帕金森病（PD）是一种神经退行性疾病，其特征是黑质（SN）中多巴胺能神经元的退化。神经炎症反应的激活在帕金森病中起着关键作用。间充质干细胞（MSCs）已成为治疗各种神经损伤的有前景的方法，但关于其在帕金森病的应用报道有限，其潜在机制尚不清楚。作者研究了临床级缺氧预处理嗅粘膜（hOM）-MSCs对PD模型和患者神经功能恢复的影响，以及对PD小鼠模型的预防作用。为评估hOM-MSCs暴露引起的神经炎症反应和神经功能恢复方面的改善，作者采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）、高通量测序（ATAC-seq）结合全长转录组亚型测序（ISO-seq）的转座酶可及染色质检测和功能检测。此外，作者介绍了一项I期首次人体临床试验的初始队列患者的研究结果，该试验评估了将hOM-MSC移植到重度PD患者椎管内的安全性和有效性。一项功能测定确定，hOM-MSCs分泌的转化生长因子β1（TGF-β1）在调节多巴胺能神经元线粒体功能恢复中起着关键作用。这种效果是通过改善SN中的小胶质细胞免疫调节和自噬稳态来实现的，这与神经炎症反应密切相关。从机制上讲，接触hOM-MSCs可改善神经炎症和神经功能恢复，部分由TGF-β1介导，通过激活位于PD病人的SN小胶质细胞中的间变性淋巴瘤激酶/磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（ALK/PI3K/Akt）信号通路。此外，椎管内移植hOM-MSCs改善神经功能的恢复，调节神经炎症反应，在PD患者中没有观察到任何不良反应。这些发现为TGFβ-1参与介导hOM-MSCs对PD神经功能恢复的有益作用提供了令人信服的证据。治疗和预防hOM-MSC可能是治疗PD的一种有前景和有效的神经保护策略。此外，TGFβ1可以单独使用或与hOM-MSCs治疗联合使用来治疗PD。该研究于2024年7月发表在《Military Medical Research》，IF 16.7分。
作者的OM-MSCs培养系统在光学显微镜下成功地产生径向排列的纺锤形细胞。使用免疫荧光检测STRO-1（基质细胞的标志物）和Nestin（干细胞的标志）的细胞内位置。用油红O对脂肪生成诱导剂诱导的细胞进行染色后，在细胞质中观察到红色脂滴，表明已经实现脂肪生成分化。在成骨诱导剂诱导后，茜素红染色显示细胞中形成红色矿化结节，表明成骨分化成功。上述步骤对于表征OM-MSCs至关重要，因为它们提供了它们分裂为脂肪细胞和骨细胞的潜力的证据，并证实它们的修复和再生能力。在扫描电子显微镜（SEM）下，OM MSC的表面显示出许多微绒毛。通过透射电子显微镜（TEM）对细胞的观察表明，OM MSC处于相对活跃的阶段，其特征是每个细胞中存在两个细胞核；两个细胞核均呈圆形或椭圆形，核仁突出。此外，在其他细胞器中观察到粗面内质网和线粒体。最后，流式细胞术检测显示，OM-MSCs中CD44、CD73、CD90、CD105、CD133和CD146的表达水平很高，而OM-MSCs不表达CD34和CD45，OMMSCs的纯度超过97%。
免疫荧光结果显示，与对照组相比，α-Syn组SH-SY5Y细胞凋亡显著增加，细胞骨架形态发生改变，轴突长度缩短。在常氧组中，细胞凋亡显著减少，细胞骨架形态得到改善。此外，缺氧组细胞凋亡、细胞骨架形态改善和轴突伸长最显著（图1a）。这些发现得到了蛋白质印迹和流式细胞术分析的进一步支持（图1b），这证实OM-MSCs对神经元具有保护作用，并且这种神经保护功能在hOM-MSCs中显著增强。
OM MSCs通过评估膜电位[5,5'，6,6'-四氯-1,1'，3,3'-四乙基苯并咪唑碳菁碘化物（JC-1）]和活性氧（ROS）对PD模型中的神经元线粒体发挥保护作用，这些是线粒体功能的指标。在α-Syn组中，与对照组相比，JC-1荧光强度显著降低，表明线粒体膜电位降低，ROS产生增加。另一方面，在常氧条件下，JC-1荧光强度增加，ROS产生减少。然而，缺氧诱导了JC-1荧光强度的最显著增加和ROS产生的减少。此外，透射电镜用于检查线粒体超微结构的变化。结果显示，与对照组相比，α-Syn组的线粒体明显肿胀和紊乱。相比之下，线粒体在常氧条件下似乎有所改善，但在缺氧处理后恢复最为显著（图1c）。综上所述，OM-MSCs保护神经元线粒体功能，缺氧预处理可增强其保护作用。
