Science Immunology丨肺损伤后招募的非典型 Ly6G+巨噬细胞增强肺泡再生

IAV感染后早期恢复阶段出现Lung Ly6G+ Macs

    为了研究肺部损伤后骨髓细胞反应的动态，作者在IAV感染后肺部感染损伤的临床相关小鼠模型中进行了时间序列流式细胞术研究。将8至12周大的C57BL/6野生型（WT）小鼠鼻腔内感染5个形成斑块的单位（PFU）的IAV H1N1株PR8/34，从而引发自限性疾病，IAV感染后第5天病毒RNA达到峰值，第10天病毒清除。在该模型中，IAV感染后第5天，Ly6G+CD11b+CD64−中性粒细胞（Neus）数量增加，第15天恢复到基线水平（图1，A和B）。在感染流感病毒后的第5天至第10天，观察到部分Ly6G-CD64+SiglecF+CD11c+ AMs丢失，在第15天恢复，如前所述（图1，A和B）。CD64-Ly6C-单核细胞（Ly6C-Mos）的数量在感染过程中保持稳定，而经典的CD64-Ly6C+单核细胞（Ly6C+Mos）和炎症性CD64+Ly6C+单核细胞（iMos）的数量在感染后第5天左右达到峰值（图1，A和B）。与IMs（IM样）相似的Macs（IM样）定义为F4/80+CD11b+Ly6G−SiglecF−Ly6C−CD64+细胞，可能包括常驻IMs和募集的Mo-Macs，随着时间的推移而增加（图1，A和B）。作者还观察到，从第5天开始，出现了一群由IAV引发的Ly6G+CD11b+CD64+ Macs，它们属于经典的Ly6G+CD11b+ Neu门，但与Neus不同，因为它们CD64表达升高（图1，C和D），作者以后将其称为Ly6G+ Macs。血液中不存在Ly6G+ Macs（图1E），IAV感染后第10天在肺部达到峰值，IAV感染后第15天和第20天仍可检测到（图1D）。从形态学上看，在感染后第10天分析的Ly6G+ Macs细胞与iMos细胞一样，呈现出肾形核，并具有许多胞质空泡结构以及富含突起的细胞膜（图1F）。从表型上看，Ly6G+ Macs是F4/80hiSiglecFloCD11clo，并表达高水平的趋化因子受体CXCR4、II型主要组织相容性复合体（MHC-II）、CD101和CD319（Mac功能的调节因子）（图1，G和H）。然而，Ly6G+ Macs的Neu激活标记物CD177表达较低（图1，G和H）。

    接下来，作者对IAV感染后第10天的肺髓样细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析。从5只模拟感染小鼠和5只IAV感染小鼠中分离出肺CD45+F4/80+和/或CD11b+细胞，并对其进行单细胞液滴封装、scRNA-seq和质量控制过滤。将整理后的数据与已发表的稳态肺单核细胞和免疫细胞数据集整合，并绘制全局和特定条件下的统一流形逼近和投影（UMAP）图（图2A）。来自模拟感染小鼠的髓样细胞主要包括标记为AMs（Chil3、Ear1和Fapb1；C6）、Ly6C-Mos（Ace、Nr4a1和Fcgr4；C3）、Ly6C+ Mos（Ccr2和Ly6c2；C4）和树突状细胞（DCs；H2-Ab1、Cd209a和Flt3；C9）（图2，A至C）。在模拟感染的小鼠体内也检测到了少量循环 Mac（Birc5、Top2a 和 Mki67；C11），以及少量 CD206- IM（C1qa、C1qc、H2-Ab1、Cd74 和Tmem119；C1）以及CD206+ IMs（C1qa、C1qc、Mrc1和Maf；C8）（图2，A至C）。在感染IAV的10天后，AMs（C6）消失，取而代之的是一小群与IAV相关的AMs（Chil3、Ear1和Ear2；C12），Neus被招募（S100a8、S100a 9和Mmp9；C7），IM（C1和C8）和iMos（Ccr2、Ly6c2和Irf7；C5）扩张（图2，A至C）。值得注意的是，簇C2和C10是由IAV特异性触发的。C10的线粒体基因含量升高，检测到的基因数量较少，因此被标注为死亡的Macs。与其他群组相比，C2表达的蛋白酶（Ctsb和Ctsz）、半乳糖凝集素（Lgals1和Lgals3）、精氨酸酶-1（Arg1）和骨桥蛋白（Spp1）的水平显著升高（图2D）。通过细胞内流式细胞术对精氨酸酶-1和骨桥蛋白进行染色，结果显示这两种蛋白仅在感染IAV后第10天的Ly6G+ Macs中表达（图2，E和F），这支持了C2与流式细胞术鉴定的Ly6G+ Macs相对应的观点。值得注意的是，Ly6G+ Macs表达高水平的Csf1r和Slamf7（编码CD319），但未表达任何与Neu相关的转录物Csf3r、S100a8、S100a9、Mmp8、Mmp9、Mpo、Slpi或Cd177。在Neus或Ly6G+ Macs中无法检测到Ly6g转录物。Ly6G+ Macs (C2) 同时表现出“M1样”或“M2样”的特征分数和基因，无法根据其表达谱进行分类。作者的数据共同表明，在IAV感染后体重恢复的早期特定时间窗口内，会出现一组在表型和转录水平上均不同的Ly6G+ Macs。

