Chestnut Studying
摘要
Immune checkpoint blockade (ICB) triggers tumor ferroptosis. However, most patients are unresponsive to ICB. Tumors might evade ferroptosis in the tumor microenvironment (TME). Here, we discover SLC13A3 is an itaconate transporter in tumor cells and endows tumor ferroptosis resistance, diminishing tumor immunity and ICB efficacy. Mechanistically, tumor cells uptake itaconate via SLC13A3 from tumor-associated macrophages (TAMs), thereby activating the NRF2-SLC7A11 pathway and escaping from immune-mediated ferroptosis. Structural modeling and molecular docking analysis identify a functional inhibitor for SLC13A3 (SLC13A3i). Deletion of ACOD1 (an essential enzyme for itaconate synthesis) in macrophages, genetic ablation of SLC13A3 in tumors, or treatment with SLC13A3i sensitize tumors to ferroptosis, curb tumor progression, and bolster ICB effectiveness. Thus, we identify the interplay between tumors and TAMs via the SLC13A3-itaconate-NRF2-SLC7A11 axis as a previously unknown immune ferroptosis resistant mechanism in the TME and SLC13A3 as a promising immunometabolic target for treating SLC13A3+ cancer.
免疫检查点阻断（ICB）会引发肿瘤铁死亡。然而，大多数患者对 ICB 没有反应。肿瘤可能会在肿瘤微环境（TME）中逃避铁死亡。在这里，我们发现SLC13A3是肿瘤细胞中的衣康酸转运体，并赋予肿瘤铁死亡抗性，降低肿瘤免疫力和ICB疗效。从机理上讲，肿瘤细胞通过 SLC13A3 从肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）中吸收衣康酸，从而激活 NRF2-SLC7A11 通路，摆脱免疫介导的铁死亡。结构建模和分子对接分析确定了一种 SLC13A3 的功能性抑制剂（SLC13A3i）。在巨噬细胞中缺失 ACOD1（衣康酸合成所必需的酶）、在肿瘤中对 SLC13A3 进行基因消融或用 SLC13A3i 治疗都会使肿瘤对铁死亡敏感、抑制肿瘤进展并增强 ICB 的有效性。因此，我们发现肿瘤和 TAMs 之间通过 SLC13A3-衣康酸-NRF2-SLC7A11 轴的相互作用是 TME 中一种之前未知的免疫铁死亡抵抗机制，而 SLC13A3 则是治疗 SLC13A3+癌症的一种有前景的免疫代谢靶标。
