全基因组测序探查内镜相关产NDM大肠埃希菌暴发
健康
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2024-04-30 15:20
江苏
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团队介绍：中山市循证感控团队
中山市循证感控团队来自伟大民主革命先驱孙中山先生的故乡，团队成员以推行循证感控、精准感控为己任，践行 「 感控为公，天下为公 」 宗旨，惟愿诸君将推行感控理念之责任，置之于自身之肩上。
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产新德里金属-B-内酰胺酶（NDM）的耐碳青霉烯类肠杆菌（CRE）是一个日益严峻的健康威胁。美国疾控部门于 2019 年宣布其为紧急全球威胁。这些细菌都有显著的耐药性（AMR），并且难以在早期暴发中被发现。流行病学监测通常依赖于分子菌株分型来确定分离株间的遗传亲缘关系。常用的暴发监测分子方法包括脉冲场凝胶电泳、扩增片段长度多态性和多位点测序分型。近年来，全基因组测序（Whole-genome sequencing,WGS）作为一种替代性的基因分型工具，正成为一种强大而有吸引力的流行病学调查和监测工具。联合传统的医院流行病学方法，WGS 能够快速确定暴发来源和追踪患者间的传播路径。美国公共卫生部门已经尝试使用 WGS 对包括 CRE 在内的新发病原体进行生物监测。本次报告描述了密歇根底特律一家三级医院一起内镜逆行胰胆管造影术（ERCP）和食管胃十二指肠镜（EGD）相关的产 NDM 大肠埃希菌暴发事件，以此展示了分子监测在识别暴发中的作用。（1）病例定义：2021 年 6 月 1 日至 2023 年 2 月 28 日在我院住院且在 WGS 中检出与暴发菌株密切相关的产 NDM 大肠埃希菌株的患者。（2）初步病例搜索和病例描述：最初的 2 例患者于 2021 年 7 月在我院住院并随后出现症状。第一例患者在住院期间发生了腹膜炎，第二例患者在 1 个月后因脓毒症和菌血症到外院治疗。州实验室进一步检测了 CRE 分离株，并鉴定为与产 NDM 大肠埃希菌密切相关。之后回顾发现另外 3 名在 8 月至 9 月期间入住我院患者被确诊。病历回顾显示，所有患者在发病前均接受了 2 个十二指肠镜的 ERCP 手术。我们随后回顾了自 2020 年 1 月以来所有报告的 CRE 病例，但未发现新病例。（3）进一步病例搜索：在 2021 年 11 月至 2023 年 2 月期间，又发现了 4 例病例；最后一个病例是从我院出院 5 天后在一家住院康复机构发现的。（4）病例对照研究：采用病例对照研究来确定产生 NDM 大肠埃希菌的危险因素。以 2020 年 1 月至 2023 年 4 月期间连续住院且检出非产 NDM 的耐碳青霉烯类大肠埃希菌的所有患者为对照组。评估患者特征、既往抗生素暴露史、住院病区和手术室、检查、医疗保健人员暴露情况等。（5）暴露筛查：筛查对象为密切接触者，包括同室病友、在同一病区与病例密切接触的高风险患者，以及共用同一十二指肠镜和胃镜的患者。136 例接受十二指肠镜检查的患者（2021 年 5 月-2021 年 11 月）和 1097 例接受胃镜检查的额患者（2021 年 5 月-2023 年 3 月）接受了 CRE 筛查。（6）感控措施和环境评估：详细评估了内镜检查操作、内镜再处理和感控实践以及内镜室的环境清洁情况。感控团队访谈了内镜室工作人员并直接观察了内镜清洗和再处理操作。相关内镜被封存并送到参考实验室进行检查和培养，其中十二指肠镜以吐温基溶液作为提取液，胃镜则使用灭菌水。（1）分离物鉴定：分别用 MALDI-TOF 质谱法和 Vitek (bioMerieux, Durham NC) 测定大肠埃希菌及其抗菌药物敏感性。对可疑携带金属-β-内酰胺酶基因（如美罗培南/瓦博巴坦和/或头孢他啶/阿维巴坦耐药）的临床分离株用 Cepheid GeneXpert® (Sunnyvale, CA) 检测碳青霉烯酶基因。州实验室对所有分离株进行耐药性确认和 WGS，对暴露患者的直肠拭子进行 CRE 筛查。