本研究旨在探讨OM-MSCs清除活化小胶质细胞中α-Syn的功效。免疫荧光结果显示，与对照组相比，α-Syn组BV2细胞中的α-Syn表达上调。与常氧组相比，缺氧组其表达降低（图1a）。蛋白质印迹分析（图1b）进一步支持这一发现，表明OM-MSCs对小胶质细胞具有清除能力，在缺氧条件下显著增强。通过评估BV2细胞中抗炎标志物CD206和促炎标志物IL-1β的表达水平，研究OM-MSCs对活化的小胶质细胞的免疫调节作用，特别是它们从促炎M1表型向抗炎M2表型的转变。Western印迹显示，与对照组相比，α-Syn组BV2细胞中CD206的表达显著下调，而IL-1β的表达显著上调。相反，在常氧组中，CD206表达增加，IL-1β表达减少，在缺氧组中观察到更大的影响（图1a）。Western印迹分析也证实这一发现（图1b），表明OM-MSCs通过促进小胶质细胞从M1表型转化为M2表型来发挥免疫调节作用，hOM-MSCs显示出更明显的免疫调节作用。
在PD模型中，进一步研究OM-MSCs对小胶质细胞自噬稳态的调节作用。透射电镜观察BV2细胞自噬体的形成，Western印迹检测溶酶体相关膜蛋白-2（LAMP-2）的表达。TEM结果显示，对照组中明显没有自溶体形成，而模型组中观察到自溶体的惊人激增；然而，自噬体内的溶酶体结构严重受损，膜不完整。在常氧组中，形成了自溶体，但数量减少，与模型组相比，溶酶体结构有所改善。相比之下，缺氧组溶酶体形成显著减少；然而，仍然存在具有完整溶酶体结构的自体溶酶体（图1c）。通过分析蛋白质印迹，作者证实这一发现的有效性（图1d），这表明hOM-MSCs改善了过度的自噬反应，并维持了自噬稳态，以促进小胶质细胞中α-Syn的降解和清除。
通过腹腔注射MPTP联合丙磺舒建立慢性PD小鼠模型。实验包括假手术和PD模型组。神经功能评分表明，PD组的总距离、平均速度和中心时间显著缩短，如旷场测试所测，而Tatarod测试的被动运动功能评分结果显示，总距离和潜伏期均显著缩短。酪氨酸羟化酶（TH）是DA合成中的限速酶，其表达与多巴胺能神经元的数量成正比。免疫组织化学用于检测小鼠SN内TH+细胞的变化；与假手术组相比，PD组的TH+染色显著减少。DA再摄取抑制剂2β-甲氧羰基-3β-（4-氟苯基）-（N-11C-甲基）托烷（CFT）基于苯基甲苯烷结构，11C-CFT与突触前膜多巴胺转运蛋白（DAT）具有高亲和力，反映了多巴胺能神经元在纹状体质通路中的功能。CFT-PET脑成像用于观察DAT在大脑不同区域的分布，揭示PD组双侧SN纹状体和海马区DAT的分布显著减少，表明多巴胺能神经元功能受损。提出神经免疫微环境的命题来解释PD的发生和进展。进行蛋白质印迹分析来检测SN中的蛋白质，包括α-Syn、促炎细胞因子[主要组织相容性复合体II类（MHC-II）和IL-1β]、抗炎细胞因子（CD206）和T细胞表型（CD8+和CD4+）。研究结果显示，PD组中α-Syn、MHC-II、IL-1β、CD8+和CD4+的表达显著上调，而CD206的表达显著下调。
采用旷场和Tatarod试验评估实验组的神经功能。结果表明，与假手术组相比，PD+PBS组的总距离、平均速度、中心时间和逃逸潜伏期显著降低。与PD+nOM MSCs组相比，PD+hOMMSCs组和Pre+hOM MSCs组在神经功能方面表现出最显著的改善（图2a，b）。因此，在帕金森病小鼠模型中，OM-MSCs移植增强了神经功能，而hOM-MSCs的预防和治疗显著改善神经功能。