实验结果1
肿瘤SLC13A3的表达与 ICB 的疗效和患者存活率相关
肿瘤代谢物，包括几种二羧酸盐和三羧酸盐TCA循环代谢物，会损害TME中的抗肿瘤免疫力。SLC13家族是一组细胞膜转运体，有可能将二羧酸盐或三羧酸盐代谢物导入细胞。为了验证这一假设，作者首先评估了接受抗 PD-1 单克隆抗体（nivolumab 或 pembrolizumab）治疗的转移性黑色素瘤患者队列中SLC13家族成员的表达情况。作者发现，肿瘤 SLC13A3 的表达水平是三大 SLC13 家族成员中最高的，而且与无应答者（N）相比，ICB 有应 答者（R）的肿瘤 SLC13A3 表达水平较低（图 1A）。肿瘤SLC13A3的高表达与这些患者的总生存率低有关（图1B）。因此，SLC13A3的表达与ICB的临床反应呈负相关。
作者将研究扩展到韩国茶大学盆唐医疗中心接受阿特珠单抗加贝伐单抗免疫疗法治疗的晚期肝细胞癌（HCC）患者队列，并对其进行了验证。与黑色素瘤数据一致，SLC13A3表达与ICB临床反应之间呈负相关（图1C）。高水平的 HCCSLC13A3与患者的总生存期呈负相关（图 1D）。作者同样分析了密歇根大学接受 ICB 治疗的患者队列，这些患者横跨黑色素瘤、头颈癌和膀胱癌三种肿瘤类型。同样，肿瘤SLC13A3的高表达与总生存率低有关（图 1E）。TCGA数据集的分析涵盖多种癌症类型，包括低级别胶质瘤（LGG）、胰腺腺癌（PAAD）、子宫癌肉瘤（UCS）、胆管癌（胆管癌，CHOL）、乳腺癌（BRCA）、皮肤皮肤黑色素瘤（SKCM）和膀胱癌、 皮肤黑色素瘤（SKCM）、子宫内膜癌（UCEC）、头颈部鳞状细胞癌（HNSC）和肾透明细胞癌（KIRC）的结果相似。三个单细胞 RNA 测序数据集表明，与黑色素瘤和结直肠癌患者的其他细胞簇相比，SLC13A3在恶性细胞簇中的表达模式更为丰富（图 1F）。免疫组化染色（IHC）证实黑色素瘤细胞中有强效的SLC13A3蛋白表达，而正常皮肤组织中却没有（图 1G）。在开放源数据中的人类胰腺癌、结直肠癌、肝癌和卵巢癌中也观察到了类似的结果。因此，作者的发现强调了泛肿瘤SLC13A3表达、肿瘤免疫受损和肿瘤对 ICB 的耐药性之间的潜在联系。
实验结果2
SLC13A3 可降低肿瘤免疫原性
为了明确肿瘤 SLC13A3 在肿瘤免疫中的功能意义，作者生成了几种小鼠Slc13a3基因敲除（Slc13a3-/- ）肿瘤细胞系。作者观察到，在携带 Yumm5.2 黑色素瘤、B16-F10 黑色素瘤和 MT3 胰腺癌的 C57BL/6J 小鼠中，基因缺失Slc13a3会导致肿瘤发生和进展的减少（图 2A-2F）。为了进一步验证这一发现，作者在亲代（Slc13a3OE）Yumm5.2肿瘤上异位表达了Slc13a3，或在Slc13a3-/-（Slc13a3-/-+OE ）B16-F10肿瘤中挽救了Slc13a3的表达。恢复Slc13a3的表达会导致Yumm5.2和B16-F10黑色素瘤模型的肿瘤进展。相应地，与Slc13a3+/+肿瘤相比，携带Slc13a3-/-肿瘤的小鼠体内肿瘤浸润 IFNγ+ CD8+T 细胞和 TNFα+ CD4+T 细胞的百分比增加了（图 2G、2 H）。与此相应，单细胞 RNA 测序分析显示，与Slc13a3+/+肿瘤相比，Slc13a3-/-B16-F10 肿瘤中细胞毒性淋巴细胞比例水平升高。为了了解肿瘤免疫反应的重要性，作者将Slc13a3+/+和Slc13a3-/-B16-F10 细胞接种到 NOD-SCIDIL2rγnull(NSG) 小鼠体内。野生型（免疫能力强）小鼠中Slc13a3+/+和Slc13a3-/-肿瘤的生长差异在 NSG 小鼠中有所缩小（图 2I 和 2J）。这些数据表明，SLC13A3 会损害肿瘤的免疫原性。