Ly6G+ Macs源自募集的单核细胞，部分依赖于GM-CSF受体信号

    接下来，作者研究了Ly6G+巨噬细胞的起源，并探索它们是否可以通过局部增殖来扩张。作者观察到，在Ly6G+巨噬细胞中，Ki67增殖阳性细胞的百分比非常低。接下来，作者在小鼠腹腔注射IAV后的第10天，在分析前4小时用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）处理小鼠。虽然AMs中EdU+细胞的百分比高于所有其他肺髓样细胞，表明其处于活跃增殖状态，但Ly6G+ Macs中几乎没有检测到EdU+细胞，排除了其活跃增殖的可能性。第三，作者评估了Ly6G+ Macs是来自骨髓（BM）还是来自局部祖细胞单核细胞。作者制造了嵌合型小鼠，其中致命辐照、胸腔保护的CD45.2 WT小鼠由Ms4a3CreR26LSLtdTomato小鼠（以下称为Ms4a3tdTom）的骨髓细胞重建，其中粒细胞-单核细胞祖细胞（GMP）的后代被标记。移植后第4周，tdTomato+血液Ly6C+ Mos的比例约为50%，而tdTomato+肺AM和IM的比例非常低，这证实了有效的重建和胸腔保护。在感染IAV后的第10天，作者发现tdTomato+ Ly6G+ Macs的比例与Ly6C+ Mos的比例相似，这表明BM来源的GMP对Ly6G+ Macs的贡献最大，但不是局部祖细胞。

    IAV感染后Ly6G+ Mac的出现动力学与Ly6C+ Mos和iMos相似，但出现时间较晚，这符合招募的Ly6C+ Mos可以产生Ly6G+ Mac的观点。为支持这一观点，对scRNA-seq数据的Slingshot轨迹分析发现了两条主要轨迹，它们从Ly6C+ Mos开始，经过iMos，最终产生IM样细胞或Ly6G+ Macs（图3A）。在每条轨迹中，沿着伪时间呈现相同下调模式的基因包括经典的单核细胞相关基因Ccr2和Ly6c2（图3B）。作者还发现，在这两个轨迹中，干扰素刺激基因（Ifi209、Ifitm3、Ifi47和Isg15）的时间限制上调可能与过渡性iMos相对应（图3B）。最后，在IM样（例如C1qa、C1qc、C1qb、Mrc1、Cd74、H2- Ab1和H2-Eb1）或Ly6G+ Mac（如Arg1、Spp1、Ccl2、Ccl7和Ctsb）轨迹（图3B）中，轨迹特异性基因逐渐且特异性地沿着假时间上调。

