Chestnut Studying
摘要
Ferroptosis is a regulated form of necrotic cell death caused by iron-dependent accumulation of oxidized phospholipids in cellular membranes, culminating in plasma membrane rupture (PMR) and cell lysis. PMR is also a hallmark of other types of programmed necrosis, such as pyroptosis and necroptosis, where it is initiated by dedicated pore-forming cell death-executing factors. However, whether ferroptosis-associated PMR is also actively executed by proteins or driven by osmotic pressure remains unknown. Here, we investigate a potential ferroptosis role of ninjurin-1 (NINJ1), a recently identified executor of pyroptosis-associated PMR. We report that NINJ1 oligomerizes during ferroptosis, and that Ninj1-deficiency protects macrophages and fibroblasts from ferroptosis-associated PMR. Mechanistically, we find that NINJ1 is dispensable for the initial steps of ferroptosis, such as lipid peroxidation, channel-mediated calcium influx, and cell swelling. In contrast, NINJ1 is required for early loss of plasma membrane integrity, which precedes complete PMR. Furthermore, NINJ1 mediates the release of cytosolic proteins and danger-associated molecular pattern (DAMP) molecules from ferroptotic cells, suggesting that targeting NINJ1 could be a therapeutic option to reduce ferroptosis-associated inflammation.
铁死亡是一种受调控的坏死细胞死亡形式，由细胞膜中氧化磷脂的铁依赖性积累引起，最终导致质膜破裂（PMR）和细胞溶解。PMR也是其他类型程序性坏死（如焦亡和坏死性凋亡）的标志，它是由专用的孔形成细胞死亡执行因子启动的。然而，铁死亡相关的程序性坏死是否也由蛋白质主动执行或由渗透压驱动仍是未知数。在这里，我们研究了最近发现的焦亡相关 PMR 执行因子 ninjurin-1（NINJ1）的潜在铁死亡作用。我们报告说，NINJ1 在铁死亡过程中会寡聚，Ninj1 缺失会保护巨噬细胞和成纤维细胞免受铁死亡相关 PMR 的影响。从机理上讲，我们发现 NINJ1 对于铁死亡的初始步骤（如脂质过氧化、通道介导的钙离子流入和细胞肿胀）是不可或缺的。与此相反，NINJ1 对质膜完整性的早期丧失是必需的，质膜完整性的丧失发生在完全的 PMR 之前。此外，NINJ1 还介导铁死亡细胞释放细胞膜蛋白和危险相关分子模式（DAMP）分子，这表明靶向 NINJ1 可能是减少铁死亡相关炎症的一种治疗选择。
实验结果1
NINJ1 在铁死亡过程中寡聚
