陷阱。作者对Adora1RiboTag的表达进行了 qPCR 和 RNA-seq 分析，结果显示 cKO 小鼠的Adora1基因切除成功。与此同时，作者利用基因编码的Ca2+指示剂小鼠品系（Rosa26-LSL-GCaMP3，Rosa26-GCaMP3）研究了他莫昔芬给药后星形胶质细胞中的Ca2+活性。在存在神经元活性阻断剂河豚毒素（TTX，1 µM）的情况下，作者使用体外 2P-LSM 在局灶施用 CPA（1 µM）前后记录了Adora1cKO 和 ctl 小鼠的大脑皮层星形胶质细胞Ca2+信号。活动区（ROAs）的自动检测是使用基于 MATLAB 的定制工具MSparkles 进行的。值得注意的是，星形胶质细胞 A1ARs 的基因消减与Ca2+基线活性的改变有关，包括振幅较低的Ca2+信号数量增加。特别是，A1AR 缺失的星形胶质细胞显示出空间定义的 ROA 出现增多，面积缩小，但每个 ROA 的信号频率降低。综上所述，这些结果表明，去除星形胶质细胞的 A1ARs 会导致星形胶质细胞体内Ca2+信号在信号幅度、空间延伸和信号频率方面的减少。另一方面，在ctl小鼠中应用CPA会引发星形胶质细胞Ca2+信号的显著增加，而在星形胶质细胞Adora1cKO小鼠中却检测不到，这进一步证实了星形胶质细胞中A1ARs的功能性清除。

    随后，作者给Adora1cKO 和 ctl 小鼠注射了 NECA 或 CCPA（0.3 mg/kg，2-氯-N6-环戊基腺苷，一种选择性更强的 A1AR 激动剂），发现几种上调的细胞因子和趋化因子（如 Ccl2、Ccl5、 Cxcl1、Cxcl10、Il1a 和 Tnf）的表达明显减少（图2e）。在小胶质细胞（使用 Cx3CR1-CreERT2 小鼠）和少突胶质细胞前体细胞/周细胞（使用 NG2-CreERT2 小鼠，只有 Ccl2 减少）中特异性消减Adora1的小鼠中没有观察到这种情况（图2d、e）。与体内观察结果一致，将 CCPA 应用于原代星形胶质细胞会引起几种趋化因子（如Cxcl1、Cxcl10、Ccl5）的显著上调，而 CV1808（A2AR 的非选择性拮抗剂）不会引起所有测试的炎症相关基因的显著表达变化。总之，这些结果为腺苷可通过星形胶质细胞 A1AR 信号转导引发神经炎症反应提供了更多证据。

A1AR 信号增强了全身炎症早期反应性星形胶质细胞的炎症反应

    即刻早期基因Fos家族的上调常用来表示神经元以及早期反应性星形胶质细胞在病理刺激下的激活。此外，星形胶质细胞中的 GPCR 信号可触发 c-Fos 的表达。因此，作者首先在小鼠脑片上进行了 c-Fos 与星形胶质细胞标志物 Sox9 的免疫组化，以研究注射 LPS（5 毫克/千克，以下所有实验均如此）后星形胶质细胞反应性的时间进程。作者发现，ctl 小鼠星形胶质细胞中 c-Fos 的表达在 2 hpi 时没有变化，但在 6 hpi 时上调，并在 24 hpi 时降至基础水平。然而，大脑皮层、海马和纹状体中星形胶质细胞的 c-Fos 表达在 6 hpi 时因 A1ARs 的缺乏而受到显著抑制，这表明星形胶质细胞对全身性炎症的反应有一个关键的早期时间窗口（图3a-d）。此外，信号转导和激活转录 3（STAT3）信号的激活是反应性星形胶质细胞炎症反应的重要诱导因素)。为了评估星形胶质细胞的炎症反应，作者对 STAT3 的活化形式（即phospho-STAT3Tyr705 ，p-STAT3）进行了免疫组化。在ctl和Adora1cKO小鼠的大脑中，作者观察到p-STAT3在0 hpi时几乎检测不到。但是，在 6 小时后，ctl 小鼠的几乎所有 Sox9+星形胶质细胞中都能检测到 p-STAT3 免疫反应，而Adora1cKO 小鼠的这种免疫反应则明显减少。在 24 hpi 时，p-STAT3 的表达水平大大降低（图3e-h）。这些结果进一步表明，A1AR 信号的激活促进了反应性星形胶质细胞的炎症反应，这种反应在全身炎症的早期阶段达到高峰。

