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放射治疗常用于治疗中枢神经系统的所有癌症，包括原发性和转移性脑肿瘤。放射治疗的剂量取决于肿瘤的组织类型、分期、位置和大小。以内皮细胞功能障碍、衰老或细胞死亡为表现的血管病变是放射治疗的主要并发症，晚期可导致慢性炎症、脑实质损伤和认知能力下降。在癌症治疗方案期间给予的高剂量照射对包括血脑屏障和内皮细胞在内的各个脑区产生不利影响，与此相反，低剂量照射对血脑屏障的损伤要小得多。因此，正在努力确定化疗、免疫治疗和靶向治疗以及高精度放疗的多模式组合，以提高放疗的疗效并减少总体使用剂量。间充质干细胞（MSCs）是起源于中胚层的多种组织中存在的多能成体干细胞，基于间充质干细胞的疗法有望减弱对癌症生存者的放疗相关迟发效应。从组织来源的间充质干细胞获得有效的生物治疗产品的复杂性使其面临挑战。因此，需要建立一种同源和均质的间充质干细胞来源，以增强间充质干细胞分泌组的潜能，从而达到预期的治疗效果。诱导多能干细胞（iPSC）技术在增强基于细胞的治疗方面越来越成功，表明iPSC可作为用于细胞治疗的同质、可扩增和遗传可修饰的间充质干细胞来源。该研究的见解阐明了利用基于iMSC的再生疗法对抗放射治疗相关的器官损伤和放射治疗诱导的进行性神经变性的可能性。该研究发表在《Stem Cell Research & Therapy》，IF：7.1。技术路线：
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主要研究结果：
1、辐照(IR)可引起脑内皮细胞损伤
作者利用人脑内皮细胞系hCMEC/D3在完全内皮生长培养基中进行了试管形成实验，以检测IR对体外血管系统的影响。与对照未照射组(0 Gy)相比，单剂量15 Gy或30 Gy的IR照射后36 h，血管新生管的形成显著减少，节点和节段数量、节段长度和总网格面积显著减少，肢体数量增加（图1A）。由于血管新生管的形成需要有效的细胞-细胞和细胞-基底膜相互作用，作者利用球体形成实验评估了IR对hCMEC/D3粘附的影响。随着IR剂量的增加，球体的致密性降低，球体的破坏增强，表现为钙黄绿素AM染色的细胞面积覆盖增加，以及细胞完整性的丧失，表现为bobo3-碘化染色的增加。hCMEC/D3球体在照射剂量≥10 Gy后24小时内发生了显著变化，在照射剂量为5 Gy时，球体在监测36小时时发生了明显的破坏（图1B,C）。当hcmec /D3接受0 Gy或5 Gy照射时，在5 Gy照射后24小时，观察到无论培养基(EndoGro或EGM2)，hcmec /D3的活力均下降（图1D）。![]()
图1 照射后血管内皮细胞表型
2、iMSC分泌素治疗可减轻IR诱导的脑内皮细胞损伤
将AD-MSCs、BM-MSCs和iMSCs在无血清的基础RPMI培养基中饥饿，并在24 h、48 h和5 d后连续收集CM，以比较不同来源的MSC分泌组的效力（图2A）。血清饥饿5天不影响iMSCs的活力和细胞表面标记表达的保留（图2B，C）。所有后续实验均在预处理5天后使用iMSC CM进行，因为iMSC CM和组织来源的MSC CM对hCMEC/D3活力的影响相当（图2D）。在不同剂量(0-15 Gy)照射的hCMEC/D3中，iMSC CM处理改善了细胞活力，同时减少了caspase 3/7介导的凋亡，与辐射剂量无关（图3A）。在hCMEC/D3中，5 Gy的IR显著增加了活性氧(ROS)的水平，而iMSC CM处理抑制了IR诱导的ROS的产生（图3B）。单层培养hCMEC/D3，给予不同剂量(0~30 Gy)照射，观察iMSC CM对内皮细胞-基质黏附的影响。IR呈剂量依赖性降低hCMEC/D3黏附。iMSC CM也改善了IR诱导的细胞黏附减少（图3C）。接下来，作者研究了IR和iMSC CM对hCMEC/D3球体形成的影响，以测量细胞-细胞粘附。作者观察到hCMEC/D3细胞在完全内皮生长培养基(EndoGro和EGM2)的存在下形成紧密的球体;然而，5 Gy的IR剂量足以破坏球体的致密性，从而减弱细胞-细胞接触。