（2）WGS 和组装、系统发育树分析：使用 Qiagen DNeasy 血液和组织试剂盒（Germantown, MD）提取 DNA，使用 Nextera Flex 试剂盒（Illumina, San Diego, CA）进行预处理，然后在 Illumina MiSeq 平台上进行测序，从而生成序列数据。使用 Trimmomatic（Illumina）修剪读数，将读数映射到 IMT16316 基因组（Genbank 编号 GCA_002587005.1），并使用 Snippy 选择核心 SNP，从而进行核心 SNP 比对。树形图是用 IQ-TREE15 制作的，树形比例以每个位点的核苷酸替换为单位。先使用 Shovill16 组装测序读数，再用 ABRicate 检测 AMR 相关基因。序列读数可从美国国家生物技术信息中心的生物项目 RJNA659498 中获取。使用 R v4.0.4 中的 ggtree 和 ggplot 软件包（R Core Team，Vienna，Austria）进行可视化。使用 SPSS28.0.01 软件进行分析。用统计描述来总结病例特征。计数变量用频数和百分比，连续变量采用四分位数和四分位数描述。采用双变量分析来评估患者暴露与病原体之间的关系；分类变量的比较采用卡方检验或 Fisher 确切概率检验；比较非参数连续变量用 Mann Whitney-U 检验。计算每种暴露的未调整比值比 (OR) 和 95% 置信区间（95%CIs）。所有 P 值均为双侧，P＜0.05 为有统计学意义。现况描述：2021 年 9 月至 2023 年 3 月期间共发现了 9 例患者 (表 1 和图 1)。中位年龄为 64 岁（四分位数范围为 46-75 岁），其中 67% 为女性。以内镜检查日至培养报阳时间间隔计算潜伏期，平均潜伏期为 86 天（范围为 1-320 天）。6 例患者有临床感染，3 例被判定为定植。腹腔积液（44%）和血液（33%）是最常见的标本来源。3 名患者随后死亡，但只有 1 名患者的死亡被确定与 NDM 感染有关。流行病学追踪显示，这些病例的病房使用并无时间交叉。前 7 例患者在 2021 年 5 月至 11 月期间进行了 1 次或以上的 ERCP 手术，共涉及 3 个十二指肠镜。患者 5 分别于 2021 年 5 月和 8 月接受了十二指肠镜 A 和 B 的 ERCP 手术；另外 5 例被追踪到使用了这 2 个十二指肠镜。十二指肠镜 C，最初用于已经发生 NDM 感染的患者 1 和患者 3 上，与患者 7 有关。尽管患者 8 既往做了 4 次 ERCPs，但未使用所涉及的十二指肠镜。患者 8 用之前有 3 例患者使用过的胃镜 A 做 EGD。患者 9 没做 ERCP，但用胃镜 A 和 B 做了两次 EGD，之前有 5 例患者使用过胃镜 B。见图 1。（2）病例-对照研究：9 例患者和 23 例对照具有相似的人口统计学特征、住院时长、住院单元、手术室和工作人员暴露情况（表 2）。ERCP 十二指肠镜有 8 例（89%）病例和 8 例（35%）对照（未经调整的比值比为 15.0；95%CI:1.8–142.2;P = 0.05)。虽然胃镜的使用无统计学差异，但病例组比对照组更常用（未调整比值比 8.7；95%CI：0.94-81.5；P = 0.05)。（3）暴露筛查：3 例十二指肠镜患者和 197 例胃镜患者做了筛查，但未发现新病例。患者 7 当时拒绝了筛查（2021 年被通知存在暴露）。（4）感控实践和环境评估：感控评估主要集中在内镜再处理（表 3）。在十二指肠镜和胃镜的再处理过程中均未发现违规行为。自动内镜再处理机功能正常，且有最新的维护记录。所有涉事内镜的检查/修复日志显示，这些内镜经过了多次检查、修复和重建。例如，十二指肠镜 A 因各种原因被维修了 14 次，包括测漏失败和升降器损坏，以及自 2016 年以来多次完全拆卸。胃镜 B 购于 2018 年，因机械/物理损伤或液体侵犯而接受服务 31 次，于 2023 年 2 月被完全重构建，更换了插入管和所有内部组件，其后 1 个月又送修。