    接下来，作者用IAV感染了单核细胞命运追踪小鼠Ms4a3tdTom 和Cx3cr1GFP，发现IAV感染后第10天，Ly6G+ Macs分别成为Tomato+和GFPhi，与它们源自GMP的单核细胞来源一致（图3，C和D）。为了研究Ly6G+ Macs对Ccr2依赖性BM来源的Ly6C+ Mos的依赖性，作者构建了BM竞争性嵌合体，其中致命辐照的CD45.1/CD45.2 WT小鼠被1:1混合的CD45.2 Ccr2−/−和CD45.2 Ms4a3tdTom BM细胞植入。重组后第4周，大多数血液中的Ly6C+ Mos都来自供体Tomato+，正如预期的那样。在感染IAV后的第10天，大多数Ly6G+ Mac也来自供体Ms4a3tdTom，表明它们依赖于Ccr2（图3、E和F）。

    接下来，作者试图评估Ly6G+ Mac的命运和寿命。IAV感染后有限时间内Ly6G+ Mac的大量存在表明它们可能寿命较短。与此相符的是，图3A中的轨迹分析表明，Ly6G+ Macs（C2）会衍生出RNA含量低的Macs（C10）。作者在IAV感染后第7天进行了EdU脉冲实验，发现IAV感染后第10天EdU染色的Ly6G+ Macs在第17天从肺部完全清除（图3G）。在感染后第10天进行Annexin V/propidium iodide (PI)染色进一步证实，从Ly6C+ Mos向iMos过渡并分化成Ly6G+ Macs的细胞对死亡的敏感性逐渐增强， 大量Ly6G+ Macs或早期或晚期凋亡（annexin V+/PI+/−）或坏死（annexin V−/PI+）（图3H）。因此，作者的数据表明，Ly6G+ Macs是Ccr2依赖性Ly6C+ Mos产生的短寿命Mac亚群。

    Ly6G+ Macs上的Ly6G信号被认为是Neuspecific的，这是出乎意料的，需要仔细验证。首先，作者验证了在未染色或同种型抗体（Ab）染色的IAV感染的WT小鼠的CD11b+细胞中，Ly6G的荧光强度几乎不存在。其次，作者评估了Ly6G+ Mac前体（即iMos）在感染IAV后第10天从感染IAV小鼠肺部分离时，是否能够内在上调其表面的Ly6G。作者发现，来自IAV感染小鼠的iMos在体外用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）刺激后，在较小程度上用巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）刺激后，其表面的Ly6G蛋白上调（图3，I和J）。作者还发现，从IAV感染的Ly6gCreERT2R26LSLtdTomato小鼠（Ly6gtdTom）中分离出的肺iMos经他莫昔芬处理并在体外用GM-CSF刺激后，成为tdTomato+，表明单核细胞中Ly6g基因转录活跃（图3，K和L）。这些数据表明，Mo-Macs可以主动表达Ly6G。

    鉴于GM-CSF能够触发从IAV感染小鼠中分离出的肺iMos上的Ly6G表达，作者评估了体内Ly6G+ Macs对GM-CSF受体信号的依赖性。作者制作了骨髓竞争嵌合体，其中，胸腔受保护、致死性辐照的CD45.1/CD45.2 WT小鼠被1:1混合的CD45.1 Csf2ra−/−和CD45.2 Csf2ra+/+骨髓供体细胞移植。重建后第4周，来自供体的血液中性粒细胞和单核细胞同样来自CD45.1Csf2ra−/−和CD45.2Csf2ra+/+骨髓细胞。在感染流感病毒后的第10天，作者发现CD45.2 Csf2ra+/+骨髓细胞比CD45.1 Csf2ra−/−骨髓细胞更具竞争优势，能够成为Ly6G+巨噬细胞，而大多数其他肺髓细胞则没有这种优势（图3M），Csf2ra−/− Ly6G+ Macs中Arg-1+细胞的百分比低于Csf2ra−/− Ly6G+ Macs（图3，N和O），表明它们部分依赖于GM-CSF受体信号。

