Chestnut Studying
摘要
Epidemiological studies have revealed an inverse relationship between the incidence of Alzheimer’s disease (AD) and various cancers, including colorectal cancer (CRC). We aimed to determine whether the incidence of CRC is reduced in AD-like mice and whether gut microbiota confers resistance to tumorigenesis through inducing inflammatory tolerance using 16S ribosomal RNA gene sequencing and fecal microbiota transplantation (FMT). AD-like mice experienced a significantly decreased incidence of CRC tumorigenesis induced by azoxymethane–dextran sodium sulfate as evidenced by suppressed intestinal inflammation compared with control mice. However, FMT from age-matched control mice reversed the inhibitory effects on the tumorigenesis of CRC and inflammatory response in AD-like mice. The key bacterial genera in gut microbiota, including Prevotella, were increased in both the AD-like mice and in patients with amnestic mild cognitive impairment (aMCI) but were decreased in patients with CRC. Pretreatment with low-dose Prevotella-derived lipopolysaccharides (LPS) induced inflammatory tolerance both in vivo and in vitro and inhibited CRC tumorigenesis in mice. Imbalanced gut microbiota increased intestinal barrier permeability, which facilitated LPS absorption from the gut into the blood, causing cognitive decline in AD-like mice and patients with aMCI. These data reveal that intestinal Prevotella-derived LPS exerts a resistant effect to CRC tumorigenesis via inducing inflammatory tolerance in the presence of AD. These findings provide biological evidence demonstrating the inverse relationship between the incidence of AD and CRC.