通过免疫组织化学和玻片扫描评估hOM-MSCs对PD小鼠SN中多巴胺能神经元的保护作用，以确定TH+细胞的损失。与假手术组相比，PD+PBS组显示出TH+细胞的显著减少，而用nOM MSCs治疗则增加了TH+细胞。值得注意的是，PD+hOM MSC和Pre+hOM MSCs组TH+细胞的增加最为显著。同时，小胶质细胞活化标志物Iba1的免疫染色显示，与假手术组相比，PD+PBS组的Iba1+细胞和伪足数量显著增加。此外，在PD+nOM-MSCs组中，Iba1+细胞的数量减少，细胞形态恢复。PD+hOM MSC和Pre+hOM MSCs组也显示出Iba1+细胞数量的显著减少和细胞形态的显著恢复（图2a，c）。利用CFT-PET脑成像观察DAT在脑组织中的分布。结果表明，与假手术组相比，PD+PBS组SN、纹状体和海马中DAT的分布显著减少。相反，用nOM MSC处理导致DAT分布增加，而hOM MSC处理也导致显著增加（图2d）。使用[18F]F-DPA-PET脑成像证明活化的小胶质细胞线粒体外膜转运蛋白（TSPO）在脑组织中的分布。与假手术组相比，PD+PBS组脑组织内TSPO分布升高。然而，用nOM MSCs治疗导致TSPO水平降低，而hOM MSCs治疗显示出显著降低（图2d）。使用蛋白质印迹分析SN神经细胞，检测BAX、Bcl-2和胱天蛋白酶3的蛋白表达水平。结果表明，与对照组小鼠相比，PD模型小鼠的BAX和caspase 3表达显著增加，而Bcl-2表达显著降低。用nOM MSCs治疗导致BAX和caspase 3表达水平降低，Bcl-2表达水平升高。此外，PD+hOM MSC和Pre+hOM MSCs组的BAX和caspase 3表达水平显著降低，Bcl-2表达水平也升高。此外，还测量了SN中多巴胺能神经元分泌的DA及其代谢产物HVA的浓度。ELISA结果显示，与假手术组相比，PD+PBS组的DA和HVA浓度均显著降低。然而，PD+nOM-MSCs组导致DA和HVA水平升高。此外，PD+hOM MSC和Pre+hOM MSCs组的DA和HVA浓度均显著升高。
对JC-1和ROS进行流式细胞术分析，作为线粒体功能的指标，同时使用TEM检查线粒体超微结构的变化。流式细胞术分析显示PD+PBS组中JC-1水平显著降低和ROS产生的增加，相较于假手术组。相反，用nOM MSCs治疗导致JC-1水平升高，ROS产生减少。在PD+hOM-MS和Pre+hOMMSCs组中观察到JC-1水平最明显的增加和ROS产生的减少。TEM分析表明，与假手术组相比，PD+PBS组的线粒体表现出明显的肿胀和紊乱。虽然nOMMSCs改善了线粒体形态，但hOM-MSCs显示出最显著的线粒体结构恢复（图2e）。因此，OM-MSCs对神经元线粒体功能具有保护作用，hOMMSCs显著增强了这种保护功能。
采用蛋白质印迹法检测α-Syn、IL-1β和CD206蛋白表达水平的差异。研究结果显示，与假手术组相比，PD+PBS组的α-Syn和IL-1β显著升高，CD206显著降低。相反，在nOM MSCs治疗后，α-Syn和IL-1β水平均降低，而CD206水平升高。此外，在PD+hOM MSC和Pre+hOM MSCs组中，α-Syn和IL-1β均大幅下降，CD206显著增加。因此，移植hOM-MSCs显著提高了α-Syn的清除率，并促进PD小鼠模型中小胶质细胞向M2抗炎表型的转化。使用蛋白质印迹法评估SN中p50、p65、CD4+和CD8+的蛋白表达水平。值得注意的是，与假手术组相比，PD+PBS组p50、p65、CD4+和CD8+的表达明显上调。相比之下，PD+nOM MSCs组的表达水平有所下降，而PD+hOM MSCs和Pre+hOM MSC组均表现出明显的下调。因此，hOMMSC移植有效地抑制了PD小鼠模型SN中的炎症反应和T细胞浸润。
