动脉粥样硬化中的泡沫细胞充满了脂滴（LD），其中含有调节性脂质的酯，其代谢机制尚不清楚。LD相关水解酶（LDAH）具有脂肪酶结构，对泡沫细胞的LDs具有高亲和力。通过使用敲除和转基因小鼠，我们发现LDAH抑制动脉粥样硬化的发展并促进稳定的病变结构。对原代巨噬细胞进行广泛和有针对性的脂质组学分析，并对动脉粥样硬化进行比较脂质分析，发现LDAH对酯化甾醇（包括天然肝X受体（LXR）甾醇配体）有广泛影响。转录组学分析结合救援实验表明，LDAH调节原型LXR靶点的表达，并使巨噬细胞具有促纤维化基因特征的炎症表型。这些研究强调了LD作为生物活性脂质的储存库和代谢中心的作用，并表明LDAH有利于调节巨噬细胞活化，并通过调节甾醇的脂解动员来预防动脉粥样硬化。该研究于2024年8月发表在《nature communications》。IF 14.7分。
为研究LDAH功能的获得如何影响动脉粥样硬化的发展，我们在小鼠Csf1r基因座的启动子和增强子的控制下产生髓系特异性LDAH转基因（LDAHTg）小鼠，该基因座指导巨噬细胞和粒细胞中与位置和拷贝数无关的表达（图1A）。在RNA和蛋白质水平上证实半合子转基因巨噬细胞（LdahTg/0）中LDAH表达的增加（图1B，C）。将LdahTg/0小鼠与Apoe-/-小鼠杂交，产生LdahTg/0Apoe-/-和Ldah0/0Apoe-/-同窝小鼠。在标准饮食20周后，两性基因型之间的体重、血浆甘油三酯、总胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇以及脂蛋白组分之间的总体胆固醇分布相似。然而，在雄性和雌性小鼠中，LdahTg/0Apoe-/-小鼠的动脉粥样硬化发展显著减少，表明LDAH是一种动脉粥样硬化保护剂（图1D，E）。
组织学分析还揭示了病变成分的重要差异。两种基因型雌性小鼠的病变主要由晚期纤维粥样斑块组成。与野生型同窝雌性相比，LdahTg/0Apoe-/-雌性的病变表现出较不脆弱的表型，凋亡细胞和坏死区域显著减少（>50%），Mac3阳性区域略有减少，胶原蛋白沉积增加（图2A）。与雌性相比，两种基因型的雄性都出现了较不严重的病变（图2B）。在这两种基因型中，病变主要由Mac3阳性脂肪条纹组成，Mac3染色阳性的病变面积百分比在基因型之间没有差异（图2B）。两种基因型的雄性动物坏死核心仍然很少，基因型之间没有差异（图2B）。然而，在LdahTg/0Apoe-/-雄性中，凋亡细胞的数量已经显著减少（图2B）。值得注意的是，虽然在这个发育阶段，Ldah0/0Apoe-/-雄性小鼠的病变仍然含有很少的胶原蛋白，但LdahTg/0Apoe-/-雄性的病变明显纤维化，用Masson三色染色的切片定量分析显示胶原蛋白沉积增加了约3倍（图2B）。I型原纤维胶原通常是动脉粥样硬化中的主要细胞外基质（ECM）成分，通过增加病变的抗拉强度发挥促稳定作用。用抗I型胶原抗体进行免疫染色证实，转基因小鼠的病变富含I型胶原纤维。
对于功能丧失研究，我们通过同源重组产生LDAH敲除（KO，LDAH−/−）小鼠，并将其繁殖到Apoe-/−背景的小鼠中。Ldah+/-Apoe-/-和Ldah-/-Apoe-/-两性同窝仔的体重和血脂相似。在喂食常规食物的小鼠中，整体LDAH缺乏或骨髓来源细胞中的LDAH缺乏不影响病变大小。然而，与转基因小鼠的发现一致（图2），LDAH-KO雌性小鼠的病变比WT同窝小鼠的病变含有更少的胶原蛋白和更大的坏死面积。因此，我们研究了LDAH的缺失如何影响西方饮食（WD）挑战的小鼠动脉粥样硬化。两种基因型之间的血浆脂质和体重没有差异。然而，在喂食WD 12周后，无论什么性别，Ldah−/-Apoe−/-小鼠的病变都明显大于其Ldah+/-Apoe−/−同窝小鼠（图3A、B）。骨髓移植（BMT）实验还显示，Ldah−/-Apoe-/-骨髓移植小鼠的病变发展增强（图3C）。从表型上看，LDAH-KO小鼠的病变包含更多的凋亡细胞、更大的坏死核心、Mac3阳性区域增加和胶原蛋白减少（图3D-G）。LDAH缺乏对病变组成的影响在两性中都是一致的，骨髓来源细胞中的LDAH缺乏也显著地复制了整体缺乏对病变构成的影响（图3D-G）。