Ly6G+ Macs表现出与代谢和吞噬能力增强相关的独特超微结构特征

    通过对Ly6G+ Macs（C2）转录组学特征进行基因集富集分析（GSEA），与所有其他群集相比，Ly6G+ Macs（C2）对干扰素-γ（IFN-γ）和细胞因子、趋化性和病毒过程、活跃的代谢状态、高度发达的内质网系统以及增强的吞噬能力有反应（图4A）。作者分析了流感病毒感染后第10天通过透射电子显微镜（TEM）对荧光激活细胞分选（FACS）分选的Ly6G+ Macs，发现它们具有肾形细胞核、富含微绒毛的膜、分泌颗粒以及富含粗面内质网（RER）、高尔基体、溶酶体和自噬泡的细胞质，从而与Neus、Ly6C+ Mos和IM样细胞区分开来（图4B）。Ly6G+ Macs的形态类似于一种非典型单核细胞，称为SatM单核细胞，这种细胞在肺纤维化阶段产生于博来霉素治疗后的特定GMP，有助于纤维化，并受CCAAT/增强子结合蛋白β（C/EBPβ）调控。作者进行了单细胞调控网络推断和聚类（SCENIC）分析，发现与Ly6C-Mos、Ly6C+Mos、iMos和Neus相比，Ly6G+Macs中的C/EBPβ活性较低。此外，作者根据SatM单核细胞中不受调控的基因（35个）计算了SatM特征评分，将该评分与作者的scRNA-seq数据进行了比对，发现Ly6G+巨噬细胞与IM、Ly 6C+ Mos、Ly6C− Mos或iMos相比，Ly6G+ Macs对C/EBPβ不敏感，且转录水平与SatM单核细胞不同。

    接下来，作者使用代谢通量测定法对Ly6G+ Macs的代谢特征进行了分析，发现Ly6G+ Macs的细胞外酸化率（ECAR）高于IM样细胞，无论是在基线还是应激状态下都是如此，这表明Ly6G+ Macs的糖酵解途径非常活跃（图4C）。此外，虽然Ly6G+巨噬细胞和IM样细胞之间的线粒体基础耗氧率（OCR）相似，但Ly6G+巨噬细胞在应激条件下的OCR比IM样细胞高（图4D），这表明它们具有较高的代谢潜力（图4E）。

    在感染后第10天，作者向气管内注射了荧光标记的大肠杆菌颗粒，并证实与Neus、Ly6C+ Mos、IM样细胞和AMs相比，Ly6G+ Macs具有高度吞噬性（图4，F和G）。因此，作者想知道Ly6G+ Macs是否能在体内进行胞葬。为此，作者感染了骨髓竞争性嵌合体，其中致命辐照的CD45.2 WT小鼠与Cx3cr1GFP/+和Ms4a3tdTom骨髓细胞的1:1混合物一起移植。值得注意的是，在感染IAV后的第10天，60%的Cx3cr1GFP/+ Ly6G+ Macs也是tdTomato+（图4，H和I），这表明它们在体内吞噬髓细胞的能力很强。为了评估胞葬过程中Ly6G分子是否能够从Neus转移到Ly6G+ Macs，作者感染了BM竞争性嵌合体，其中致命辐照的CD45.1/CD45.2 WT小鼠被移植了1:1混合的Cx3cr1GFP/+ BM细胞和Ly6g−/−（即纯合Ly6gCreERT2小鼠）或Ly6g+/+ BM细胞。在感染IAV后的第10天，作者发现Cx3cr1GFP+:Ly6g−/− BM嵌合小鼠（其中一半Neus为Ly6g−/−）的Cx3cr1GFP+:Ly6g+ Macs上的Ly6G水平与Cx3cr1GFP+: Ly6g+/+ BM嵌合小鼠，不支持Ly6G从Neus转移到Ly6G+ Mac的证据。这些数据共同表明，IAV引发的Ly6G+ Mac具有不同于其他肺髓样细胞的代谢、形态和吞噬特性。