使用ATAC-seq结合ISO-seq确定PD细胞模型中hOM-MSCs的免疫调节和神经保护机制。检测到hOM-MSCs新开放的染色质区域、相应的转录本和相关基因表达的差异。使用聚类热图直观地描绘了OM MSC缺氧预处理前后ATAC-seq和ISOseq数据集中差异调节基因的共表达模式，以说明染色质可及性和基因表达水平的同时变化（图3a-c）。DeepTools、Boxplot和Venn图用于可视化ATAC-seq-read富集热图，以获得差异峰，评估单个样本中基因表达水平的异质性，并描绘共同发生的基因或表达水平的特定变化。根据KEGG通路类型对差异表达基因（DEGs）的注释结果进行分类。其中，表现出最显著富集的两条信号通路是细胞因子-细胞因子-受体相互作用和内质网中的蛋白质加工（图3d）。对选定细胞因子亚类的DEG进行层次聚类分析，并精心绘制网络相互作用图，在视觉上引人入胜的KEGG富集气泡图中展示了20条信号通路及其相应的基因。TGF-β1与15条信号通路相关，CXCL12与5条信号通路相关联，CXCL2与3条信号通路有关，而另外两个基因（NECTIN2和TNFRSF6B）仅与1条信号通路有相关性。CXCL12和CXCL2主要参与调节细胞趋化性，TGF-β1除了促进细胞分化外，还具有抗炎、免疫调节作用（图3e）。作者假设hOM-MSCs分泌TGF-β1，这是一种具有免疫调节作用的关键细胞因子。综合基因组学查看器（IGV）是一种高性能可视化工具，用于交互式探索支持各种类型数据的大型、全面的基因组数据集。IGV使用ATAC-seq和ISO-seq联合检测潜在的转化生长因子β结合蛋白1（LTBP1）和TGF-β1。hOM-MSCs中LTBP1的开放染色质区域位于染色质2上，从起始位点33288817延伸到终止位点33289228，而TGF-β1的开放染质区域则位于染色质19上，从启动位点44259010延伸到终止部位44261989。此外，转录覆盖率分析显示，缺氧组LTBP1和TGF-β1的表达水平显著升高（图3f）。RTqPCR定量显示，与常氧组相比，缺氧条件下OM MSCs中LTBP1和TGF-β1 mRNA水平显著上调（图3g）。Western印迹分析证实，与常氧对照组相比，缺氧组OMMSCs中TGF-β1的蛋白表达水平升高（图3g）。缺氧预处理前后ELISA评估显示，缺氧组细胞内和细胞外分泌的TGF-β1浓度显著增加，这与常氧对照组相反；在上清液样本中观察到明显更高的浓度（图3h）。
此外，在OM-MSCs的干预下，对来源于PD细胞模型的小胶质细胞进行ISO-seq。对照组1、对照组2和对照组3用作对照模型。常氧1、常氧2和常氧3接受nOM MSC干预。缺氧1、缺氧2和缺氧3接受hOM-MSC干预。对选定的DEG进行分层聚类分析，将具有相似或相同表达模式的DEG显示在聚类热图中（图3i）。基于KEGG通路分类，分析模型组和hOM-MSC干预组之间显著富集的DEGs和转录本，发现磷脂酰肌醇-3-激酶蛋白激酶B（PI3KAkt）信号通路是最显著的富集（图3j）。除了在KEGG富集泡图中鉴定出4条高度富集的途径及其相应的基因外，作者的分析还表明，PI3K-Akt信号通路中有23个差异富集的基因，Rap1信号通路中的10个差异富集基因，内吞途径中的4个差异富集基因，cAMP信号通路中只有2个显著富集的基因（图3k）。对模型组和nOM MSC干预组之间的DEGs进行分层聚类分析。此外，KEGG通路注释显示，基于各自的通路，两组之间的DEGs显著富集；然而，没有观察到PI3K-Akt信号通路的富集（附加文件1：图S5d）。还对nOM MSC和hOM MSC组之间的DEGs进行分层聚类分析，同时根据KEGG通路类型对DEGs和转录本注释进行显著富集分析；揭示了PI3K-Akt信号通路内DEGs的更高富集水平。因此，PI3K-Akt信号通路被认为在调节小胶质细胞功能中起着关键作用。