实验结果3
SLC13A3 导入衣康酸，保护肿瘤免受铁死亡的影响
为了阐明SLC13A3损害肿瘤免疫原性的潜在机制，作者分析了体内 Slc13a3+/+和Slc13a3-/-B16-F10肿瘤的单细胞测序数据。基因组富集分析（GSEA）表明，与Slc13a3-/-肿瘤相比，铁死亡抵抗和 NRF2 基因特征是Slc13a3+/+肿瘤中上调幅度最高的基因信号之一（图 3A 和 3B）。除了细胞毒性 T 细胞在Slc13a3-/-B16-F10 肿瘤中增加（图 2G）外，I 型 IFN 信号在Slc13a3-/-B16-F10 肿瘤中也有富集（图 3A），这表明 I 型 IFN 信号在Slc13a3-/-肿瘤消退中的潜在作用。这促使作者研究 SLC13A3 作为代谢产物转运体是否会影响肿瘤细胞的铁死亡，从而改变肿瘤的免疫原性。为了验证这一假设，作者用铁死亡抑制剂 liproxstatin-1 处理携带Slc13a3-/-和Slc13a3+/+B16-F10 肿瘤的小鼠（图 3C）。脂氧司他丁-1 对Slc13a3+/+肿瘤的生长影响极小，但能显著缓解Slc13a3-/-肿瘤的进展，缩小Slc13a3-/-和Slc13a3+/+B16-F10 肿瘤之间的生长差异（图 3C）。因此，SLC13A3通过使肿瘤对TME中的铁死亡产生抗性来损害肿瘤的免疫原性。
SLC13A3 被认为是一种二羧酸盐和三羧酸盐代谢物转运体。为了破解 SLC13A3 如何影响肿瘤铁死亡，作者用一系列二羧酸盐和三羧酸盐 TCA 循环代谢物培养Slc13a3OEYumm5.2 细胞，并检测它们对铁死亡诱导剂依拉菌素的反应。作者发现，与其他代谢物不同，衣康酸能强烈保护肿瘤细胞免受麦拉宁诱导的铁死亡（图 3D）。然而，在没有铁死亡诱导剂的情况下，衣康酸对Yumm5.2细胞中脂肪酸类似物BODIPY C12和细胞内Fe2+的吸收没有影响。基于细胞的转运体检测表明，13C5 标记的衣康酸以剂量依赖的方式从细胞外空间高效转运到Slc13a3OEYumm5.2 细胞中（图 3E），这表明 SLC13A3 是肿瘤细胞的衣康酸转运体。为了验证 SLC13A3 在肿瘤铁死亡抵抗中的作用，作者用衣康酸预处理Slc13a3+/+Yumm5.2 细胞和Slc13a3-/-Yumm5.2 细胞，随后用两种铁死亡诱导剂 RSL3 和麦拉宁培养这些细胞。衣康酸能有效保护Slc13a3+/+Yumm5.2细胞免于铁死亡（图3F），并减少Slc13a3+/+Yumm5.2细胞中氧化脂质的产生（图3G）。Slc13a3-/-Yumm5.2细胞没有表现出这些作用（图3F和3G）。衣康酸对铁死亡的保护作用扩展到了人类黑色素瘤细胞系 Colo-679（图 3H）和 RVH-421（图3I）。此外，与Slc13a3-/-细胞相比，衣康酸能保护Slc13a3+/+B16-F10 细胞免于麦拉宁诱导的铁死亡，而在Slc13a3-/-细胞中挽救 SLC13A3 的表达（Slc13a3-/-+OE ）能再次增强保护作用（图 3J）。