    接下来，作者进行了高通量 RNA-seq，以进一步研究 A1AR 介导的反应性星形胶质细胞对全身炎症反应在分子水平上的影响。作者使用 RiboTag 方法直接从大脑皮层纯化星形胶质细胞翻译的 mRNA（mRNARiboTag），进行 RNA-seq 分析。作者观察到，ctl 小鼠的星形胶质细胞对外周 LPS 挑战做出了强烈反应，在注射 LPS 后，随着时间的推移，基因会动态上调或下调，这与之前的报道一致。然而，与ctl小鼠相比，A1AR缺陷型星形胶质细胞在注射LPS后6和24 hpi的整体基因表达变化要小得多（图4a）。将 A1AR 缺陷星形胶质细胞与ctl 星形胶质细胞进行比较，作者发现在 0 hpi（健康对照组）时有 12 个（4 个向上，8 个向下）差异表达基因（DEGs），在 6 hpi 时有 185 个（38 个向上，147 个向下）差异表达基因，在 24 hpi 时有 2643 个（1465 个向上，1178 个向下）差异表达基因。进一步的 K-means 层次聚类分析将 DEGs 分成 8 个聚类（图4a）。在 6 hpi 时，ctl 小鼠中有 125 个基因（第 1 组，第 5 组）上调，其中包括细胞因子和趋化因子（如Ccl2、Ccl5、Ccl9、Cxcl1、Cxcl10 等）、促进炎症的转录因子（如 Nfkb1a、Nfkb2、Stat3 等）以及先前确定的早期反应性星形胶质细胞标记基因，如干扰反应基因（如 Nfkb1a、Nfkb2、Stat3 等），以及先前确定的早期反应性星形胶质细胞的标记基因，如干扰素反应基因（如Ifit1、2、3）和编码抗原呈递蛋白的基因（如H2-D1、H2-K1）。然而，在Adora1cKO 小鼠的星形胶质细胞中，这些促炎基因的表达受到抑制。值得注意的是，在 6 hpi 时，一些即刻早期基因（如Fos、Jun 和 Junb；第 5 组）也在ctl 星形胶质细胞中反应性表达，如先前所报道的那样，而在Adora1cKO 星形胶质细胞中则受到抑制，这与 c-Fos 免疫组化结果一致。与第 5 组基因（如Fos、Jun、Junb）在 24 小时后迅速下调至基线水平不同，第 1 组基因（如Ccl5、Ccl9、Cxcl10、Stat3）在ctl 星形胶质细胞中仍高水平表达，但在 A1AR 缺陷星形胶质细胞中则在 24 小时后受到抑制。在第 2、第 4 和第 6 组中，有 918 个基因在 6 hpi 时在ctl 和Adora1cKO 星形胶质细胞中都有轻微的表达失调，但在 24 hpi 时在ctl 星形胶质细胞中要么上调（第 6 组），要么下调（第 2 和第 4 组）。然而，这些基因在Adora1cKO 星形胶质细胞中的表达在 24 hpi 时似乎略有改变。通过 Metascape 通路分析，作者发现这些集群中的基因负责 “DNA 修复”（如集群 6 中的Fancm、Msh3、Xpa 等）、“神经元系统”（如集群 2 中的Gabrd、Mpdz 等）和 “细胞投射组装”（如集群 4 中的Fnbp11、Tppp、Nek1 等）。作者还观察到，先前研究中定义为 “A1 星形胶质细胞”（如H2-D1、H2-T23、Gbp2、Iigp1、Psm8 等）和 “A2 星形胶质细胞”（如Clcf1、Tgm1、Ptx3 等）的许多基因在 24 hpi 时在Adora1cKO 星形胶质细胞中减少。因此，作者认为Adora1cKO 小鼠在 24 hpi 时的这种差异可被视为 6 hpi 时星形胶质细胞炎症反应减弱的结果，这可能会改善之后的整体神经炎症（见下文）。例如，GSEA-KEGG 通路分析表明，参与星形胶质细胞炎症反应通路（如 “NF-kappa B 信号通路”、“JAK-STAT 信号通路”、“IL-17 信号通路、NOD 样受体信号通路”、“TNF 信号通路 ”等）的基因在 6 hpi 时被Adora1cKO 小鼠抑制（图4b、c）。同样，GSEA-GO 术语（生物过程，BP）分析也表明，炎症相关 GO 术语注释的基因（如 白细胞介素-1 的产生“、”toll 样受体信号通路“、”通过 JAK-STAT 的受体信号转导“、”I-kappaB/NF-kappaB 信号转导“、”炎症反应、细胞因子反应“、”干扰素-gamma 的产生 "等）在 6 hpi 时受到抑制（图4d, e）。此外，对上游转录调控因子的 Metascape 分析表明，A1AR 缺失的星形胶质细胞在 6 hpi 时被抑制的基因受转录因子（如Jun、Nfkb1、Cebpb、Stat3、Fos 等）调控，而这些因子已知可调控反应性星形胶质细胞的下游促炎通路（图4f ） 。综上所述，作者的研究结果表明，在外周 LPS 挑战后的早期阶段，腺苷通过 A1ARs 触发反应性星形胶质细胞的炎症反应，这可能会影响神经病理学的后续发展。