为阐明hOM-MSCs在帕金森病小鼠模型中的免疫调节和神经保护机制，使用scRNA-seq鉴定从PD小鼠模型中移植hOMMSCs获得的SN组织中的基因表达谱。利用均匀流形近似和投影（UMAP）算法，作者可以在二维空间内可视化所有组的不同细胞类型，包括小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、内皮细胞（EC）、单核吞噬细胞（MP）、神经母细胞、壁细胞、脉络丛细胞、T细胞、B细胞、室管膜细胞、红细胞和中性粒细胞（图4a）。为鉴定DEGs，在一个簇内超过10%的细胞中表达的基因被选择为平均对数（倍数变化）>0.25的DEGs。小胶质细胞是帕金森病的主要群体，在神经炎症反应的发病机制和进展中起着至关重要的作用。在nOM MSC治疗、hOM MSC治疗和预防中比较M1标记物（Cd86、Ccl5、Cxcl10和Tnf）和M2标记物（Il4、Il10、Cd163和Arg1）。与nOMMSC治疗组相比，hOM-MSC和Pre-hOM-MSC组的小胶质细胞显示出更强的M2转化倾向（图4b）。此外，作者进行基因集富集分析，以比较和分析hOM MSC和Pre-hOM MSC组与nOM MSC组之间的小胶质细胞基因集。富集气泡图确定了两条显著富集的途径及其相应的基因（图4c）。基因网络分析揭示了小胶质细胞中PI3K-Akt/雷帕霉素哺乳动物靶点（mTOR）信号通路的显著富集和相互作用（图4d）。当将hOM MSC和Pre-hOM MSC组与nOM MSC组进行比较时，富集分数的折线图显示小胶质细胞中PI3K-Akt/mTOR信号通路的上调（图4e）。因此，基于作者的进一步分析，PI3K-Akt/mTOR信号通路在PD小鼠模型的hOM-MSC治疗和预防过程中在小胶质细胞中起着关键作用。因此，基于作者的进一步分析，PI3K-Akt/mTOR信号通路在PD小鼠模型的hOM-MSC治疗和预防过程中在小胶质细胞中起着关键作用。
在仔细地将小胶质细胞分为详细的亚型后，它们被进一步分为7个不同的亚组。然后选择在集群中超过10%的细胞中表达的基因作为DEGs（图4f，g）。对不同组别的小胶质细胞亚群进行KEGG富集分析。将PD+hOM MSCs和Pre-hOM MSCs组与PD+PBS组进行比较，观察到小胶质细胞_2和_4的PI3KAkt信号通路显著富集（图4h）。在所研究的各种细胞群中，小胶质细胞和MP之间的相互作用尤其值得注意（图4i）。使用UMAP算法在二维空间内可视化所有组中捕获的MP细胞亚型，包括巨噬细胞、非经典和经典单核细胞、cDC1和cDC2（图4j）。细胞间相互作用分析是基于所有亚型小胶质细胞和MP之间已知的受体-配体相互作用进行的。作者的分析显示，与PD+PBS组相比，PD+hOM MSCs和Pre-hOM MSCs组表现出小胶质细胞-4和所有其他细胞亚型之间显著增强的细胞间相互作用（图4k）。当比较PD+hOM-MSCs组和PD+PBS组时，发现三对受体配体之间的细胞间相互作用差异最为显著，包括蛋白酪氨酸磷酸酶受体C型（PTPRC）（经典单核细胞）-CD22（小胶质细胞_4）、CD28（巨噬细胞）-CD86（小胶质）和CD74（小胶质电池_4）-巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）（MP）（图4l）。进行了相同的方法分析，以比较Pre-hOM MSCs组和PD+PBS组。值得注意的是，在三对受体配体之间观察到了显著差异，包括IL1B（MP）-肾上腺素受体β2（ADRB2）（小胶质细胞）、G蛋白偶联受体37（GPR37）（MPs）-前丝素（PSAP）（小神经胶质细胞_4）和CD74（MP）-MIF（小胶质）（附加文件1:图S5m）。因此，在PD小鼠模型的hOM-MSC治疗和预防过程中，PI3K-Akt信号通路在小胶质细胞_2和_4中起着至关重要的作用。此外，PTPRC-CD22、CD28-CD86、CD74-MIF、IL1B-ADRB2和GPR37-PSAP受体配体之间的相互作用可能会显著影响小胶质细胞免疫和吞噬作用的调节。在Pre-hOM MSC组和PD+PBS组之间进行相同的方法分析。