在RPMI培养基中无法形成细胞球，而在iMSC CM中培养的hCMEC/D3细胞球形成，且无论IR给药剂量如何，细胞球均更致密。钙黄绿素AM/BOBO3i(Live/Dead)染色显示在iMSC CM存在下BOBO3i阳性死亡细胞比在RPMI CM存在下少，表明iMSC分泌蛋白对细胞死亡的保护作用（图3D）。作者还评估了从受照射的iMSCs中获得的分泌组的效果是否与从未受照射的iMSCs中获得的分泌组的效果相当。作者观察到在iMSC CM存在的情况下，hCMEC/D3球体的细胞活力和致密性显著增加，无论iMSCs预先给予IR（图3E）。![]()
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图3 iMSC分泌组对IR诱导的内皮细胞损伤的影响3、iMSC分泌蛋白促进内皮管形态形成和血管生成
通过内皮管形成实验检测iMSC CM对hCMEC/D3细胞血管生成的影响。作者发现，iMSC CM引起明显的hCMEC/D3黏附和扩散，以及血管生成芽和短内皮管的形成（图4A，B）。iMSCs经5 Gy照射后收集的CM保留了hCMEC/D3的促血管生成作用。虽然作者只观察到CM处理后内皮细胞形成了短管，但iMSC CM处理促进了iMSC单培养中更完整的管网络的形成。因此，作者下一步评估iMSCs和内皮细胞共培养是否会增强内皮管的形成。hCMEC/D3与iMSCs共培养6 h可形成血管网，而iMSC
CM可更好地维持血管网36 h。将hCMEC/D3细胞经钙黄绿素AM染色后，经0 Gy或5 Gy照射，在iMSC CM存在的情况下与CellTracker red染色的iMSCs共培养，测定管腔形成的动态变化。有趣的是，iMSCs开始形成一个显著的管网，内皮细胞沿着iMSC网的路径，在iMSC CM存在的情况下，这种路径增强。共培养24-36小时后，在iMSC CM存在的情况下，hCMEC/D3细胞和iMSCs在节点和血管生成管中完全对齐（图4C）。![]()
图4 iMSC分泌组促进内皮细胞管形成
hCMEC/D3细胞接受或不接受iMSC CM处理，并进行磷酸化激酶组分析，以确定iMSC CM影响的信号通路的变化。经iMSC CM处理后，PYK2和PRAS40的磷酸化有增加的趋势。PYK2和PRAS40分别与黏着斑激酶和PI3K3/mTOR通路相关。作者还发现，iMSC CM抑制hCMEC/D3细胞中DNA损伤反应蛋白Chk2的磷酸化。此外，在iMSC
CM存在的情况下，Wnt/β-catenin通路和应激反应通路的调节因子的表达有增加的趋势（图5）。此外，作者使用在血管内皮细胞标记flk1/vegfr2基因启动子控制下表达EGFP的Tg(flk1-EGFP)斑马鱼模型评估了iMSC CM对体内血管生成的影响。将去绒毛膜的斑马鱼胚胎在iMSC CM中培养24小时，头部和躯干区域的正常形态和显著的EGFP表达，与在自然生长环境中观察到的相似，Zf-H2O，但在RPMI培养基中受到影响。图6显示了iMSC CM处理组头部和躯干区域flk1/vegfr2：EGFP的表达显著高于RPMI组，而Zf-H2O和iMSC CM处理组之间没有显著变化，表明iMSC分泌蛋白能够促进接近正常的体内血管生成（图6）。![]()
图5 iMSC分泌组对内皮细胞信号通路影响的Kinome分析
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图6 iMSC分泌组在体内的促血管生成作用
4、iMSC分泌组含有促血管生成和免疫抑制因子
作者利用斑点杂交膜和各种促血管生成或抗血管生成和免疫调节细胞因子来探索iMSC分泌组的组成。利用STRING数据库对iMSC分泌组中识别的因子进行功能注释。基于聚类分析，在包含CXCL8、IL6和MCP-1 (CCL2)的分析物聚类中，ANG与CXCL8相关。RANTES (CCL5)和SDF-1 (CXCL12)形成独立的聚类，其中RANTES (CCL5)与CXCL8的关系更密切;因此，CXCL8处于各种互联集群的最前沿。通路共用数据库(Pathway Commons