全身性炎症早期阶段的星形胶质细胞反应促进了整体神经炎症和小胶质细胞反应

   作者接下来研究了星形胶质细胞 A1AR 信号传导对全身炎症挑战后大脑整体炎症反应的影响。作者使用蛋白质组分析测定法测量了ctl 和Adora1cKO 小鼠大脑皮层中 111 种不同的细胞因子，观察到注射 LPS 后 6 和 24 hpi，ctl 小鼠大脑皮层中大多数与炎症相关的蛋白质都上调了。然而，在Adora1cKO 小鼠中，几种星形胶质细胞特异性/相关的促炎症蛋白（如 CXCL1、CXCL10、ICAM-1、脂钙蛋白 2 (LCN2)、MMP3）和许多其他多种来源（包括小胶质细胞和星形胶质细胞）的细胞因子或趋化因子（如 CCL2、CCL5、IL-1α、CXCL2 等）在注射 LPS 后大量减少（图5a、b），与星形胶质细胞RNARiboTag测序结果一致。此外，作者还选择了差异表达的蛋白 LCN2 进行 Western 印迹，以进一步证实细胞因子阵列的结果。使用小尺寸（40 个细胞因子）细胞因子阵列免疫点印迹分析，在Adora1cKO 小鼠纹状体中检测到了类似的炎症反应减少模式（图5c，d）。这些结果表明，在全身炎症的早期阶段激活 A1AR 后，反应性星形胶质细胞会加剧之后的整体神经炎症。

    小胶质细胞和星形胶质细胞是神经炎症的关键参与者。先前的研究表明，星形胶质细胞和小胶质细胞相互影响，共同调节神经炎症。特别是在外周 LPS 挑战模型中，当激活的小胶质细胞释放的细胞因子触发星形胶质细胞时，星形胶质细胞就会产生神经毒性。然而，这些先驱研究都集中在 LPS 模型的晚期（24 hpi 之后）。作者目前的研究结果显示，腺苷介导的星形胶质细胞对 LPS 挑战的早期反应（2-6 hpi）可调节炎症相关基因的表达，其中许多基因（如Ccl2、Ccl5、Cxcl1 和 Cxcl10）已被证明可触发反应性小胶质细胞的形成。因此，作者假设星形胶质细胞可以在系统性炎症的初始阶段调节小胶质细胞的活化，而不仅仅是反应性小胶质细胞的效应器。众所周知，反应性小胶质细胞通过 NF-κB 信号通路产生多种炎症细胞因子。因此，作者首先检测了小胶质细胞在 LPS 模型早期阶段的反应性，并检测了作为反应性小胶质细胞指标的 p65（NF-κB 的辅助因子）的核转位（图6a）。