流行病学研究表明，阿尔茨海默病（AD）的发病率与包括结直肠癌（CRC）在内的各种癌症之间存在反比关系。我们的目的是利用 16S 核糖体 RNA 基因测序和粪便微生物群移植（FMT）来确定类 AD 小鼠的 CRC 发病率是否会降低，以及肠道微生物群是否会通过诱导炎症耐受性来赋予肿瘤发生的抵抗力。与对照组小鼠相比，AD-like小鼠在偶氮甲烷-葡聚糖硫酸钠诱导下的CRC肿瘤发生率明显降低，这体现在肠道炎症受到抑制。然而，来自年龄匹配的对照组小鼠的 FMT 逆转了对类 AD 小鼠 CRC 肿瘤发生和炎症反应的抑制作用。肠道微生物群中的关键菌属，包括普雷沃特氏菌，在类注意力缺失症小鼠和失忆性轻度认知障碍（aMCI）患者中都有所增加，但在 CRC 患者中却有所减少。用低剂量普雷沃茨菌衍生的脂多糖（LPS）进行预处理可诱导体内和体外的炎症耐受性，并抑制小鼠的 CRC 肿瘤发生。肠道微生物群失衡会增加肠道屏障的通透性，从而促进 LPS 从肠道吸收进入血液，导致 AD 样小鼠和 aMCI 患者的认知能力下降。这些数据揭示了肠道普雷沃氏菌衍生的 LPS 在 AD 存在的情况下通过诱导炎症耐受性对 CRC 肿瘤发生具有抵抗作用。这些发现提供了生物学证据，证明了AD和CRC发病率之间的反比关系。
实验结果1
AD-Like小鼠对AOM/DSS诱导的CRC肿瘤发生具有显著抵抗力
为了获得 AD 与 CRC 之间反向关系的直接实验证据，用 AOM/DSS 处理 6 个月大的 AD 样 SAMP8 小鼠和 6 个月大的对照组 SAMR1 小鼠。10 周后（图 1A），AOM/DSS-SAMP8 组建立 CRC 模型的成功率明显降低（图 1B）。SAMR1 组和 SAMP8 组小鼠的结肠长度都有所缩短，但与 SAMR1 组相比，SAMP8 组小鼠的缩短程度有所减弱（图 1C和D）。AOM/DSS 处理后，在 SAMR1 小鼠的远端结肠中观察到肿瘤结节，而与 SAMR1 小鼠相比，SAMP8 小鼠的肿瘤生成（图 1C）在肿瘤数量和体积（图 1D）方面均有所减少。一个值得注意的发现是，与对照组 6 个月大的野生型（WT）C57BL6n 小鼠相比，在另一种转基因 AD 小鼠模型--6 个月大的 5× FAD 小鼠中也观察到了对 AOM/DSS 诱导的 CRC 肿瘤发生的抵抗力，表现为肠道长度增加、肿瘤数量和体积减少以及脾脏重量减轻。这些数据提供了支持AD与CRC肿瘤发生成反比关系的主要证据。
SAMP8 模型是一种自发的加速衰老品系，其特征是类似于 AD 的进行性认知衰退。行为测试表明，9 个月大的 SAMP8 小鼠存在认知功能障碍。在莫里斯水迷宫（MWM）试验中，9龄SAMP8小鼠在5天的学习试验中找到平台的延迟时间比9龄SAMR1小鼠长，但游泳速度没有显著差异。第 6 天，当提供平台时，SAMP8 小鼠的游泳距离和持续时间都显著增加，而当移除平台时，SAMP8 小鼠在平台象限内的平台穿越次数和持续时间显著减少。免疫荧光结果显示，与 9 个月大的 SAMR1 小鼠相比，9 个月大的 SAMP8 小鼠海马 CA3（cornu amoni 3）区淀粉样前体蛋白和磷酸化 tau 蛋白的水平明显升高。此外，与 9 个月大的 SAMR1 小鼠相比，在 9 个月大的 SAMP8 小鼠海马齿状回区域观察到显著的斑块形成（刚果红染色）和 CA3 区域散布的大量神经纤维缠结（甘氨酸银染色）。这些数据证实，与年龄匹配的 SAMR1 小鼠相比，9 个月大的 SAMP8 小鼠存在认知缺陷和类似于 AD 的标志性病变。
实验结果2
AD-Like小鼠对AOM/DSS诱导的病理变化表现出明显的抵抗力，肠道炎症受到抑制
HE 染色显示，AOM/DSS处理后，9月龄的SAMR1小鼠和9月龄的SAMP8小鼠都观察到了CRC肿瘤发生的特征，即肠道粘膜腺体紊乱和大量炎性细胞浸润（图1E）。然而，与SAMR1组相比，SAMP8组在AOM/DSS处理后，按照Jin等人的描述进行评分，发现紊乱腺体数量减少，炎性细胞浸润量减少（图1F和G）。这些数据表明 SAMP8 小鼠的增生和炎症受到了抑制。与此相反，按照 Wei 等人的方法进行评分，在 AOM/DSS 处理后，SAMR1 和 SAMP8 小鼠的 Ki67 染色强度均显著增加。然而，SAMP8 组的升高有所减弱（图 1E和H），这表明 SAMP8 小鼠结肠组织中的细胞增殖受到抑制。虽然在 AOM/DSS 处理后，SAMR1 和 SAMP8 小鼠结肠组织中裂解的 Caspase 3 的染色强度都明显下降，但 SAMP8 小鼠的下降幅度小于 SAMR1 小鼠（图 1E和I），这表明 SAMP8 小鼠的结肠组织在 AOM/DSS 处理后更容易发生凋亡。这些病理表现在6月龄的5×FAD和WT小鼠中也得到了证实。