Ly6G+ Mac 填充病灶周围再生区域的肺泡腔

    接下来，作者研究了 Ly6G+ Mac 的定位和空间组织。首先，作者在 IAV 后第 10 天对受感染的 Cx3cr1GFP 小鼠的肺切片进行了共聚焦显微镜染色。通过将 Ly6G+ Mac 定义为 Ly6G 和绿色荧光蛋白 (GFP) 双阳性的细胞，作者发现它们位于肺泡腔内（图 5A），这也得到了原位电子显微镜的证实（图 5B）。

    为了进一步研究 Ly6G+ Mac 的空间分布和 Ly6G+ Mac 富集区域的分子特征，作者使用 GeoMx 数字空间分析器 (DSP) 进行了空间转录组分析，该分析器允许在感兴趣的区域 (ROI) 内进行全基因组转录分析。在 IAV 感染后第 10 天收集两只模拟感染小鼠和四只 IAV 感染小鼠的肺切片，用抗 CD68 和抗 Ly6G 抗体染色，并在对照肺（4 个 ROI）、病变外区域（4 个 ROI）、病变内区域（5 个 ROI）和富含 Ly6G+CD68+ 细胞的区域中选择一个 ROI，这些区域大多位于实变区域的边缘（病变周围；11 个 ROI）（图 5C）。无监督主成分 (PC) 分析显示病变周围 ROI 与其他区域分开（图 5D）。不同条件下差异表达基因的火山图表示和与其他区域相比病变周围区域中 522 个显着上调的基因的热图支持病变周围区域转录非常活跃。一般细胞反卷积表明，与其他区域相比，病变周围区域也富含组织 Mac。接下来，作者将通过 scRNA-seq 分析的肺髓细胞群的细胞特征评分映射到 ROI，并证实与其他区域相比，病变周围区域富含 Ly6G+ Mac（图 5E）。GSEA 表明，与病变内区域相比，病变周围区域富含与细胞骨架活动、上皮细胞迁移和代谢活动升高相关的生物反应，与强烈的重塑活动一致（图 5F）。

    接下来，作者利用公开的 scRNA-seq 数据集，该数据集包含博来霉素诱导的肺损伤后肺泡再生过程中存在的肺泡上皮细胞状态，其中包含 1 型和 2 型肺泡上皮细胞（分别为 AT1 和 AT2）以及 AT2 到 AT1 分化过程中出现的过渡状态，称为引发的 AT2 和损伤相关的瞬时祖细胞 (DATP)。通过将此类过渡上皮细胞状态的特征分数映射到 ROI，作者发现与对照和病变内区域相比，Ly6G+ Mac 丰富的病变周围区域富含引发的 AT2 和 DATP。因此，Ly6G+ Mac 评分与引发的 AT2 和 DATP 评分呈正相关（图 5G）。作者还通过共聚焦显微镜证实，Ly6G+ Mac 在实变区域周围特别丰富，并与 AT2 聚集在一起，而病变内实变区域（AT1 和 AT2 染色水平较低）含有少量 Ly6G+ Mac（图 5H）。总之，这些数据与病变周围区域作为 IAV 后活跃上皮再生的部位相一致，并表明聚集在这些区域的 Ly6G+ Mac 有助于这一过程。

Ly6G+Macs 通过 IL-4R 信号促进肺泡上皮再生

    为了正式评估 Ly6G+Macs 在体内的功能，作者的目标是产生一种 Ly6G+Mac 分化受损的转基因小鼠品系。因此，作者将 SCENIC 算法应用于作者的 scRNA-seq 数据，以绘制基因调控网络并预测 Ly6G+Macs 中转录因子的活性。值得注意的是，如前所述，c-Maf 和 MafB 在 Ly6G+Macs 和类 IM 细胞中表现出较高的调控因子活性，但在其他肺髓细胞中却没有表现出这种活性（图 6A）。在 IAV 后第 10 天，通过流式细胞术在 Ly6G+Macs 中也检测到了 c-Maf 和 MafB 蛋白水平的升高（图 6，B 和 C），在 IAV 感染小鼠肺部 Ly6G+Mac 富集的周围区域，Maf和Mafb转录水平也升高了（图 6D）。作者通过将Maf和Mafb缺失小鼠（Maf/Mafbfl/fl ）与在溶菌酶M启动子（Lyz2Cre）控制下组成型表达Cre重组酶的小鼠杂交，产生了髓系受限的Maf和Mafb缺失小鼠，以下称为Maf/MafbMyeloKO小鼠。与对照小鼠相比，IAV后第10天，Maf/MafbMyeloKO小鼠几乎没有Ly6G+ Macs，而Neus、AMs、IM样细胞、Ly6C+Mos和iMos的数量相似，Ly6C- Mos的数量更高（图6E）。因此，作者利用该模型来研究 IAV 感染后 Ly6G+Mac 缺乏对病毒控制、发病率和肺泡上皮修复的影响。