    作者发现，外周LPS挑战使ctl小鼠皮层中核p65+小胶质细胞的比例从2 hpi时的~13%增加到6 hpi时的~90%和24 hpi时的~30%，而Adora1cKO小鼠的这一比例在2、6和24 hpi时分别降至~9%、~55%和~17%（图6a、b）。同样，在海马和纹状体中，Adora1cKO 小鼠的核 p65+小胶质细胞在 6 hpi 时也按比例减少（图6c、d）。因此，作者的研究结果表明，全身性 LPS 挑战会在早期阶段通过 A1AR 信号激活星形胶质细胞，从而增强反应性小胶质细胞炎症反应。此外，全身性炎症挑战可增强小胶质细胞的吞噬作用，从而导致抑郁样行为。因此，作者量化了小胶质细胞中 CD68+溶酶体的体积，以评估模型中小胶质细胞的吞噬能力（图6e）。作者发现ctl小鼠皮质中CD68+溶酶体的体积（与小胶质细胞体积的比例）从0 hpi时的~1%增加到6 hpi时的~4%，并进一步增加到24 hpi时的~11%。然而，在Adora1cKO 小鼠中，这种体积的扩大在 6 hpi 和 24 hpi 分别被显著抑制到 ~2% 和 ~5%，这表明小胶质细胞的吞噬作用受到了星形胶质细胞 A1AR 缺乏的抑制（图6e，f）。为了进一步证实小胶质细胞表型改变的改善，作者用 IMARIS 软件分析了Adora1cKO 和 ctl 小鼠的小胶质细胞形态（图6g）。在健康对照组（0 hpi）中，Adora1cKO 和 ctl 小鼠的小胶质细胞形态相似。然而，在注射 LPS 6 或 24 小时后，Adora1cKO 小鼠的小胶质细胞在 Sholl 分析中显示出更多的交叉点、更长的总过程和更大的占据面积（图6g-i ），这表明在没有星形胶质细胞 A1AR 信号传导的情况下，小胶质细胞的活化程度降低。与形态学变化一致的是，作者检测到两组小胶质细胞稳态标志物（如P2ry12）的基因表达水平在 6 hpi 时均有所降低。然而，在 24 hpi 时，Adora1cKO 小鼠中P2ry12的表达恢复到健康水平，而在 ctl 小鼠中，P2ry12的表达仍然显著降低（图6j）。综上所述，作者的研究结果表明，A1AR 信号触发早期反应性星形胶质细胞，在系统性炎症挑战后引发反应性小胶质细胞病理表型的形成。

星形胶质细胞 A1AR 信号转导导致全身性炎症中的 BBB 功能受损和外周免疫细胞浸润

    接下来，作者研究了Adora1cKO 和 ctl 小鼠在外周 LPS 挑战后的 BBB 功能相关参数。全身性炎症会诱导依赖于 CCL5-CCR5 轴的小胶质细胞向血管迁移，从而进一步损害BBB。作者发现，注射 LPS 后，ctl 小鼠血管周围小胶质细胞的比例从 0 hpi 时的 ~35% 增加到 6 hpi 和 24 hpi 时的 ~50%，而Adora1cKO 小鼠血管周围小胶质细胞的比例仅从 ~35% 增加到 6 hpi 时的 ~43% 和 24 hpi 时的 ~45%，这表明外周注射 LPS 后Adora1cKO 小鼠血管周围新招募的小胶质细胞显著减少（~50%），这与 cKO 小鼠中 CCL5 表达的减少相一致。为了评估 BBB 的完整性，作者在注射 LPS 后立即给小鼠静脉注射 EB，并让 EB 循环 24 小时。之后，作者测量了EB在脑组织中的外渗情况。与ctl相比，作者在Adora1cKO小鼠脑中检测到的EB更少（~10 vs. 22 µg/g 组织），这表明Adora1cKO小鼠的BBB破坏较少。全身性炎症会促进外周免疫细胞渗入脑实质，这归因于 BBB 的破坏以及趋化因子（如 CXCL1）和细胞外基质蛋白（如 ICAM-1）的表达上调。因此，作者使用流式细胞术鉴定大脑中不同的免疫细胞群。作者发现，在6 hpi时，浸润的单核细胞（CD11b+/CD45low+/Ly6Cneg-/Ly6Ghigh+；对照组：约4% vs Adora1 cKO：约2%）、中性粒细胞（CD11b+/CD45low+/Ly6Cinter+/Ly6Ghigh +；对照组：约4%，Adora1 cKO：约2%），T细胞（CD45+/CD3high+/Ly6Gneg-；对照组：约4%，Adora1 cKO：约2%）在Adora1 cKO小鼠中显著减少。此外，作者在 24 hpi 进行了 Ly6B 免疫染色以检测中性粒细胞。作者发现，与ctl相比，cKO小鼠在外周注射LPS 24小时后进入脑实质的Ly6B+细胞大大减少，这与作者目前发现的Adora1cKO小鼠CXCL1和ICAM-1表达减少的结果一致。综上所述，在系统性炎症挑战下，星形胶质细胞 A1AR 的缺乏抑制了小胶质细胞反应和神经炎症，从而改善了 BBB 的损伤并减少了外周免疫细胞的浸润。