AOM/DSS 诱导的 CRC 肿瘤发生伴随着促炎细胞因子的释放。AOM/DSS处理后，IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平显著升高，但与9月龄SAMR1组相比，9月龄SAMP8组的升高幅度有所减弱（图1J）。各组间未检测到 IFN-γ mRNA 的明显变化（图1J）。与 SAMR1 组相比，SAMP8 组小鼠的 AOM/DSS 引起的脾脏肿大明显减轻（图 1K）。这些数据表明，AOM/DSS 诱导的细胞增殖和肠道炎症水平升高的病理特征在 AD 样小鼠中得到了抑制。
实验结果3
正常小鼠的FMT可减轻AD-Like小鼠对AOM/DSS诱导的肿瘤发生和炎症反应的抵抗力
为了探索肠道微生物群是否在小鼠 AD 与 CRC 肿瘤发生之间的反比关系中发挥作用，在用 AOM/DSS 处理 SAMP8 小鼠之前，先将 3 mo-old SAMR1 小鼠与 3 mo-old SAMP8 小鼠进行 FMT（图2A）。在进行 FMT 之前，先对 3 mo-old SAMP8 小鼠进行为期 3 d 的抗生素鸡尾酒干预，以清除肠道微生物群。通过 16S rRNA 基因测序分析，发现抗生素鸡尾酒干预后肠道微生物群的组成（α 和 β 多样性）在统计学上有显著差异。然而，两组小鼠的体重均未发现明显差异。这些结果表明，3 个月的 FMT 显著减弱了 6 个月大的 SAMP8 小鼠的肿瘤发生抵抗力，表现为 AOM/DSS 处理后 CRC 肿瘤发生增加（图 2B），结肠长度减少（图 2C和D），肿瘤数量和体积增加（图 2D）。
来自年龄匹配的 SAMR1 小鼠的 FMT 增加了 9 月龄 AOM/DSS 处理的 SAMP8 小鼠结直肠组织的炎症、增生评分和细胞增殖（图 2E-H）。然而，在 SAMP8 组和 SAMP8-FMT 组之间，未发现裂解的 Caspase 3 水平有明显差异（图 2E和I）。FMT 还增加了 9 月龄 AOM/DSS 处理小鼠结直肠组织中 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的 mRNA 水平（图 2J），但两组间的 IFN-γ 水平（图 2J）或脾脏重量（图 2K）没有发现明显差异。相比之下，行为实验表明，FMT 可改善 6 月龄 SAMP8 小鼠（图 2L-O ）和 6 月龄 5× FAD 小鼠的认知功能障碍。
有趣的是，移植经高温高压（HTHP）处理的来自年龄匹配的SAMR1小鼠的粪便菌群也会加重AOM/DSS诱导的6月龄SAMP8小鼠CRC病理特征和炎症反应（图2），这与AOM/DSS-FMT组的结果一致。这些数据表明，移植健康对照小鼠的粪便微生物群可以逆转对AD样小鼠CRC肿瘤发生的抑制作用，这表明肠道微生物群在AD与CRC的反向关系中起着至关重要的作用。
在 C57 和 5×FAD 小鼠中进行的双向（互惠）FMT 实验结果表明，抗生素治疗不会引起表型变化。当 7 个月大的 C57 小鼠移植 7 个月大的 5× FAD 粪菌（AOM/DSS-FMT-WT）时，与相应的模型组（AOM/DSS-WT）相比，它们的 CRC 病理学指标有所下降。相反，与相应的模型组（AOM/DSS-5× FAD）相比，移植了 C57 粪便细菌的 5× FAD 小鼠（AOM/DSS-FMT-5× FAD）的 CRC 病理学指标有所加重。9 个月大的 SAMR1 和 SAMP8 小鼠的双向 FMT 实验也显示了类似的结果。
实验结果4
普氏菌和拟杆菌是 AD 与 CRC 之间反向关系的关键候选菌，其机制涉及 LPS 生物合成途径