总之，在LDAH缺乏和过表达下进行的动脉粥样硬化研究表明，LDAH是一种动脉粥样硬化保护剂，通过减少坏死和增加纤维化来促进有利的病变重塑，并表明动脉粥样硬化保护的机制涉及调节髓系细胞。
鉴于LDAH的脂肪酶结构和与LDs的关联，为研究LDAH动脉粥样硬化保护功能背后的分子机制，我们首先使用鸟枪脂质组学分析氧化LDL（oxLDL）处理的腹腔巨噬细胞（PM）的脂质体。LDAH-KO和LDAHTg PM与其各自的WT对照之间的总脂质含量没有显著差异（图4A，B）。然而，LDAH选择性影响甾醇脂质和心磷脂（CL）的水平，在LDAH Tg PM中显著降低，在KDAH-KO PM中显著升高（图4A、B）。脂质生物合成主要发生在内质网（ER）中，从ER中产生的LD是ER8中产生或通过ER8运输的多余脂质的储存库。然而，CL是线粒体膜的标志性脂质，在线粒体内膜合成并几乎完全定位于线粒体内膜，这使得它不太可能成为LD相关酶的直接靶标。
此外，尽管LDAH降低了CL的总水平，但其效果在所有CL物种中并不均匀。相反，甾醇酯化发生在内质网中，泡沫细胞LD是丰富酯化甾醇的储存库。无论酯化为甾醇的脂肪酸类型如何，LDAH对脂质组学分析中鉴定的所有个体CE物种的影响都是非常一致的（图4C）。大多数CE物种在LDAH-KO巨噬细胞中升高，而在LDAH-Tg巨噬细胞中检测到的所有CE水平均低于WT巨噬细胞，所有差异均具有统计学意义（图4C）。
ER驻留酶酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶-1（ACAT1）酯化胆固醇，也酯化其他甾醇底物，包括侧链氧甾醇和天然LXR配体的胆固醇合成中间体。在泡沫细胞和动脉粥样硬化中，这些甾醇中的一些以酯类形式大量存在，这表明它们也可能是LDAH的底物。因此，我们使用高分辨率LC-MS进一步分析甾醇脂质。甾醇面板还揭示了LDAH对不同甾醇物种的强烈影响。虽然胆固醇的差异不大，但与各自的WT对照组相比，LDAH-KO PM中其他代谢物的总水平显著较高，LDAH-Tg PM中的总水平明显较低（图5A，C）。我们检测到动脉粥样硬化中存在多种甾醇，包括甾醇环系统第七个碳原子的特征性氧化产物，如7-酮胆固醇（7-KC）和7α-羟基胆固醇（7α-HC），侧链氧甾醇，如25-羟基胆固醇（25-HC）和27-羟基胆固醇（27-HC）和去类固醇。这些代谢物中的大部分在LDAH-KO PM中升高，在LDAH-Tg巨噬细胞中，所有代谢物均显著低于WT对照组（图5B，D）。
疏水隔室中的酯化和区室化会显著限制调节甾醇的可及性和功能，与胆固醇一样，酯水解速率被证明是25-HC稳态的主要决定因素。虽然已经确定动脉粥样硬化中存在的许多甾醇被ACAT1酯化，但酯水解的机制和后果仍然知之甚少。按照与Venkateswaran等人描述的方案类似的方案，我们设计了trafficking实验评估受LDAH影响的两种甾醇（胆固醇和25-HC）的酯化和水解。LDAH-Tg和WT腹腔巨噬细胞与乙酰化LDL（acLDL）和25-HC的混合物一起孵育，随后用3H-油酸酯脉冲，以特异性标记细胞内新形成的酯。为评估酯水解速率，在ACAT1抑制下，在载脂蛋白A-I（apoA-I）存在的情况下追踪细胞（图5E）。用3H-油酸酯处理后，基因型之间的3H-标记CE或25-HC酯（25-HCE）没有差异，表明LDAH不影响酯的形成（图5F）。然而，在LDAH过表达的情况下，这两种酯的周转速度明显加快，与apoA-I一起孵育6小时后，LDAH Tg PM的CE含量比WT PM低约30%，25-HCE的减少更为明显（约70%）（图5G）。综上所述，脂质组学和贩运实验表明，LDAH通过促进酯动员来影响多种甾醇的稳态，包括重要的生物活性代谢物。