转运体检测证实，在Slc13a3OE（图 3K）和Slc13a3-/-+OEB16-F10 细胞中，细胞外衣康酸的输入量急剧增加。与此相一致，体内 Slc13a3+/+B16-F10 细胞的13C5衣康酸水平高于Slc13a3-/-B16-F10 细胞。用细胞渗透性衣康酸（4-辛基衣康酸 [OI]）处理Slc13a3-/-B16-F10细胞和Slc13a3-/-+OEB16-F10细胞会产生相似水平的铁死亡保护。Slc13a3-/-Yumm5.2细胞和Slc13a3+/+Yumm5.2细胞也得到了类似的结果。为了进一步深入研究衣康酸细胞内的铁死亡保护功能，作者将研究扩展到多种小鼠和人类肿瘤细胞系。作者证实细胞渗透性衣康酸能使 B16-F0、A375 人黑色素瘤细胞系、OC8 人卵巢癌细胞系和 OVCA429产生铁死亡抵抗。这些结果共同证明，SLC13A3 是肿瘤细胞的一种活跃的衣康酸转运体，能输入衣康酸保护肿瘤免受铁死亡的影响。
实验结果4
衣康酸激活 NRF2-SLC7A11 轴，保护肿瘤免受铁死亡影响
为了探索衣康酸对肿瘤细胞产生影响的细胞内机制，作者对经细胞渗透性衣康酸处理的Yumm5.2细胞进行了RNA测序研究。与作者在Slc13a3+/+肿瘤细胞上观察到的结果（图 3A）一致，作者发现用细胞渗透性衣康酸处理的肿瘤细胞中 NRF2 通路富集（图 4A 和 4B）。NRF2 在细胞抗氧化防御机制中起着关键作用，并且是介导铁死亡抵抗的调节器，值得注意的是，胱氨酸转运体 SLC7A11 是铁死亡的关键调节器，它是细胞渗透性衣康酸处理后上调的 NRF2 靶向基因之一（图 4C）。与此相一致，用渗透性衣康酸处理会以剂量依赖的方式增加 Yumm5.2 细胞中的Slc7a11转录物（图 4D）。此外，在Slc13a3-/-和Slc13a3+/+Yumm5.2 细胞中，用渗透性衣康酸处理可比地增加 SLC7A11 和 NRF2 蛋白的表达（图 4E）。然而，用衣康酸处理会增加Slc13a3+/+Yumm5.2 细胞中 SLC7A11 和 NRF2 蛋白的表达，但不会增加Slc13a3-/-Yumm5.2 细胞中 SLC7A11 和 NRF2 蛋白的表达（图4F）。为了研究 PERK 在衣康酸诱导的 NRF2 中的潜在作用，作者使用小发夹 RNAs 建立了稳定的Eif2ak3敲除Slc13a3OEYumm5.2 细胞。Eif2ak3敲除并不影响衣康酸诱导的 NRF2 表达。这表明衣康酸通过 PERK 依赖性机制上调 NRF2。总之，SLC13A3是导入衣康酸以刺激肿瘤细胞中SLC7A11和NRF2表达的重要转运体。
为了确定 SLC7A11 是否介导了衣康酸诱导的铁死亡抵抗，作者建立了Slc7a11-/-Yumm5.2 细胞。在Slc7a11+/+Yumm5.2 细胞中，细胞渗透性衣康酸刺激了 SLC7A11 的表达和胱氨酸的摄取，但在Slc7a11-/-Yumm5.2 细胞中没有刺激（图 4G）。与此相应，与Slc13a3-/-细胞相比，衣康酸增加了Slc13a3+/+Yumm5.2 细胞对胱氨酸的摄取。与此相一致，渗透性衣康酸诱导了Slc7a11+/+B16-F10 细胞的铁死亡抵抗，但没有诱导Slc7a11-/-B16-F10 细胞的铁死亡抵抗（图 4H）。为了探索 NRF2 在衣康酸诱导的铁死亡抗性中的作用，作者使用小发夹 RNA 生成了几种稳定的Nfe2l2基因敲除 Yumm5.2 细胞（sh-Nfe2l2 #1-3）。作者发现，渗透性衣康酸未能上调sh-Nfe2l2Yumm5.2 细胞中 SLC7A11 的表达，也无法保护 Yumm5.2 细胞免于 RSL-3 诱导的铁死亡。总之，作者的数据表明，SLC13A3转运的衣康酸能激活NRF2-SLC7A11轴，保护肿瘤免于铁死亡。