为了筛选出与 AD 和 CRC 相关的关键候选菌属，作者对类似 AD 的小鼠和 aMCI 或 CRC 患者进行了 16S rRNA 基因测序。在 6 个月大的 SAMP8/SAMR1 小鼠和 aMCI 或 NCs 患者样本中，肠道细菌的总操作分类单元被注释为 16 个菌门。结果发现，在类 AD 小鼠和 aMCI 患者中，固缩菌、类杆菌和蛋白菌是最重要的三个菌门，占肠道微生物群的 90% 以上。SAMP8小鼠和SAMR1小鼠的α-多样性，包括香农多样性指数、观察物种指数和信仰系统发育多样性（PD）指数，没有显著差异。虽然 NCs 和 aMCI 患者的香农多样性指数和观察物种指数都没有差异，但 Faith 的 PD 指数却有显著差异（P< 0.05）。关于β多样性，Adonis分析显示，来自SAMR1或SAMP8小鼠的样本在组内有聚集趋势。在 SAMR1 组和 SAMP8 组之间，以及 NC 组和 aMCI 组之间，发现了明显的分布差异。
线性判别分析（LDA）效应大小（LEfSe）分析用于筛选不同组间的不同细菌属。LEfSe 的阈值设定为 LDA > 4，P< 0.05。在科一级，6 个月大的 SAMP8 小鼠（图 3A）和 aMCI 患者（图 3B）与 SAMR1 小鼠和 NCs 相比，f-类杆菌科（f -Bacteroidaceae）和f-前鞭毛 菌科（f-Prevotellaceae）的相对丰度分别显著增加。在属的水平上，在 SAMP8 小鼠（图 3A）和 aMCI 患者（图 3B）中也观察到g拟杆菌和g 普氏菌的相对丰度增加。
利用肠道微生物群数据库（GMrepo）分析了NCs和CRC患者粪便中与AD相关的肠道微生物群。结果发现，CRC 患者体内拟杆菌和普氏菌的相对丰度明显低于 NCs（图3C）。对AOM/DSS-SAMP8和AOM/DSS-FMT小鼠粪便的LEFSe分析表明，与AOM/DSS-SAMP8组相比，AOM/DSS-FMT组中g-拟杆菌的相对丰度明显降低，但g-拟杆菌的相对丰度并未降低（图3D）。扩增子序列变异水平分析也显示了相同的结果（图 3G和H）。这些数据进一步支持了拟杆菌和普氏菌在 CRC 与 AD 的反向关系中的关键作用。
将 16S rRNA 数据映射到京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路，并根据每个样本中各代谢通路的丰度分布预测肠道微生物群的代谢特征。与 SAMR1 小鼠相比，SAMP8 小鼠的 LPS 生物合成、嘌呤代谢和氧化磷酸化代谢通路得到了加强（图 3E）。相比之下，在 aMCI 患者中富集的 KEGG 通路包括 LPS 生物合成、RNA 降解、氧化磷酸化和丙酸盐代谢（图 3F）。这些数据表明，拟杆菌或普氏菌衍生的 LPS 可能在 AD 与 CRC 的反比关系中发挥作用。
16S rRNA 基因测序结果显示，抗生素干预后，肠道微生物群的丰度显著下降，FMT 后受体的肠道微生物群组成接近供体。一个值得注意的发现是，就肠道微生物群和病理表型而言，1 个月的 FMT 与 3 个月的 FMT 产生了相同的效果。
实验结果5
普氏菌衍生的 LPS 预处理可诱导体内和体外炎症耐受性
CRC 的发病机制取决于炎症反应和促炎细胞因子的释放。为明确肠道微生物区系衍生的 LPS 对促炎细胞因子释放的影响，3 个月大的 C57BL/6n 小鼠腹腔注射不同细菌衍生的低剂量 LPS（0.1 毫克/千克）进行预处理。24 小时后，腹腔注射大肠杆菌衍生的高剂量 LPS（1 毫克/千克）作为刺激，持续 24 小时（图 4A），然后用酶联免疫法（ELISA）检测血清中炎症因子的浓度。结果显示，普氏菌衍生的 LPS 可显著降低大肠杆菌衍生的 LPS 大剂量刺激后血清中 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的水平（图 4B-D ）。
为了检测促炎细胞因子在预处理和 LPS 刺激过程中的动态变化，用不同细菌产生的低剂量 LPS（10 ng/mL）预刺激培养的外周血单核细胞（PBMCs）24 小时，然后暴露于大肠杆菌产生的高剂量 LPS（100 ng/mL）24 小时（图 4E）。检测 PBMC 培养液中 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 水平的动态变化（图 4F-H ）发现，普氏菌衍生的 LPS 预先刺激可有效降低 PBMC 暴露于高浓度大肠杆菌衍生的 LPS 刺激时的炎症反应。此外，在其他癌细胞系（SW1463，直肠癌细胞；MCF-7，乳腺癌细胞；NCM460，人肠上皮细胞）中也观察到了 LPS 预刺激对炎症的抑制作用。
