Chestnut Studying
摘要
Necrotizing enterocolitis (NEC) involves intestinal epithelial damage and inflammatory response and is associated with high morbidity and mortality in infants. To improve therapeutic prospects, elucidating underlying molecular mechanisms of intestinal epithelial damage during NEC is of the essence. Poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1)-dependent parthanatos is a programmed inflammatory cell death. In the present study, the presence of parthanatos-associated proteins PARP1 and poly (ADP-ribose) (PAR), along with high expression of DNA damage-associated biomarkers, 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-OHdG) and phosphorylation of histone H2AX (γH2AX), were discovered in the intestinal tissues of NEC infants. Additionally, the upregulated expression of PARP1 and PAR in NEC intestinal tissues correlated distinctly with clinical indices indicative of NEC incidence and severity. Furthermore, we demonstrated that inhibiting the expression of parthanatos-associated proteins, by either pharmacological blockage using 3-aminobenzamide (3-AB), an inhibitor of PARP1, or genetic knockout using Parp1-deficient mice, resulted in substantial improvements in both histopathological severity scores associated with intestinal injury and inflammatory reactions. Moreover, in an in vitro NEC model, reactive oxygen species (ROS)-induced DNA damage promoted the formation of PAR and nuclear translocation of apoptosis-inducing factor (AIF), thus activating PARP1-dependent parthanatos in Caco-2 cells and human intestinal organoids. Our work verifies a previously unexplored role for parthanatos in intestinal epithelial damage during NEC and suggests that inhibition of parthanatos may serve as a potential therapeutic strategy for intervention of NEC.