脂质组学研究表明，LDAH可以动员作为内源性LXR配体的甾醇储存。因此，我们询问LDAH功能的获得和丧失如何影响两个原型LXR靶基因的表达：ATP结合盒Abca1和Abcg1。如图6A所示，在oxLDL处理的PM中，LDAH过表达和缺乏分别显著诱导和降低这两种基因的表达。为进一步研究LDAH对泡沫细胞转录组的影响，我们进行RNA测序（RNA-seq）分析。用oxLDL处理的LDAH Tg和WT PM之间的比较发现，在FDR校正的p值（q值）<0.05时，有872个差异表达基因（DEGs）。反过来，LDAH-KO和WT对照之间的比较在q<0.05时确定了87个DEGs。在两次RNA-seq分析之间的九个常见靶点中，有四个受到LDAH缺乏和过表达的相互调节，包括Col1a1基因，该基因在LDAH Tg PM中上调，在LDAH-KO PM中下调（图6B）。接下来，我们寻找在Tg或KO巨噬细胞中q<0.05时发生变化的基因，这些基因在相反的基因型中相互调节。在LDAH上调的246个基因中，胶原稳态有多个参与者（图6C），对该基因列表的基因本体富集分析返回几个与细胞外基质（ECM）合成和组织相关的术语。使用qPCR，我们证实编码I型胶原纤维两条主链的Col1a1和Col1a2基因在LDAH-Tg和LDAH-KO巨噬细胞中分别上调和下调（图6D）。通过ELISA，我们还发现用oxLDL处理的LDAH-Tg-BMM中的前胶原I-alpha水平升高（图6F）。这些促纤维化的变化与我们在动脉粥样硬化研究中持续观察到的胶原蛋白沉积增加相一致。
LDAH转基因超表达显著（q＜0.05）影响先前研究中（这些研究进行了巨噬细胞基因组范围的ChIP序列和转录分析）识别的98个基因的表达以识别由LXR激动剂激活和表达的基因。然而，尽管qPCR对PM的分析发现LDAH调节的Abca1和Abcg1增加，但在RNA序列分析中未识别这两个基因。通过蛋白质印迹，我们证实用oxLDL处理的BMM中ABCA1蛋白较高。为进一步研究LDAH是否以LXR依赖的方式诱导Abca1和Abcg1，我们使用混合siRNA敲除LXRα和LXRβ。一些使用游离氧甾醇或合成LXR激动剂的研究表明，Abca1表达中LXRα与LXRβ之间存在冗余，而其他研究，包括LXR激活主要由内源性配体驱动的独立动脉粥样硬化研究，在LXRα缺乏的情况下没有看到LXRβ的补偿，这表明根据激动剂的剂量、类型或来源等实验变量，反应可能存在差异。在oxLDL处理的BMM中，单独敲除LXRα可降低Abca1的表达，而敲除LXLβ则没有影响。与PM一样，LDAH-Tg巨噬细胞对oxLDL（50μg/mL，48小时）的Abca1、Abcg1和Col1a1的诱导作用比WT对照组更强（图6E）。然而，与LXR缺失机制一致，在LXRα敲除下，LDAH-Tg巨噬细胞中Abca1、Abcg1和Col1a1的增强表达受到阻碍（图6E）。此外，用合成LXR激动剂TO901317治疗挽救了LDAH-KO巨噬细胞中Abca1、Abcg1和Col1a1的下调（图6G）。尽管一些可用的合成LXR激动剂具有很高的疗效，但它们向治疗学的发展受到了脂肪生成副作用的阻碍。相比之下，天然甾醇LXR配体可以避免脂肪生成陷阱，因为它们能够协调下调甾醇调节元件结合蛋白-1c（SREBP）-1c32-34的加工。我们的RNA-seq数据显示，一些脂肪生成酶，包括硬脂酰辅酶A去饱和酶-1（Scd1），在LDAH-Tg巨噬细胞中下调。因此，我们评估主要脂肪生成酶Scd1、脂肪酸合酶（Fasn）和乙酰辅酶A羧化酶α（Acaca）的表达，发现虽然这些基因的表达在用TO901317处理后被显著诱导，但转基因LDAH过表达不会影响（Acaca）甚至降低（Fasn、Scd1）这些基因的表达式（图6H）。总的来说，尽管这些研究不排除其他潜在的保护机制，但功能丧失和救援实验表明，LDAH通过LXR依赖机制诱导动脉粥样硬化保护和促稳定转录变化，而增强调节性甾醇脂解释放的干预措施可能被证明适合选择性增强LXR激活。
为评估LDAH对原代巨噬细胞的影响是否可能反映在体内，我们首先使用Kim等人（GEO PRJNA477941）的单细胞转录组测序数据评估LDAH在巨噬细胞亚群中的分布及其与其他基因的相关性，该研究包括总动脉白细胞和泡沫细胞。据报道，泡沫细胞主要由炎症转录物贫乏的群体组成。因此，富含促炎巨噬细胞簇的促炎细胞因子IL-1β在泡沫细胞中显著减少。相比之下，LDAH似乎在非炎症泡沫细胞中富集，并与LXRα和β、ABCA1和Col1a1在视觉上相关。此外，Pearson将LDAH与总动脉CD45+细胞（泡沫和非泡沫）中所有其他表达基因的相关性与基因本体分析相结合，确定了许多代谢调节因子，包括LXRα及其许多靶标，以及参与ECM稳态的基因，包括Col1a1和Col1a2，但产生的炎症基因和炎症相关术语数量较少。这些体内数据将LDAH与炎症较少的巨噬细胞群以及原代巨噬细胞转录组分析中鉴定的纤维化标志物和LXR靶点相关联。