据报道，NINJ1 可执行大灾变 PMR，这是许多形式的溶解性细胞死亡的特征，其中包括焦亡、晚期细胞凋亡（继发性坏死）和毒素诱导的细胞死亡。NINJ1 激活的一个标志是其寡聚成不同大小和形状的质膜集合体。为了开始探索 NINJ1 是否会在铁死亡过程中执行 PMR，作者首先测试了氧化应激诱导剂 CuOOH 或 RSL3 和 ML162（抑制 GPX4 依赖性减少过氧化膜脂质）是否会诱导小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）的铁死亡。用 BODIPY™ 581/591 (C11-BODIPY)测量，受处理的 BMDMs 释放出 LDH，这是 PMR 和细胞裂解的常见指标（图1A-C），并显示出质膜脂质过氧化增加（图1D-F），BODIPY™ 581/591 是一种染料，其荧光发射峰在其多不饱和丁二烯基部分被氧化时发生位移。铁死亡特异性抑制剂 Ferrostatin-1（Fer-1）能清除烷氧基自由基，它能有效阻止裂解和脂质过氧化，证实 CuOOH、RSL3 和 ML162 能诱导 BMDMs 中的铁死亡（图1A-F）。针对脂质氢过氧化物的不同铁死亡抑制剂 Liproxstatin-1 也有效阻止了 LDH 的释放。
接下来，作者通过免疫荧光评估了这些铁死亡诱导剂处理后内源性 NINJ1 的寡聚化情况（图1G）。作者观察到，NINJ1 从均匀的质膜染色变为离散的质膜团块（或集合体）（图1G ，插图，箭头），这代表了 NINJ1 寡聚体。用诱导焦亡的 NLRP3 炎症小体激活剂尼革酶处理 BMDMs 时，也会形成类似的 NINJ1 寡聚体（图1G ，插图，箭头）。Fer-1 阻止了用铁死亡诱导剂处理的细胞中 NINJ1 组装的形成，但对尼日利亚菌素诱导的 NINJ1 组装没有影响，这证实了 NINJ1 的寡聚化需要铁死亡的启动。为了进一步证实 NINJ1 团簇代表寡聚体，作者在用 CuOOH、RSL3 或 ML162 处理的 WT BMDMs 中进行了交联试验（图1H-J ），这与之前在焦亡细胞中进行的试验相同。作者发现，铁死亡诱导后，NINJ1 形成了二聚体、三聚体、四聚体和更大的 n-聚体；而用 Fer-1 处理后，这些高阶寡聚体的形成强烈减少。相反，作者只在未处理的细胞中检测到单聚体和一些二聚体。重要的是，Fer-1 并没有直接阻断 NINJ1 的寡聚，因为它对尼日利亚菌素诱导的 NINJ1 寡聚没有影响。
接下来，作者通过在 HeLa 细胞中表达 C 端标记绿色荧光蛋白（GFP）的人 NINJ1（hNINJ1），并用 CuOOH 处理它们，检测 NINJ1 是否也会在人体细胞中寡聚。在未处理的细胞中，NINJ1均匀分布在质膜上，而在铁死亡诱导后则聚集在一起（图1K）。为了排除所有质膜蛋白在脂质过氧化和铁死亡诱导时聚集的可能性，作者还分析了表达标记有 GFP 的血凝素跨膜结构域（HATMD-GFP）的 HeLa 细胞（图1L）。CuOOH 处理后，HATMD-GFP仍定位于质膜，没有形成任何簇。此外，作者证实 HeLa 细胞在经 CuOOH、RSL3 或 ML162 处理后会发生细胞裂解，而 Fer-1 可阻止细胞裂解，但裂解程度低于巨噬细胞。总之，这些数据表明，在小鼠和人体细胞中诱导铁死亡会引发 NINJ1 寡聚成质膜聚合物，这种聚合物与之前在焦亡或凋亡细胞中观察到的 NINJ1 寡聚物相似。
实验结果2
缺乏 NINJ1 会导致铁性 BMDM 细胞溶解和 LDH 释放减弱
为了确定NINJ1是否有助于铁死亡细胞的PMR和细胞裂解，作者测量了用铁死亡诱导剂处理的WT和Ninj1-/-BMDM的LDH释放。缺失Ninj1 会显著减少 CuOOH、RSL3 或 ML162 处理时的 LDH 释放（图2A-C），但对 LDH 释放的基础水平或去垢剂诱导的裂解没有影响，这表明 NINJ1 在诱导 BMDMs 铁死亡时会导致 PMR。为了进一步证实 NINJ1 在铁死亡过程中控制 PMR，作者分析了用铁死亡诱导剂处理的 WT 和Ninj1-/-BMDMs 的形态（图2D）。作者发现两种基因型都出现了膜气泡并形成了较大的膜气球，这是发生坏死性细胞死亡的细胞的特征，如铁死亡或焦亡（图2D 箭头）。然而，铁突变的 WT 细胞在 5 小时后失去了气球形态，这表明它们经历了 PMR，而Ninj1-/-BMDMs 在同一时间点保留了气球形态。