在进行高通量测序分析后，比较hOM-MSC干预后小胶质细胞PI3K-Akt通路图中的差异基因富集情况。作者的研究结果表明，位于细胞外的生长因子通过与受体酪氨酸激酶结合来激活PI3KAkt信号通路（RTK）。此外，TGF-β1是一种存在于生长因子中的蛋白质因子，间变性淋巴瘤激酶（ALK）是一种RTK，属于TGF-β1的I型受体。基于上述分析，作者提出hOM-MSC分泌的TGF-β1可能通过与表达ALK的小胶质细胞膜受体结合激活PI3K-Akt信号通路来调节免疫反应。
慢病毒载体用于在hOMMSCs中产生特异性靶向TGF-β1 mRNA的shRNA，而针对细胞表面受体ALK的siRNA则用于BV2小胶质细胞。Western印迹结果证明所构建的两种mRNA干扰试剂的显著功效，可用于后续的功能验证实验（图5a）。研究了TGF-β1介导的hOM-MSCs对PD细胞模型神经元的神经保护作用，以及小胶质细胞调节免疫反应和清除α-Syn的能力。通过神经元标记物NeuN和凋亡标记物BAX的双重染色，与hOM MSCs组相比，hOM MSCs+shRNA TGF-β1组的凋亡细胞增加。相反，TGF-β1组凋亡细胞显著减少，而TGF-β1+siRNA ALK组凋亡细胞明显增加（图5b）。此外，BAX蛋白的Western印迹分析提供了额外的证据，支持TGF-β1介导的hOM-MSCs对PD细胞模型中神经元的保护作用（图5c，d）。进一步评估各组小胶质细胞中α-Syn、M1标志物（IL-1β）、M2标志物（CD206）和自噬相关LC3B表达的水平。Western印迹分析显示，相较于hOM-MSCs组，hOM MSCs+shRNA TGF-β1组表现出α-Syn、IL-1β和LC3B蛋白表达上调，而CD206蛋白表达显著下调。相反，TGF-β1组显示α-Syn、IL-1β和LC3B的表达降低，但CD206的表达增加。在TGF-β1+siRNA ALK组中，α-Syn、IL-1β和LC3B的水平显著上调，而CD206的表达显著下调（图5c，d）。为评估TGF-β1介导的hOM-MSCs对PD细胞模型中炎症因子的调节作用，在每个实验组的细胞上清液中评估了促炎细胞因子（IL-1β和TNF-α）和抗炎细胞因子（IL-4和IL-10）的水平。ELISA结果显示，与hOMMSCs组相比，hOMMSCs+shRNA TGF-β1组上清液中IL-1β和TNF-α的浓度显著增加，而IL-4和IL-10的浓度显著降低。此外，TGF-β1组上清液中IL-1β和TNF-α的水平显著降低，同时IL-4和IL-10的浓度显著升高。TGF-β1+siRNA ALK组IL-1β和TNF-α的浓度显著升高，而IL-4和IL-10的水平显著降低。因此，TGF-β1介导hOM-MSCs调节小胶质细胞免疫表型、自噬和α-Syn清除的能力。此外，单独施用人重组蛋白TGF-β1也能够实现这些功能。
测定了hOM-MSCs通过激活小胶质细胞分泌TGF-β1的PI3K-Akt信号通路进行的免疫调节。在实验组中评估PI3K-Akt信号通路的磷酸化状态、mTOR介导的细胞活性和自噬稳态的调节，以及参与免疫炎症反应的核因子κB（NF-κB）家族成员（p50和p65）和LC3B自噬相关蛋白的水平。Western印迹结果显示，与对照组相比，α-Syn组的PI3K、Akt和mTOR磷酸化水平显著降低，而p50、p65和LC3B的磷酸化水平明显上调。相反，hOM-MSC干预导致PI3K、Akt和mTOR磷酸化水平显著升高，同时p50、p65和LC3B下调。相比之下，hOM MSCs+shRNA TGF-β1干预导致PI3K、Akt和mTOR的磷酸化水平受到抑制，而p50、p65和LC3B被激活（图5e）。通过检测人重组蛋白TGF-β1对PI3K-Akt信号通路激活的影响，研究其在小胶质细胞中参与免疫调节的情况。在这些实验组中评估了PI3K-Akt和mTOR信号通路的磷酸化状态，以及LC3B、p50和p65蛋白的水平。Western印迹结果显示，与对照组相比，α-Syn组PI3K、Akt和mTOR的磷酸化水平显著降低，而p50、p65和LC3B的磷酸化程度显著上调。相反，TGF-β1干预导致PI3K、Akt和mTOR磷酸化水平显著升高，同时p50、p65和LC3B下调。相比之下，TGF-β1+siRNA ALK干预导致PI3K、Akt和mTOR的磷酸化水平受到抑制，并激活了p50、p65和LC3B（图5f）。因此，hOM-MSCs分泌TGF-β1通过与小胶质细胞膜ALK受体相互作用进一步激活PI3K-Akt信号通路，从而调节免疫反应并维持自噬的稳态。