database)验证了IL6与CCL2在共表达方面的相互作用(红线)，其中的连接被颜色编码为红色(共表达)、蓝色(结合)、橙色(修饰)和灰色(其他)，从而解释了IL6和CCL2在所有条件培养基中的共同产生，而不考虑细胞来源和收获时间。基于GO分析，ANG, CXCL8和CCL2被注释为血管生成，所有分析物都与免疫调节相关。Reactome通路分析进一步揭示了CCL2、IL6和CXCL8与IL-10、IL-4和IL-13信号通路的关联；Gro-α(CXCL1)和RANTES (CCL5)与IL-10信号传导相关，这解释了免疫抑制表型的诱导（图7A）。作者利用MEME suite 5.5.4中可用的工具评估了在iMSC CM中检测到的6个分子的启动子区域的转录因子(TF)结合基序。其中，酵母GATA因子(DAL80)、雄激素受体(ANDR)、干扰素调节因子(IRF1)、锌指蛋白(ZNF)和TFAP2转录因子(TFAP2A/C)是最常见的tf结合基序。通过使用Swiss
Regulon在3-4 kb启动子区域确定共同的tf结合位点，作者进一步证实了TFAP2以及其他tf的结合基序的存在。因此，作者使用GTRD数据库进一步研究了这些常见的TF基序在这6个分子启动子区域的出现频率，这些基序通过MEME suite确定。在其他TF基序中，ANDR结合位点最为丰富，在所有6个分子的启动子中至少有≥18个结合位点，其次是每个启动子中≥8个GATA2结合位点。作者使用浓度为5 μM和25 μM的雄激素信号传导抑制剂(ANDRi)阿帕鲁胺(RPMI培养基)处理iMSC，以验证雄激素级联对iMSC分泌组中分析物表达的调节作用。CM在第5天收获，并使用斑点印迹法分析分泌因子的存在。作者观察到，与对照未处理CM相比，在andri处理的iMSC CM中，分析物的信号强度总体呈下降趋势（图7B）。这些结果表明ANDR信号通路是调节iMSCs产生治疗因子的主要途径。IL6的信号强度下降百分比最大，其次是ANG、IL8和MCP1。由于IL6是血管生成和免疫调节的已知介质，因此作者使用抗体偶联的磁珠从iMSC
CM中去除IL6。作者检测到，在去除il6的iMSC CM存在时，hCMEC/D3活力显著增强，这与完整的iMSC CM存在时相当（图7B）。因此，iMSC CM中的其他因素或多种因素可能介导了对血管内皮细胞的有益作用。![]()
图7 iMSC分泌组中促血管生成因子的靶向分析
结论：
该研究结果表明，iMSCs产生促血管生成和免疫抑制因子，分析物包括MCP1, IL6, IL8和ANG，以及其他因子，这些共同作用减轻辐射诱导的血管损伤和免疫激活。因此，iMSC分泌蛋白治疗可能改善放射性脑损伤期间的辐射诱导的旁效应，并诱导长期癌症生存者的辐射防护和组织再生。参考文献：
Gupta K, Perkerson RB 3rd, Parsons TM, Angom
R, Amerna D, Burgess JD, et al. Secretome from iPSC-derived MSCs exerts
proangiogenic and immunosuppressive effects to alleviate radiation-induced
vascular endothelial cell damage. Stem Cell Res Ther. 2024 Jul 29;15(1):230.
doi: 10.1186/s13287-024-03847-5.![]()
常规分子实验：RNA测序，差异表达基因和通路分析
细胞实验：iPSC来源的间充质干细胞（iMSC）的制备，细胞培养，内皮细胞活力和粘附，体外和体内的血管生成评估，细胞共培养
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