最近，作者发现在焦亡过程中，NINJ1在濒死细胞的质膜上寡聚成分支状和丝状的集合体，并解析了丝状NINJ1的冷冻电镜结构。为了证实铁死亡相关 PMR 也需要 NINJ1 细丝的形成，作者用表达NINJ1WT、NINJ1K45Q 或NINJ1D53A 的载体逆转录转导Ninj1-/-BMDM。值得注意的是，残基 K45 和 D53 形成了重要的盐桥，稳定了 NINJ1 长丝中单个原体之间的相互作用，突变这些残基会完全破坏长丝在体外的形成。作者首先确认了 WT 和突变体 NINJ1 的表达水平相似，而且蛋白定位于质膜，然后分析了用 CuOOH 诱导铁死亡后的细胞裂解（图2E）。作者发现，表达NINJ1WT的 BMDM 在 CuOOH 处理 2 小时后释放的 LDH 水平明显高于载体对照，而表达NINJ1K45Q和NINJ1D53A的细胞释放的 LDH 水平与载体对照相当。此时的 LDH 水平与非转导对照相当（图2F）。这证实铁死亡相关的 PMR 需要 NINJ1 细丝的形成。
接下来，作者思考 NINJ1 的缺乏是否能保护铁突变细胞免于细胞死亡。通过测量经 CuOOH 处理的 WT 和Ninj1-/-BMDMs 中的 ATP 水平，作者发现两种基因型的细胞活力都以相似的动力学方式下降（图2G）。因此，NINJ1 的缺失并不能保护细胞免于死亡，这意味着细胞溶解并不是铁凋亡的原因，而是铁凋亡的结果之一。最后，作者确定了缺失NINJ1 能在多长时间内保护铁凋亡细胞不发生溶解。作者对 CuOOH 处理后 14 小时内的 LDH 释放进行了时间历程分析，结果表明，即使在晚期时间点，Ninj1-/-BMDM 也未能裂解（图2H），这与焦亡细胞中观察到的情况类似。总之，作者的结果表明，NINJ1 不仅在铁死亡过程中寡聚，而且是巨噬细胞中铁死亡相关 PMR 的原因。
实验结果3
铁死亡过程中由 NINJ1 驱动的细胞裂解与焦亡或坏死细胞死亡执行器无关
与许多常用于研究铁死亡的细胞系不同，BMDMs可在质膜完整性受到破坏时激活NLRP3炎性体通路。为了排除所观察到的 NINJ1 依赖性 PMR 是铁死亡诱导时 NLRP3 炎性体激活的结果，作者比较了 WT 和Nlrp3-/-BMDMs 经 CuOOH、RSL3 或 ML162 处理后 LDH 的释放。Nlrp3-/-BMDMs在铁死亡诱导后显示出与WT BMDMs相当的LDH释放水平，从而证明铁死亡细胞裂解不需要NLRP3炎性体。此外，作者还研究了缺乏GSDMD和GSDME的BMDMs，前者在炎性caspases下游被激活并驱动NINJ1活化，后者在凋亡caspases下游诱导焦亡。Gsdmd-缺乏不会影响铁死亡诱导剂处理后的 LDH 释放水平。另一方面，缺失Gsdme 会诱导 ML162 处理后 LDH 释放的轻微减少，但不能与缺失Ninj1 相提并论（图2C）。最后，作者测试了坏死性凋亡诱导是否能解释 NINJ1 在铁凋亡 BMDMs 中的活化，因为 NINJ1 在经历这种细胞死亡形式的细胞中对 PMR 起部分作用。然而，无法启动（Ripk3-/-/Casp8-/- ）或执行坏死性凋亡（Mlkl-/- ）的 BMDMs 释放的 LDH 量与 WT BMDMs 相似。总之，这些数据排除了 CuOOH-、RSL3- 或 ML162- 处理的 BMDMs 中 NINJ1 的激活是由铁死亡触发器下游的另一种细胞死亡程序的激活引起的。
实验结果4
NINJ1 控制铁死亡诱导的成纤维细胞溶解
迄今为止，大多数报道都显示了 NINJ1 在巨噬细胞中的作用，但它在其他细胞类型中的作用基本上仍未得到验证。因此，作者利用 CRISPR/Cas9 基因打靶技术生成了不同的Ninj1 基因缺陷细胞系，并在不同浓度的铁死亡激活剂作用下进行了 LDH 动力学分析。作者观察到，用 CuOOH 处理 RSL3 和 ML162Ninj1 基因缺陷的 NIH/3T3 细胞（鼠胚胎成纤维细胞）时，LDH 释放量明显减少（图3A、B）。同样，作者发现Ninj1 缺失会减少 MEFs（小鼠胚胎成纤维细胞）在不同浓度的三种铁死亡诱导剂处理下的细胞裂解（图3C,D）。有趣的是，作者发现缺失 NINJ1 只导致 RAW264.7 巨噬细胞的细胞裂解轻微减少（图3E、F），这与之前的报告一致。相比之下，BMDMs 在一定浓度的铁死亡激活剂作用下，细胞裂解几乎完全依赖于 NINJ1。这些结果表明，NINJ1 在几种不同类型的细胞中都是必不可少的，但它们也揭示了 NINJ1 对细胞裂解的重要性因未知因素而存在很大差异。值得注意的是，根据细胞类型的不同，每种激活剂诱导细胞裂解的动力学也不同。