实验结果5
衣康酸通过诱导铁死亡抵抗促进肿瘤进展
作者接下来评估了衣康酸诱导的铁死亡抵抗在体内肿瘤进展中的作用。为了研究衣康酸对肿瘤进展的影响，作者使用了缺乏内源性衣康酸的Acod1基因敲除小鼠品系（Acod1-/-）。作者观察到，与携带 MC38、Yumm5.2 和 B16-F10 肿瘤的Acod1+/+小鼠相比，Acod1-/-小鼠的肿瘤进展有所减缓（图 5A-5C）。同时，从Acod1-/-小鼠体内分离出的肿瘤细胞表现出脂质 ROS 水平升高，表明体内铁死亡增加（图 5D）。值得注意的是，用脂质司他丁-1 治疗可减少Acod1-/-和Acod1+/+小鼠之间 B16-F10 肿瘤生长的差异（图 5E），揭示了衣康酸与体内肿瘤铁死亡抵抗之间的密切联系。为了评估肿瘤 SLC13A3 在这方面的参与情况，作者将Slc13a3-/-B16-F10 肿瘤细胞接种到Acod1-/-和Acod1+/+小鼠体内。肿瘤Slc13a3的消减减轻了Acod1+/+小鼠和Acod1-/-小鼠之间肿瘤生长的差异，这表现在两组小鼠的肿瘤相当且更小（图 5F）。为了检验肿瘤 SLC7A11 的表达是否对衣康酸的体内效应至关重要，将Slc7a11-/-Yumm5.2 或Slc7a11-/-B16-F10 肿瘤细胞接种到Acod1-/-和Acod1+/+小鼠体内。不出所料，Slc7a11-/-肿瘤的进展在Acod1-/-和Acod1+/+小鼠之间不再有差异（图5G和5H）。为了进一步证实衣康酸在体内的作用 ，作者在Acod1+/+小鼠的 Yumm5.2 肿瘤间质液中检测到了比Acod1-/-小鼠高 3 倍的衣康酸水平（图 5I）。
为了研究衣康酸在TME中的来源，作者分析了人类单细胞RNA-seq数据集，包括黑色素瘤和结直肠癌（CRC）。作者的分析发现，巨噬细胞在人类TME中表达了最高水平的ACOD1。为了在实验中检验巨噬细胞衍生的衣康酸在肿瘤模型中的作用，作者通过将LysM-Cre 小鼠与Acod1基因缺失小鼠进行繁殖，产生了巨噬细胞特异性Acod1基因敲除小鼠（Acod1LyzKO）。作者观察到，与 WT 小鼠相比，Acod1LyzKO小鼠的肿瘤进展有所减缓（图 5J 和 5K），这与Acod1-/-小鼠的肿瘤进展情况一致（图 5A-5C）。这些数据表明巨噬细胞衍生的衣康酸在体内起着关键的原癌作用。为了直接检验巨噬细胞衍生的衣康酸对肿瘤细胞的影响，作者用骨髓衍生巨噬细胞的培养基培养 B16-F10 肿瘤细胞。与正常培养基相比，巨噬细胞条件培养基能强烈保护Slc13a3OEB16-F10 细胞免于 RSL3 诱导的铁死亡（图 5L）。然而，这种保护作用在Slc13a3-/-B16-F10 细胞中消失了。因此，巨噬细胞是TME中衣康酸的主要来源，而肿瘤SLC13A3吸收TME中TAM衍生的衣康酸，通过衣康酸诱导的肿瘤铁死亡抗性使肿瘤进展。
实验结果6
SLC13A3 抑制剂可治疗 ICB 耐药性肿瘤并使肿瘤铁死亡敏感化