    作者评估了IAV感染后肺部编码非结构性流感蛋白NS1的mRNA水平，发现它们在Maf/MafbMyeloKO和对照组之间没有显著差异，并在IAV感染后第10天恢复到基线水平（图6F），这证明Ly6G+ Mac并没有对宿主的病毒控制产生实质性影响。然而，与对照组相比，Maf/MafbMyeloKO小鼠在IAV后体重减轻更多（图6G），表明IAV诱导的病理变化更严重。IAV后第20天的肺切片组织病理学分析表明，与对照组相比，Maf/MafbMyeloKO小鼠的病变区域更广，而且根据肺部病变区域粘液面积的量化，肺泡的发育不良修复和支气管化更明显（图6，H至J）。这些结果表明，在缺乏 Ly6G+Macs 的情况下，肺泡上皮再生的经典途径（包括祖细胞 AT2 的扩增和向 AT1 的分化）是有缺陷的，并通过发育不良修复得到补偿。接下来，作者通过流式细胞术评估了 IAV 后第 20 天Maf/MafbMyeloKO小鼠和对照组小鼠的 AT1s、AT2s 和 regAT2s 的数量，观察到与对照组相比，Maf/MafbMyeloKO小鼠的 AT2s 和 regAT2s 数量显著减少（图 6，K 和 L），证实在缺乏 Ly6G+Macs 的情况下，AT2s 扩增和分化成 AT1s 的能力较弱。值得注意的是，在 IAV 后第 10 天，将从 WT 小鼠肺部分离的 Ly6G+Macs 经气管内转移到 IAV 感染的Maf/MafbMyeloKO小鼠体内，可部分改善体重恢复情况，并使 AT2 数量恢复到 IAV 感染对照组小鼠的水平（图 6，M 和 N）。这些结果表明，Ly6G+Macs 是 IAV 诱导的肺损伤后上皮细胞再生的关键角色。

    为了确定Ly6G+Mac富集的绒毛周围区域是否受到2型修复环境的影响，作者将基于参与白细胞介素-4（IL-4）受体（IL-4R）下游信号通路的基因的2型特征得分映射到DSP空间转录组数据，发现与其他ROI相比，绒毛周围区域表现出最高的2型得分（图7A）。因此，作者探索 IL-4R 信号是否参与了 Ly6G+Mac 的身份和功能，众所周知，IL-4R 的激活会诱导 Mac 的修复表型。首先，作者发现 Ly6G+Macs 表达高水平的 IL-4R α 链（IL-4Rα）（图 7，B 和 C）。接下来，作者生成了CD45.1/CD45.2 WT小鼠骨髓竞争嵌合体，其中致死辐照的CD45.2Il4ra-/-和CD45.2Ms4a3tdTom骨髓细胞以1:1的比例混合移植。重组后第 4 周，血液中证实了有效的 BM 重组。在 IAV 后第 10 天，作者发现供体Ms4a3tdTom来源的 Ly6G+Macs 与供体Il4ra-/-来源的 Macs 相比表现出竞争优势，这在其他肺髓细胞中没有观察到（图 7D），其余的Il4ra-/-  Ly6G+Macs 表达 Arg-1 的能力受损（图 7，E 和 F）。最后，用Il4ra-/-或 WT BM 细胞完全重组 WT 嵌合体小鼠（分别为Il4ra-/-BM → WT 或 WT BM → WT），并用 IAV 感染。作者发现，与Maf/MafbMyeloKO小鼠一样，与 WT BM → WT 小鼠相比，Il4ra-/-BM → WT 小鼠在感染 IAV 后的恢复能力受损（图 7G）。这些数据表明，Ly6G+ Macs 至少部分是通过 IL-4R 依赖性途径发挥其功能的。