坏死性小肠结肠炎（NEC）涉及肠上皮损伤和炎症反应，与婴儿的高发病率和高死亡率有关。为了改善治疗前景，阐明 NEC 期间肠上皮损伤的潜在分子机制至关重要。聚（ADP-核糖）聚合酶 1（PARP1）依赖性parthanatos是一种程序性炎症细胞死亡。本研究发现，在 NEC 婴儿的肠道组织中存在 parthanatos 相关蛋白 PARP1 和聚（ADP-核糖）（PAR），以及 DNA 损伤相关生物标志物 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG) 和组蛋白 H2AX 磷酸化（γH2AX）的高表达。此外，NEC 肠组织中 PARP1 和 PAR 的表达上调与 NEC 发病率和严重程度的临床指标明显相关。此外，我们还证明，通过使用 PARP1 抑制剂 3-aminobenzamide (3-AB) 进行药理阻断或使用Parp1 基因缺失小鼠进行基因敲除来抑制PARP1 相关蛋白的表达，可显著改善与肠道损伤和炎症反应相关的组织病理学严重程度评分。此外，在体外 NEC 模型中，活性氧（ROS）诱导的 DNA 损伤促进了 PAR 的形成和细胞凋亡诱导因子（AIF）的核转位，从而激活了 Caco-2 细胞和人肠器官组织中 PARP1 依赖性的 parthanatos。我们的研究验证了parthanatos在NEC过程中肠上皮损伤中的作用，并表明抑制parthanatos可作为干预NEC的一种潜在治疗策略。
实验结果1
NEC患儿肠道组织中存在parthanatos
为了确定NEC患儿是否激活了parthanatos，研究人员从NEC患儿或先天性肠闭锁患儿（作为对照组）中采集了肠道组织样本，并进行了H&E、TUNEL、免疫荧光染色和蛋白质印迹分析。首先，研究人员发现NEC患儿肠道结构发生了严重的形态学改变，上皮细胞死亡明显增加（图1A、B）。此外，免疫荧光染色结果显示，NEC肠组织中，Lgr5标记物（一种上皮干细胞标记物）所标识的绒毛顶部和底部，与对照组相比，parthanatos相关蛋白PARP1和PAR的表达水平均有所上升（p<0.01）（图1C-F）。NEC婴儿的肠组织切片也显示出肠上皮标志物E-cadherin的表达和定位紊乱（图1C、E）。与对照组相比，NEC婴儿肠组织中PARP1和PAR蛋白的表达水平显著升高（图1G、H）。此外，与对照组相比，NEC婴儿肠道上皮细胞中两种DNA损伤标记物8-OHdG和γH2AX的表达水平明显过高（图1I、J）。这些数据表明，NEC婴儿肠道上皮细胞中PARP1依赖性parthanatos被激活。
作者还确定了10名NEC患者和10名先天性肠闭锁患者的PARP1和PAR表达（图1G、H）与临床指标的相关性。杜克腹部评估量表（DAAS）是NEC诊断的辅助指标，与PARP1（R=0.794，P<0.001）和PAR（R=0.620，P=0.004）的表达水平呈正相关（图2A、I）。同样，NEC肠道组织中明显升高的肠道组织病理学严重程度评分与PARP1（R=0.819，p<0.001）和PAR（R=0.640，p=0.002）的表达水平呈正相关（图2B，J）。此外，PARP1（R = 0.840，p < 0.0010）和PAR（R = 0.616，p = 0.004）的蛋白表达水平与Bell分期呈显著正相关（图2C，K）。此外，NEC婴儿血清中C反应蛋白（CRP）和降钙素原（PCT）水平显著升高，也与PARP1的表达水平呈正相关（CRP：R=0.682，p<0.001；PCT：R= 0.762，p<0.001）和PAR（CRP：R=0.725，p<0.001；PCT：R=0.596，p=0.007）（图2D、E、L、M）。凝血相关指标凝血酶原时间（PT）与PARP1（R=0.529，p<0.018）和PAR（R=0.490，p=0.030）的表达水平呈适度正相关（图2F、 N），而活化部分凝血活酶时间（APTT）与PARP1（R=0.293，p=0.211）和PAR（R=0.257，p=0.274）的表达没有显著相关性（图2G，O）。相反，血小板数量与PARP1（R= −0.595，p= 0.007）和PAR（R= −0.638，p= 0.003）的表达水平呈显著负相关（图2H，P）。这些发现共同强调了NEC肠道组织中PARP1和PAR上调表达与NEC发病率或严重程度临床指标之间的相关性。
实验结果2
在实验性NEC期间，肠道上皮细胞中存在PARP1依赖性parthanatos