为了探索不同细菌 LPS 结构和成分的差异，在大肠杆菌、拟杆菌和普氏菌的 LPS 中提取了 LPS 的核心抗原成分脂质 A。分析从不同细菌衍生的 LPS 中提取的脂质 A 的离子色谱图（XIC）发现，与从大肠杆菌衍生的 LPS 中提取的脂质 A 相比，从普氏菌衍生的 LPS 中提取的脂质 A 成分在保留时间轴上的峰面积不同（图4I）。这些结果表明，普氏菌衍生的 LPS 在体内和体外都能诱导炎症耐受。其潜在机制可能与不同细菌的 LPS 结构或成分不同有关。
实验结果6
肠道屏障渗透性的增加促进了 AD 型小鼠和 aMCI 患者肠道 LPS 向血液循环的泄漏
用于检测肠屏障完整性的阿尔新蓝染色显示，与 9 个月大的 SAMR1 小鼠相比，9 个月大的 SAMP8 小鼠体内粘液层的厚度和覆盖率明显降低。为了检测肠屏障的通透性，小鼠口服异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖。给小鼠注射 FITC 右旋糖酐 4 小时后，与 SAMR1 小鼠相比，SAMP8 小鼠的血清 FITC 荧光强度明显增加。同时，与 SAMR1 小鼠和 NCs 相比，SAMP8 小鼠和 aMCI 患者血清中的 LPS 水平也分别明显升高。这些结果表明，肠道微生物群失衡会增加肠道屏障的通透性，从而促进 LPS 从肠道吸收入血，导致 AD 样小鼠和 aMCI 患者的认知能力下降。
实验结果7
普氏菌衍生的 LPS 预处理同时导致小鼠认知功能障碍和 CRC 肿瘤发生阻力
为了研究普氏菌衍生的LPS是否在AD和CRC的反比关系中发挥作用，3月龄的SAMR1小鼠在饮用水中预处理不同细菌来源的LPS（5 μg/8 mL/d）4周（图5A）。当使用新物体识别测试（图 5B）、Y 迷宫（图 5C）和 MWM（图 5D）来检测认知功能时，发现与其他细菌来源的 LPS 相比，普氏菌来源的 LPS 会诱导 SAMR1 小鼠认知功能下降。为了确定普氏菌衍生的 LPS 如何影响认知功能，对 7 月龄小鼠的肠屏障完整性进行了测定（图5E）。结果表明，LPS 的预刺激可降低内粘液层的厚度和相对覆盖率。与其他 LPS 相比，普氏菌衍生的 LPS 对增加肠屏障的通透性有更显著的作用（图 5F）。此外，与对照组相比，发现普氏菌组的 LPS 浓度明显增加（图 5G）。
研究普氏菌衍生的 LPS 在 SAMR1 小鼠体内的预处理是否具有抗癌特性发现，与其他组相比，普氏菌衍生的 LPS 的预处理并未降低 CRC 肿瘤发生的成功率（图 5H和I ）。然而，7 个月大的普氏菌衍生 LPS 预处理小鼠的肿瘤数量和体积明显减少，结肠长度明显增加（图 5J）。免疫组化结果显示，普氏菌衍生的 LPS 预处理降低了 7 月龄 AOM/DSS 处理的 SAMR1 小鼠的 HE 染色法测量的炎症、HE 染色法测量的增生评分和 Ki67 染色法测量的结直肠组织细胞增殖（图 5K-N ）。表示细胞凋亡水平的裂解-Caspase 3 的表达明显增加（图 5K和O）。普氏菌衍生的 LPS 预处理也降低了 7 月龄 AOM/DSS 处理小鼠结直肠组织中 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 IFN-γ 的水平（图 5P），但未检测到脾脏重量的显著变化（图 5Q）。这些结果表明，普氏菌衍生的 LPS 可同时诱导小鼠认知能力下降和抑制 CRC 肿瘤发生。
在 5 个月大的转基因癌症小鼠模型 APC（min/+）中，也观察到了 LPS 预刺激对 CRC 病理表型的影响。然而，与对照组相比，虽然普氏菌衍生的 LPS 预刺激降低了肠道中 IFN-γ 和 TNF-α 等炎症因子的表达，但从结肠直肠长度、脾脏重量、肿瘤数量或大小来看，它对 APC（min/+）小鼠 CRC 的肿瘤发生并没有起到显著的预防作用。由于 APC（min/+）小鼠的结直肠基因已发生癌变，因此 APC（min/+）小鼠发生 CRC 并不是由炎症诱发的。因此，在转基因 CRC 模型中，普氏菌衍生的 LPS 预刺激对癌症预防的抗炎作用并不显著。
综上所述，这些数据支持普氏菌衍生的 LPS 在诱导认知功能障碍和 CRC 肿瘤发生抵抗中的关键作用。