目视检查发现，除十二指肠镜 A 有可见的内部碎片和损伤外，其他内镜均无问题。参考实验室在涉事内镜样本中检出近平滑念珠菌、微球菌、铜绿假单胞菌、耳葡萄球菌和表皮葡萄球菌等多种病原体，未见大肠埃希菌。（5）感控措施：所有涉事内镜均停用（表 3）。2022 年 1 月将十二指肠镜库存升级为带有一次性端盖的现代设计，停用旧型号。对 10 个 NDM 大肠埃希菌分离株（患者 5 有两株分离株）行 WGS。除 blaNDM、blaTEM-1B、blaOXA-1B 和 blaCTX-M-15 抗生素耐药基因外，所有分离物均被归类为序列类型 648 并携带有 NDM-5 碳青霉烯酶基因。系统进化分析证实，10 个分离株间关系密切，单核苷酸多态性（SNPs）差异小于 26 个（图 2），符合流行病学联系（图 3）。（1）根据 WGS 分析，产 NDM 大肠埃希菌菌株密切相关，提示可能通过同一来源传播。流行病学调查和病例对照分析表明，所有病例的传播与十二指肠镜和/或胃镜相关，未发现其他传染源。（2）本研究亮点在于，体现了在识别和阻断未知院感暴发中，WGS 在监测和流行病学调查上发挥重要作用，尤其在检测由潜伏期延长和可变的生物体引起的隐匿暴发方面。随着病原体的持续间断性脱落，CRE 的定植时间可以延长，从而导致感染有一个长时间的潜伏期。早期识别对于住院患者实施隔离预防措施和防止后续传播至关重要。WGS 数据能够帮助我们确定暴发的可能来源，并将重点放在预防上，这可能节省了调查的时间和资源。（3）本研究再次强调了内镜检查和 ERCP 术后 CRE 传播的明确关联，提出内镜内部的隐匿损坏可能与感染传播有关。本次调查并未发现内镜再处理失误，但内镜维修日记显示涉事的内镜在寿命周期内频繁外送维修。软式内镜因设计复杂、材料精细而难以清洁和消毒。软式十二指肠镜的重复使用和再处理可以导致隐匿损坏，而有限的清洗方法可导致生物膜的产生和标准化再处理后持续的细菌污染。值得注意的是，内镜的「预期寿命」和正常的「磨损」并没有得到明确的定义，关于何时更换或退役这些设备的指南是有限的。用管腔镜对内镜工作管路进行目视检查能发现广泛的隐匿损坏和碎片，本研究针对事件建立一个使用管腔镜进行内镜检查预防性维护计划。（4）环境评估发现了在内镜室中一些共享设备的常规和终端清洁过程中存在不一致。本次暴发发生在人员和供应短缺的新冠大流行期间。目前正在努力增加对环境服务的支持和规范房间清洁工作流程。通过持续教育以确保感控措施的落实，尤其强调手卫生，共享设备的常规和终末清洁，以及减少污染风险的内镜处理措施。（5）局限性：①内镜暴露患者返回筛查响应率低（仅 16.5%），未能获得确切发病率，实际情况可能被低估。内镜的再处理是在患者暴露后进行的，但先前的观察和审查并未发现实践中的任何漏洞。②由于病例数量较少，胃镜的使用与获得产生 NDM 大肠埃希菌的相关性未达到统计学意义。病例对照研究的效力低，且未进行多变量分析。文献来源：Suleyman, G., Shallal, A., Ruby, A., Chami, E., Gubler, J., McNamara, S., Miles-Jay, A., Tibbetts, R., & Alangaden, G. (2024). Use of whole genomic sequencing to detect New Delhi metallo-B-lactamase (NDM)-producing Escherichia coli outbreak associated with endoscopic procedures. Infection control and hospital epidemiology, 1–8. Advance online publication. https://doi.org/10.1017/ice.2024.36题图：https://www.verywellhealth.com/thmb/fiLb9OdUdt2-glr2SCzxljPUdFs=/2121x1414/filters:fill(87E3EF,1)/GettyImages-9267230101-5bafc4f046e0fb0026acdb20.jpg