A1AR介导的星形胶质细胞活化可促进全身炎症中异常的神经元功能和行为缺陷

    系统性炎症也会改变神经元的过度活跃。例如，在周围注射LPS后两小时，周细胞被触发释放CCL2，随后决定神经元的过度活跃。因此，作者进行了c-Fos和NeuN（一种神经元标记物）双重免疫染色，并研究了周围LPS刺激后的神经元激活。与星形胶质细胞相反，作者发现对照组小鼠皮层神经元中的c-Fos表达从6 hpi逐渐增加到24 hpi。虽然与基线水平（0 hpi）相比，Adora1 cKO小鼠神经元中的c-Fos表达仍然升高，但6 hpi和24 hpi时低于对照组小鼠（图7a、b）。同样，作者发现Adora1 cKO小鼠海马和纹状体NeuN+神经元中的c-Fos水平在24 hpi时较低（图7c、d）。因此，这些结果进一步证实了星形胶质细胞A1AR在全身炎症挑战时有助于神经元的激活。

    全身内毒素引起的神经炎症已被证明会影响神经元网络的可塑性，表现为长期增强（LTP）受损。为了研究外周LPS刺激后星形胶质细胞特异性A1AR缺失对神经元可塑性的影响，作者对Adora1 cKO和ctl小鼠海马背侧的急性切片进行了细胞外电生理记录。注射PBS后，两组神经元均表现出相似的LTP。然而，注射LPS后，对照组小鼠在6和24 hpi时LTP受损，而cKO小鼠的LTP则得以保留（图7e-g）。这些结果表明，在全身性LPS刺激后，腺苷会触发星形胶质细胞的炎症反应，从而对神经元功能产生不利影响。

    外周LPS引起的神经炎症会导致小鼠疲劳、肌肉无力和其他疾病行为（例如驼背、进食和饮水量减少等），这些症状在2至6 hpi之间达到峰值，随后逐渐减弱。随后，抑郁样行为（例如，在开放场试验中运动减少、对甜水的偏好丧失等）逐渐发展，并在24小时后达到峰值。因此，作者进行了开放场试验，以评估小鼠的一般探索性运动，作为24 hpi（图7h）行为缺陷的总读数。作者观察到注射了PBS的对照组和Adora1 cKO小鼠在开放场测试中的表现相似。正如预期的那样，注射LPS后，所有对照组和Adora1 cKO小鼠的运动量都急剧减少，而Adora1 cKO小鼠的活动距离比对照组小鼠更长（图7i、j），这表明星形胶质细胞A1AR的缺失可以减轻全身炎症引起的行为缺陷。然而，两组小鼠在中央区域停留的时间（通常用于评估小鼠抑郁/焦虑的参数）都大大减少，尽管Adora1 cKO小鼠有增加停留时间的趋势。关于疾病的其他方面，例如疲劳可能会影响对在中央区域停留时间的解释，作者使用蔗糖偏好测试进一步具体评估了厌食症，这是系统性炎症引起的抑郁样行为的另一个标志（图7h）。作者观察到，外周LPS刺激可在很大程度上消除对照组小鼠在24-48 hpi（约45%）的蔗糖偏好，并在48-72 hpi部分恢复至约60%。然而，Adora1 cKO小鼠的蔗糖偏好仅在24-48 hpi时部分受损，降至约65%，并在48-72 hpi时几乎完全恢复到健康水平（约80%），这再次表明星形胶质细胞A1AR的激活会导致全身炎症引起的行为缺陷（图7k）。