接下来，我们使用高分辨率基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI-MSI）研究LDAH对WT和LDAH-Tg雄性小鼠病变中斑块甾醇酯原位积累的影响，该技术考虑组织切片中分析物的空间分布，因此可以将分析重点放在实际的动脉粥样硬化病变上。与用于动脉粥样硬化研究的小鼠一样（图2B），在20周龄时，两种基因型的雄性小鼠的病变主要由Mac3阳性脂肪条纹组成，基因型之间Mac3与总病变面积的比率相似（图7A）。在原代巨噬细胞的鸟枪脂质组学中，LDAH过表达不影响磷脂酰胆碱（PC）和其他磷脂的水平，这些磷脂是细胞膜的丰富成分（图4A，B）。一致地，WT和Tg小鼠病变之间对应于主要PC物种的总离子计数（TIC）归一化图像的强度相似（图7B）。相比之下，与原代巨噬细胞的脂质组学数据一致，与分析中鉴定的主要CE物种相对应的图像强度在LDAH Tg小鼠的病变中总体上低于其WT同窝小鼠（图7C、D）。此外，与m/z值化合物和与氧化甾醇酯匹配的预测分子式相对应的成像数据的定量也显示转基因小鼠病变中的强度较低，这表明LDAH也会影响体内广泛的酯化甾醇物种（图7E）。
为分析基因表达，我们使用激光捕获显微切割（LCM）从WT和LDAH Tg雄性小鼠的病变中选择性分离巨噬细胞。与原代巨噬细胞一样，LdahTg/0Apoe−小鼠的巨噬细胞/泡沫细胞中Abca1、Col1a1和Col1a2基因的表达高于Ldah0/0Apoe/-litermates，而脂肪生成基因Fasn和Acaca的表达在基因型之间保持相似（图7F）。LXR激活抑制炎症，巨噬细胞在胶原稳态中的作用高度依赖于它们的极化状态。虽然经典激活的促炎巨噬细胞主要是胶原蛋白分解的，但替代激活为修复表型与胶原蛋白合成增加和降解减少有关。精氨酸酶1（Arg1）是生成胶原蛋白合成脯氨酸前体的关键酶，也是替代性巨噬细胞活化的常见标志物，其在动脉粥样硬化斑块中的表达被证明是LXRα依赖性的，在我们的RNA-seq分析中在LDAH-Tg-PM中上调，在LDAH-Tg病变巨噬细胞中也显著升高（图7F）。此外，在LDAH-Tg泡沫细胞中，抗炎细胞因子Il10的表达显著诱导了约4倍，促炎细胞因子Il18的表达显著降低（图7F）。其他促炎介质的mRNA水平也有非统计学意义的显著降低，包括Tnfa、Il1b、Cox2和两种先前在体内高胆固醇血症反应中发现降低的趋化因子Cxcl9和Cxcl10（图7F）。先前发现LXR下调的两种基质金属蛋白酶Mmp2和Mmp9在LDAH-Tg巨噬细胞中的表达也显著降低，而金属蛋白酶组织抑制剂-1（Timp1）的表达上调（图7F）。
总之，动脉粥样硬化病变的体内分析也支持LDAH在动员各种酯化甾醇（包括内源性LXR配体）中的作用。动脉粥样硬化环境中泡沫细胞的基因表达分析表明，LDAH促进了巨噬细胞的修复表型，与胶原蛋白编码基因的上调平行，LDAH可以减轻炎症和巨噬细胞的胶原蛋白分解程序。LDAH的主要作用及其在泡沫细胞和动脉粥样硬化中的作用机制如图8所示。
总体而言，这些研究强调了LD作为调节性脂质的中央储存位点和代谢中心的作用，以及脂解信号在动脉粥样硬化发病机制中的重要性，以及与脂质积累增强相关的其他潜在疾病。
Goo YH, Plakkal Ayyappan J, Cheeran FD, Bangru S, Saha PK, Baar P, Schulz S, Lydic TA, Spengler B, Wagner AH, Kalsotra A, Yechoor VK, Paul A. Lipid droplet-associated hydrolase mobilizes stores of liver X receptor sterol ligands and protects against atherosclerosis. Nat Commun. 2024 Aug 2;15(1):6540. doi: 10.1038/s41467-024-50949-y. PMID: 39095402; PMCID: PMC11297204.