为了研究肠上皮细胞中parthanatos的存在及其在NEC中的潜在作用，作者接下来采用一种已建立的NEC小鼠模型，分析了NEC小鼠和对照小鼠肠道组织中parthanatos相关蛋白PARP1和PAR的表达。免疫荧光染色显示，与对照组小鼠相比，NEC小鼠的肠组织中PARP1和PAR的表达显著增加（图3A-D），这与NEC婴儿肠组织中PARP1和PAR的表达上调一致。作者进一步使用两种蛋白标记物，即上皮干细胞标记物Lgr5和上皮细胞标记物E-cadherin，发现PARP1和PAR的上调表达主要分布在NEC小鼠肠组织中绒毛的顶部和底部 ，如Lgr5标记，NEC小鼠的肠组织中，肠绒毛的结构受损和破坏，NEC小鼠中E-cadherin的表达和定位受损证明了这一点（图3A-D）。免疫印迹分析进一步证实，NEC诱导后肠组织中PARP1和PAR的蛋白表达显著增加（图3E-G），这与NEC婴儿的发现一致（图1G、H）。这些结果表明，在实验性NEC期间，肠上皮中存在PARP1依赖性parthanatos。
实验结果3
体内抑制 parthanatos 能够改善 NEC 引起的肠屏障损伤和炎症
作者接下来研究了parthanatos是否参与了实验性NEC过程中的肠上皮损伤，以及减弱parthanatos是否能防止NEC相关的肠屏障损伤和炎症。为此，小鼠腹腔注射了 PARP1 抑制剂 3-AB。免疫荧光染色显示，NEC 小鼠肠道组织中的 PARP1 和 PAR 上调，而服用 3-AB 后，NEC 增强的 PARP1 和 PAR 在肠绒毛顶部和底部的表达强烈减弱，Lgr5 证实了这一点（与 NEC 小鼠相比，p< 0.05，p< 0.01）（图4A-D ）。Western 印迹分析表明，使用 3-AB 治疗后，NEC 肠组织中副胰岛素相关蛋白 PARP1 和 PAR 的表达增加大大减弱（与 NEC 小鼠相比，p< 0.05，p< 0.01）（图4E-G ），这表明服用 3-AB 可抑制实验性 NEC 期间肠上皮细胞中副胰岛素的发生。
在证明实验性 NEC 期间肠上皮细胞中的 parthanatos 被激活后，作者接下来试图阐明它在 NEC 引发的肠屏障损伤和全身炎症中的潜在作用。为了评估实验性 NEC 期间与 parthanatos 相关的肠上皮损伤以及抑制 parthanatos 所提供的保护，作者使用Parp1基因敲除小鼠进行了实验（图5A）。建立 NEC 模型后，野生型小鼠的肠上皮组织显示出明显的损伤，包括肠绒毛排列紊乱、绒毛断裂和脱落以及肠粘膜下层和固有层不同程度的分离（图5B、C）。TUNEL 染色进一步显示，野生型小鼠发生 NEC 后，肠上皮细胞死亡明显增加（图5D、E）。值得注意的是，与野生型小鼠相比，Parp1 缺陷小鼠 NEC 诱导的肠上皮损伤得到了显著改善，表现为绒毛形态相对完整，没有明显的肠绒毛排列紊乱和断裂，肠道组织病理学严重程度评分显著降低（图5B、C），上皮细胞死亡明显减少（图5D、E）。上皮屏障破坏是 NEC 发病机制的关键原因之一。作者发现，Western 印迹分析显示，E-cadherin 和 β-catenin 这两种对维持肠屏障完整性和功能至关重要的蛋白在发生 NEC 的野生型小鼠回肠中的表达明显降低，而Parp1 缺陷小鼠则部分逆转了野生型小鼠中发生 NEC 的 E-cadherin 和 β-catenin 表达下调（图5F-H）。
炎症反应的激活是 NEC 的另一个重要特征。建立 NEC 模型后，野生型小鼠血浆中的 IL-6、TNF 和 MCP1 水平大幅升高；相比之下，Parp1 缺陷小鼠的 NEC 诱导的全身炎症反应减弱，血浆 TNF 和 MCP1 显著降低，但 IL-6 没有降低（图5I-K）。重要的是，Parp1 缺陷小鼠可防止 NEC 相关致死，存活率从野生型小鼠的 50% 显著提高到 81%（p< 0.05）（图5L）。此外，与野生型小鼠相比，Parp1 基因缺陷小鼠对 NEC 挑战的体重下降有所改善（图5M）。作者观察到实验性 NEC 诱导过程中表现出的一些临床特征，包括腹胀、呕吐和腹泻，值得注意的是，这些症状的严重程度在Parp1 缺陷小鼠中也有所减轻。总之，这些结果表明，抑制 parthanatos 可减轻肠上皮损伤和炎症反应，从而为 NEC 小鼠提供保护。
实验结果4
体外诱导 Caco-2 细胞和人体肠器官组织中的 NEC，诱导 parthanatos