实验结果5
在铁死亡过程中，NINJ1 在脂质过氧化和Ca2+流入的下游被激活
铁死亡的一个标志是质膜中脂质过氧化物的生成，随后是细胞膜Ca2+水平的升高、细胞变圆和膜完整性的丧失。为了确定这些步骤中哪些依赖于 NINJ1，作者用 BODIPY™ 581/591 C11 对 WT 或Ninj1-/-BMDMs 进行染色，然后不对其进行处理或用 CuOOH +/- Fer-1 对其进行处理，然后在处理后的不同时间点对氧化 BODIPY（BODIPYOx）阳性细胞的百分比进行量化。在 WT 或Ninj1-/-BMDMs 中，CuOOH 在处理后 30 分钟内诱导BODIPYOx 阳性细胞的增加，并在之后的时间点保持这种增加（图4A、B），这表明在铁变态反应细胞中，NINJ1 在脂质过氧化的下游发挥作用。用 RSL3 或 ML162 处理的细胞也得到了类似的结果（图4C、D）。
最近的报告显示，脂质过氧化之后，质膜对一价和二价阳离子 Na+、K+ 和Ca2+ 的通透性增加，这在细胞裂解之前发生。这些离子通量部分是由机械敏感性质膜通道（如 Piezo-1 和 TRP 通道）的开放介导的。因此，作者通过使用荧光钙探针 Fluo-8 AM（一种细胞内染料，与钙结合后荧光增加）测量 WT 和Ninj1-/-BMDMs 中的Ca2+流入量，研究NINJ1是否有助于铁死亡相关的离子通量，或者NINJ1是否在离子通量的下游被激活。CuOOH 处理增加了两种基因型的 Fluo-8 信号，其动力学相似（图4E），表明 NINJ1 对通道开放没有影响。然而，作者观察到，WT 细胞的 Fluo-8 信号在处理后 90 分钟左右达到峰值并迅速下降，而Ninj1-/-BMDMs 的 Fluo-8 信号在更高水平和更晚的时间点达到峰值，这很可能是因为Ninj1 缺陷细胞保持膜完整性的时间更长。总之，这些实验表明，脂质过氧化和膜通道开放引起的钙离子流入等早期铁变态反应事件与 NINJ1 无关。
实验结果6
铁死亡诱导的膜渗透需要 NINJ1
铁死亡包括在脂质过氧化和Ca2+流入的下游形成以蛋白质或脂质为基础的纳米孔，这最初会导致质膜完整性（PMI）丧失（通过 DNA 结合染料的吸收来测量），并在后期导致细胞裂解（即 LDH 释放）。作者思考 NINJ1 是否会形成这些纳米孔，它是否会控制这两个事件，或者是否有其他蛋白质会导致 NINJ1 上游的 PMI 损失。这类似于 GSDMD 孔，它们本身不能引起 PMR，但能促进小的膜不渗透 DNA 结合染料的吸收，如 PI（668 Da）或 DRAQ7（400 Da）。
因此，作者比较了 NINJ1 在焦亡和铁亡 BMDMs 的 PI 摄取中的作用。用炎性体激活剂尼日利亚菌素处理后，WT 细胞和Ninj1-/-细胞的 PI 摄取量相当（图5A ），这与之前的报道一致，这些报道显示 GSDMD 孔足以诱导 PMI 的缺失。相比之下，作者发现Ninj1 缺失会延迟用不同浓度的 CuOOH、RSL3 或 ML162 处理的 BMDM 对 PI 的吸收（图5B-D）。同样，显微镜分析表明，CuOOH 处理的Ninj1-/-BMDMs 中 PI 阳性细胞水平降低。缺失Ninj1 也会延迟 CuOOH、RSL3 或 ML162 处理的 MEFs 对 PI 的吸收，这表明这种效应并不局限于巨噬细胞。同样，Ninj1 缺陷的 NIH/3T3 和 RAW 264.7 细胞对 PI 的吸收也有延迟。在所有情况下，Fer-1 处理都会减弱 PI 摄取，这证实了 PMI 的丧失是由铁死亡诱导驱动的。之前的工作表明，即使在没有 NINJ1 的情况下，GSDMD 孔也能介导焦亡 BMDMs 释放小型荧光葡聚糖。因此，作者给 WT 或Ninj1-/-BMDMs 预装了荧光葡聚糖（3 kDa 葡聚糖，Alexa Fluor™ 488），并测量了铁死亡诱导后葡聚糖阳性细胞的下降情况。该分析表明，在铁死亡诱导后，WT BMDMs 释放 3 kDa 右旋糖酐的速度快于Ninj1-/-BMDMs（图5E-G ），进一步证明了 NINJ1 是铁死亡细胞中质膜完整性丧失的驱动因素。