为了颠覆肿瘤对衣康酸-SLC13A3 轴介导的铁死亡的抵抗，作者探索了衣康酸的结构模拟物，它们可能会竞争性地阻止衣康酸通过 SLC13A3 输入。SLC13A3 的结构尚未确定。根据 SLC13A5 与其配体 PF2 复合物的晶体结构（PDB:7JSJ ），作者在分子操作环境（MOE）中计算构建了 SLC13A3 的同源模型。根据该模型，基于衣康酸亚结构的搜索在 eMolecules 数据库中发现了 460 个 SLC13A3 的潜在配体：https://www.emolecules.com/，用于分子对接到同源模型中，并处理生成精炼的姿势和分数以进行排名。根据与同源模型的分子对接，作者生成了细化的构象和分数，并对这些潜在配体进行了排名。作者测试了排名前 10 的配体（衣康酸类似物）逆转衣康酸诱导的 Yumm5.2 细胞铁死亡抗性的潜力。在这些配体中，2-（3-甲基苄基）琥珀酸逆转衣康酸诱导的 Yumm5.2Slc13a3OE细胞铁死亡抗性的能力最强（图 6A）。作者指定 2-（3-甲基苄基）琥珀酸为 SLC13A3 抑制剂（SLC13A3i）。SLC13A3 的潜在结合位点在 SLC13A3 的对接模型中得到了说明（图 6B）。转运体检测证实，SLC13A3i 以剂量依赖的方式抑制了13C5 标记的衣康酸的输入（图 6C）。在Slc13a3OEYumm5.2 细胞中，SLC13A3i 强力逆转了衣康酸诱导的细胞对厄拉斯汀的死亡抵抗（图 6D），但不影响Slc13a3-/-Yumm5.2 细胞，并以剂量依赖的方式抑制了衣康酸诱导的 SLC7A11 表达。作者进一步研究了 SLC13A3i 对体内肿瘤进展的影响。用 SLC13A3i 治疗可抑制（Slc13a3+/+ ）WT（Acod1+/+ ）C57/BL6 小鼠的 B16-F10 肿瘤进展（图 6E）。有趣的是，用SLC13A3i治疗未能抑制WT（Acod1+/+ ）C57/BL6小鼠的Slc13a3-/-B16-F10肿瘤进展，也对Acod1-/-小鼠的Slc13a3+/+B16-F10肿瘤进展没有影响。最后，作者评估了SLC13A3i治疗是否能使B16-F10肿瘤对抗PD-L1单克隆抗体（mAb）治疗敏感。在以对单一 ICB 治疗反应有限而著称的 B16-F10 肿瘤模型中，作者发现 SLC13A3i 和抗-PD-L1 的联合治疗比单一治疗或对照组能产生更好的肿瘤抑制效果（图 6F）。此外，联合疗法还能产生强大的T细胞应答，这一点从TME中大量的IFNγ+ CD8+T细胞可以看出（图6G）。为了进一步支持 SLC13A3i 靶向肿瘤细胞，作者研究发现，无论是否使用衣康酸，SLC13A3i 对体外活化的 CD8+T 细胞中 IFNγ+的表达都没有影响。
为了评估 SLC13A3i 的耐受性和生物安全性，作者给 C57/BL6 小鼠单独或与抗 PD-L1 mAb 联合使用了高剂量的 SLC13A3i。在这些条件下，治疗组和对照组的小鼠体重和主要器官重量都保持稳定。血液学参数没有显示毒性迹象。然而，作者观察到，在用 SLC13A3i 和 IgG 治疗的五只小鼠中，有两只小鼠的平均血小板计数增加，胃黏膜下层、黏膜和胰腺导管周围有局灶性粒细胞（嗜酸性粒细胞和中性粒细胞）浸润，但没有任何组织破坏。这些发现并不表明存在毒性，因为血小板计数仍在生理范围内，啮齿动物胃中偶尔会观察到局灶性嗜酸性粒细胞浸润，这只是一种背景发现。在使用 SLC13A3i 和抗 PD-L1 mAb 治疗的小鼠中没有发现类似情况，这进一步支持了上述解释。因此，SLC13A3i 的抗肿瘤作用依赖于肿瘤 SLC13A3 和宿主衣康酸。这些数据表明，SLC13A3i 有可能作为一种单一疗法和/或与 ICB 联合使用，以增强肿瘤对 ICB 的反应。