在A1AR缺陷星形胶质细胞中增强Gi信号传导，可恢复外周LPS刺激后的神经炎症

    A1AR是Gi/o蛋白偶联受体。因此，可以认为cKO小鼠的星形胶质细胞中的Gi信号较弱。在给予其特异性激动剂CNO（氯氮平N-氧化物）后，可以使用基于Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs (DREADD)的化学遗传学工具hM4Di人工恢复Gi信号。由于之前的研究表明，小鼠纹状体中的反应性小胶质细胞是外周LPS刺激后抑郁样行为的主要诱因，因此作者采用立体定向注射法将AAV-GFAP-hM4Di-mCherry或AAV -GFAP-tdTomato到Adora1 cKO和ctl小鼠的纹状体，以在星形胶质细胞中特异性表达hM4Di（由mCherry表示）或tdTomato（tdT，作为对照）。为了研究在全身炎症早期阶段，A1AR介导的星形胶质细胞活化是否对引发随后的神经炎症至关重要，作者在外周LPS刺激后2和4小时向AAV传递的小鼠注射CNO（2 mg/kg，半衰期=~0.5 h），以诱发Gi信号（图8a-c）。在6 hpi时，作者发现，在Adora1 cKO小鼠中，表达hM4Di的星形胶质细胞中的c-Fos表达比表达tdT的星形胶质细胞中的表达更强，这表明注射LPS后，Gi信号可以进一步激活A1AR缺陷的星形胶质细胞（图8d、e）。同时，作者发现，与Adora1 cKO小鼠中表达tdT的星形胶质细胞相比，表达hM4Di的星形胶质细胞区域中核p65+小胶质细胞增加，这表明增强星形胶质细胞的Gi信号传导可以在全身炎症的早期阶段促进反应性小胶质细胞的炎症反应（图8f、g）。为了评估A1AR缺陷星形胶质细胞中Gi信号激活的长期效应，作者在注射LPS后24小时通过细胞因子阵列测量了AAV感染脑区的促炎因子表达。作者发现，在tdT表达的Adora1 cKO小鼠中，这些因子（例如CCL2、CCL5、CCL3、CXCL1、CXCL2、CXCL10、G-CSF等）的表达受到抑制（与tdT表达的ctl小鼠相比），而在hM4Di表达的Adora1 cKO小鼠中，这些因子的表达可以在一定程度上得到增强（图8h、i）。此外，在星形胶质细胞hM4Di激活的Adora1 cKO小鼠的皮层中也可以检测到类似的效果，这表明Gi信号在不同脑区的星形胶质细胞中具有一致的作用，可以促进神经炎症。这些结果与之前进行的药理干预实验结果一致，表明A1AR拮抗剂DPCPX治疗可以在全身炎症的早期阶段减轻神经炎症。接下来，作者进行了一个开放场测试，发现Adora1 cKO小鼠在LPS刺激下的行为缺陷减轻，而在激活星形胶质细胞Gi信号后，这种缺陷会加剧到与对照组小鼠相同（图8j-l）。同样，作者观察到在2和4 hpi时用DPCPX治疗的ctl小鼠在24 hpi时在开放场测试中表现出运动增加，表明行为缺陷得到改善。总之，作者的研究结果有力地表明，在全身炎症中，星形胶质细胞对A1AR信号的早期反应在促进神经炎症以驱动SAE的发病机理方面起着重要作用，而靶向A1AR可能是治疗SAE的一种方法。