    最后，作者想知道 Ly6G+Macs 能否直接影响 AT2 的命运，以及是否需要细胞-细胞接触。为此，作者使用小鼠肺上皮细胞12（MLE-12）小鼠AT2细胞系在体外进行了划痕试验，并评估了划痕12小时后AT2在有或没有从IAV后第10天感染的肺部分离的Ly6G+ Macs的情况下的汇合情况。与 Ly6G+Macs 共培养而不与 Neus、IM 样细胞或 iMos 共培养会增加细胞汇合率（图 7H），这表明 Ly6G+Macs 能直接且特异性地促进体外伤口愈合。作者还使用经 FACS 分选的 Ly6G+Macs 的条件培养基（CM）进行了类似的划痕试验，这些 Macs 是在有或没有 2 型细胞因子 IL-4 和 IL-13 的情况下培养过夜的。在这种情况下，与对照培养基（仅含 IL-4 和 IL-13）或未脉冲的 Ly6G+Macs 的 CM 相比，IL-4/IL-13 脉冲的 Ly6G+Macs 的 CM 能促进伤口愈合（图 7，I 和 J）。作者对这些 CM 进行了蛋白质组分析，发现 Ly6G+Macs 分泌可溶性因子的能力很强，其中包括趋化因子（CCL5、CXCL16、CCL12 和 CXCL10）、细胞因子[肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、IL-10 和 IL-1α]和骨素，其中一些因子在 IL-4R 激活时会增加（图 7K）。在 Ly6G+Macs CM 中检测到的一些分子在 Ly6G+Macs（C2）中的转录水平与其他集群相比显著上调。总之，作者的数据表明，Ly6G+ Macs 在 IL-4R 触发后可释放可溶性因子，直接作用于 AT2，促进上皮再生。

Ly6G+Macs 属于宿主对不同器官、诱因和物种损伤的一种保守反应

    作者评估了 Ly6G+Macs 是专门在 IAV 模型中招募的，还是在其他损伤模型中也会被触发。首先，作者使用了基于博莱霉素灌注的非感染性肺损伤模型，并进行了时程流式细胞术分析。表达高水平 Arg-1 和 CXCR4 的 Ly6G+Macs 大多出现在注射博莱霉素后的第 7 天至第 14 天，这与 AT1 和 AT2 数量减少所反映的上皮损伤迹象相关（图 8，A 至 E）。在对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤模型中，作者也发现类似的 Ly6G+Macs 在治疗后第 1 天和第 2 天达到峰值，这与血浆中丙氨酸转氨酶（ALT）的释放有关（图 8，F 至 I）。因此，作者的数据表明，Ly6G+ Macs 是对组织损伤作出一致反应的一个组成部分，与器官或触发因素无关。

    最后，作者思考患病人类的支气管肺泡灌洗液（BALF）中是否也存在具有类似转录组特征的 Macs。作者对七名疑似肺炎患者的 BALF 细胞进行了 scRNA-seq 分析，并根据上调最多的基因对细胞集群进行了人工标注（图 8，J 和 K）。接下来，作者根据人类的同源基因对 BALF 细胞进行了 Ly6G+Mac 评分，发现表现出最高 Ly6G+Mac 评分的细胞属于同一集群 C9，该集群根据单核细胞基因的高表达和 AM 相关基因的低表达被鉴定为 Mo-Macs（图 8，L 和 M）。SCENIC 分析预测，Mo-Mac 群组的 MAF 和 MAFB 活性高于其他群组（图 8N），进一步证明人类肺炎肺的气腔中含有与小鼠 Ly6G+Macs 转录相似的 Mo-Mac。