接下来，作者用CuOOH处理表达NINJ1-GFP的HeLa细胞，并在膜完整性标记物DRAQ7存在的情况下，探究NINJ1寡聚与膜完整性丧失之间的关系。在活细胞中，NINJ1均匀分布在质膜上（图5H），经 CuOOH 处理后迅速聚集，这是由质膜 hNINJ1-GFP 信号的定量不均匀性分析确定的（图5I）。有趣的是，在不均匀性分析中，NINJ1 的寡聚先于 DRAQ7 的流入约 10-20 分钟，这与作者之前在焦亡细胞中观察到的情况截然不同，在焦亡细胞中，NINJ1 的寡聚和 DRAQ7 的流入是同时发生的。这再次支持了这样一种观点，即在焦凋亡细胞中，NINJ1 本身会导致膜完整性丧失，而在焦凋亡细胞中，膜完整性丧失是 GSDMD 孔形成的结果。
为了证实聚类不是铁变态细胞中质膜蛋白的一般特征，作者还分析了表达HATMD-GFP 的 HeLa 细胞（图5J）。虽然作者没有观察到铁死亡诱导后HATMD的任何聚集，但作者发现 DRAQ7 的摄取以比表达 NINJ1-GFP 的 HeLa 细胞更慢的动力学进行。DRAQ7 的这种差异很可能是由于 NINJ1 的过表达加速了这些细胞膜完整性的丧失。总之，这些数据支持这样的结论，即在铁死亡过程中，NINJ1 的活化并不是 Gasdermin 样孔引起的质膜通透的结果，而是 NINJ1 本身在铁死亡过程中既导致了质膜完整性的丧失，又导致了随后的细胞破裂。
实验结果7
NINJ1 介导铁细胞释放 DAMPs
由于铁死亡的特点是在 PMR 时释放胞内内容物，作者的目的是确定以 NINJ1 依赖性方式释放的宿主蛋白质组（即铁死亡分泌组）的比例和特征。为此，作者采用了细胞培养中氨基酸稳定同位素标记（SILAC）技术，比较了CuOOH处理后WT和Ninj1-/-iBMDM上清液中的蛋白质。作者确保细胞裂解依赖于 iBMDMs 中的 NINJ1。在 WT 和Ninj1-/-细胞中，当将处理过的细胞与未处理过的细胞进行比较时，蛋白质富集度的分布都转向了大于零的值（图6A-I,A-II ），这表明两种基因型的细胞在诱导铁死亡时释放的蛋白质都增加了。然而，从Ninj1-/-iBMDMs 中释放的蛋白质总数低于从 WT 细胞中释放的数量，当直接比较 WT 处理细胞和Ninj1-/-处理细胞时，我们观察到富集值总体上向 WT 处理条件转移（图6AIII ，中位对数富集：1.347）。接下来，作者比较了处理过的 WT iBMDMs 与未处理过的 WT 或处理过的Ninj1-/-的富集情况，发现这两种情况之间有很强的相关性（Pearson R：0.70）。这表明从经 CuOOH 处理的Ninj1-/-细胞中释放的蛋白质特征与 WT 未处理的情况非常相似，这意味着 NINJ1 控制着铁细胞分泌组中大部分蛋白质的释放。
由于一些蛋白质仍在铁凋亡的Ninj1-/-iBMDMs 中释放，作者想知道它们的特性是否能解释它们以一种与 NINJ1 无关的方式释放。质量分布分析表明，与依赖 NINJ1 的分泌组的平均大小相比，不依赖 NINJ1 释放的蛋白质更小（图6B），这表明 NINJ1 的缺失对释放的整体大小造成了限制。此外，通过评估 GO 术语，我们发现，经 Chi-square 检验（图6C），NINJ1 依赖性分泌组更有可能与细胞外区室或细胞表面相关，而不是细胞内区室，如细胞骨架或细胞核。同样，作者发现不依赖 NINJ1 的分泌组与细胞因子等特定生物功能相关（图6D），而依赖 NINJ1 的分泌组与染色质修饰等细胞内功能相关。由于这表明以 NINJ1 依赖性方式释放的蛋白质大多是细胞膜或核蛋白质，作者研究了 NINJ1 依赖性 PMR 是否会释放通常已知的 DAMP。有趣的是，处理过的 WT 细胞中特异性地富集了一大部分描述良好的 DAMPs，包括 HMGB1、几种组蛋白、肌动蛋白相关蛋白和热休克蛋白（图6A），表明它们在铁死亡过程中的释放需要 NINJ1。接下来，作者将 CuOOH 处理过的 WT 和Ninj1-/-BMDMs 的上清转移到 WT BMDMs 上，发现Tnf和Il-1bRNA 水平上调，而 NINJ1 的缺失抑制了这种上调。总之，这一分析表明，铁质巨噬细胞的 DAMP 释放主要是通过 NINJ1 依赖性 PMR 进行的。