作者利用体外 NEC 模型，让 Caco-2 细胞或人类肠道器官组织在缺氧和人类肠道细菌的作用下接受 6 小时或 12 小时的挑战，以评估副胰岛素的存在和 3-AB 的保护作用。与对照组 Caco-2 细胞相比，诱导 Caco-2 细胞发生 NEC 会导致 PARP1 和 PAR 的表达大幅增加（图6A-C），同时 Caco-2 细胞的细胞死亡显著增加，FACScan 分析显示 7-ADD 和 Annexin V 双阳性染色（图6D、E）。重要的是，用 MNNG（转运体的阳性诱导剂）处理 Caco-2 细胞会导致 PARP1 和 PAR 表达上调和大量细胞死亡，这与体外诱导 NEC 的 Caco-2 细胞的情况相同（图6A-E）。重要的是，用 3-AB 处理会强烈下调 PARP1 和 PAR 的表达，并减轻缺氧和人肠道细菌作用下的 Caco-2 细胞的细胞死亡（图6A-E）。
PARP1 的功能是 DNA 损伤传感器，当 DNA 受到过度损伤时，核 PARP1 会促进 PAR 的形成。反过来，PAR 从细胞核转位到细胞质和线粒体，并与线粒体中的 AIF 结合，从而促进 AIF 转位到细胞质和细胞核，这是发生副嗜酸性粒细胞增多症的关键步骤。免疫荧光染色证实了 AIF 在线粒体、细胞质和细胞核中分布的变化。具体而言，NEC 诱导时 PAR 表达上调，进入线粒体并与 AIF 结合，从而促进 AIF 转位至细胞核，最终导致人 NEC 肠组织细胞和 Caco-2 细胞死亡，而 3-AB 的干预可部分缓解这种情况（图6F）。此外，与对照组和 3-AB 处理的肠组织细胞不同的是，在 NEC 肠组织细胞和 3-AB 处理的 NEC 肠组织细胞中都观察到了不同程度的核凝结和溶解（图6F）。
接下来，作者从 Caco-2 细胞中分离出线粒体、细胞质和细胞核成分，并通过 Western 印迹分析进一步定量检测了 AIF 在线粒体、细胞质和细胞核亚细胞组分中的表达和分布。如图6G-L 所示，通过缺氧加人肠道细菌培养 6 小时诱导 Caco-2 细胞发生 NEC，大大降低了线粒体中 AIF 的表达，增强了细胞质和细胞核中 AIF 的表达，促进了 AIF 从线粒体向细胞质和细胞核的转位，而用 3-AB 处理则明显抑制了 AIF 在 NEC Caco-2 细胞中的核转位。此外，免疫荧光染色结果与线粒体、细胞质和细胞核中观察到的 AIF 分布变化相吻合。
实验结果5
ROS 诱导的 DNA 损伤可激活 NEC 处理的 Caco-2 细胞和人体肠道器官组织中的 parthanatos
为了在体外NEC模型中研究ROS参与DNA损伤激活的parthanatos，作者首先在不同时间点用缺氧和人肠道细菌挑战Caco-2细胞，并使用荧光探针DCF-DA通过FACScan分析测量细胞内ROS水平。与对照 Caco-2 细胞相比，在 NEC 挑战的 Caco-2 细胞中观察到细胞内 ROS 随时间而升高，在 6 h 达到峰值水平（p< 0.05，p< 0.01）（图7A，B）。此外，作者还监测了NEC诱导12 h内PARP1和PAR蛋白表达的动态变化，Western印迹分析表明，NEC诱导后，PARP1和PAR蛋白的表达水平先升高后降低，在NEC诱导后6 h达到峰值水平。已知细胞内 ROS 的增加会诱导不同类型细胞的 DNA 损伤，先前的研究表明 8-OHdG 和 γH2AX 是细胞 DNA 损伤的生物标志物，特别是 8-OHdG 是与 DNA 氧化损伤相关的标志物。如图 7C-E 所示，8-OHdG 和γ-H2AX 都与 DNA 氧化损伤有关。如图7C-E 所示，8-OHdG 和 γH2AX 在 NEC 挑战的肠道器官组织中均显著增加（与对照肠道器官组织相比，p< 0.01），而 NAC 的预处理大大减少了 NEC 诱导的 8-OHdG 和 γH2AX 的表达（与 NEC 肠道器官组织相比，p< 0.01）。重要的是，用 NAC 预处理 Caco-2 细胞可有效下调 NEC 增强的 PARP1 和 PAR 的表达（图7F-H）。Western 印迹分析和免疫荧光染色进一步显示，用 NAC 预处理可减少 NEC 诱导的 AIF 从线粒体的释放及其向细胞核的转位（图7I-N）。综上所述，这些结果表明，ROS 诱导的 DNA 损伤参与了 NEC 期间肠上皮细胞parthanatos 的发生。