hOM-MSC移植通过与表达ALK的小胶质细胞膜受体结合，分泌TGF-β1并激活PI3K-Akt信号通路的能力得到进一步证实，从而在PD小鼠模型中发挥了调节免疫反应和神经保护功能。慢病毒载体用于在hOMMSCs中产生靶向TGF-β1 mRNA的shRNA，而在PD小鼠模型中，AAV用于产生靶向小胶质细胞表面受体ALK的AAV ALK。
通过检测TGF-β1与小胶质细胞膜上的ALK受体的结合，然后调节hOM-MSCs，研究TGF-β1在帕金森病小鼠模型中的治疗潜力。使用开放场和Tatarod试验评估实验组的神经功能。研究结果表明，与PD+hOMMSCs组相比，PD+hOM MSCs+shRNA TGF-β1组的总距离、平均速度、中心时间和潜伏期显著降低，PD+TGF-β1组别的上述神经功能指标显著增加，而PD+AAV ALK+TGF-β1与PD+TGF-β1组相比则显著降低（图6a、b）。用多巴胺能神经元标记物TH进行免疫组织化学染色后，进行玻片扫描以观察SN中TH+细胞的损失。结果显示，与PD+hOM-MSCs组相比，PD+hOM MSCs+shRNA TGF-β1组的TH+细胞损失比例显著降低。TGF-β1治疗大大减轻了这一比例，而AAV ALK+TGF-β1的给药也导致减少（图6a，c）。用小胶质细胞活化标记物Iba1进行免疫组织化学染色后，进行玻片扫描，观察海马中Iba1+细胞的损失。结果表明，与PD+hOM-MSCs组相比，PD+hOM MSCs+shRNA TGF-β1组中Iba1+细胞的比例显著增加。TGF-β1治疗显著降低Iba1+细胞的比例，用AAV ALK+TGF-β1治疗也显示出这一比例的增加（图6a，c）。免疫荧光共定位结果表明，AAV ALK对PD小鼠模型SN中的小胶质细胞膜受体具有精确的靶向能力（图6d）。通过评估每个实验组SN组织中促炎细胞因子（IL-1β和TNF-α）和抗炎细胞因子（IL-4和IL-10）的水平，评估TGF-β1介导的hOM-MSCs对PD小鼠模型SN中炎症因子的调节作用。ELISA结果显示，与PD+hOM-MSCs组相比，PD+hOM MSCs+shRNA TGF-β1组中IL-1β和TNF-α的浓度显著升高。相反，IL-4和IL-10水平显著降低。此外，TGF-β1治疗导致IL-1β和TNF-α水平显著降低，同时显著升高IL-4和IL-10的浓度。另一方面，AAV ALK和TGF-β1的给药导致IL-1β和TNF-a水平升高，同时IL-4和IL-10的浓度大幅降低。因此，TGF-β1介导hOM-MSCs对小胶质细胞免疫表型的调节作用，单独的人重组蛋白TGF-β1也能够发挥这些作用。
在分泌TGF-β1的小胶质细胞中，进一步研究通过激活PI3K-Akt信号通路对hOM-MSCs的免疫调节。Western印迹结果显示，与假手术组相比，PD+PBS组PI3K、Akt和mTOR的磷酸化水平显著降低；然而，p50和p65的表达明显上调。相反，hOM-MSC治疗导致PI3K、Akt和mTOR磷酸化水平显著升高，同时p50和p65下调。相比之下，hOM MSCs+shRNA TGF-β1治疗导致PI3K、Akt和mTOR的磷酸化水平受到抑制，以及p50和p65的激活（图6e）。Western印迹结果显示，与假手术组相比，PD+PBS组PI3K、Akt和mTOR的磷酸化水平显著降低，同时p50和p65显著上调。相反，TGF-β1治疗导致PI3K、Akt和mTOR磷酸化水平显著升高，同时p50和p65下调。相比之下，AAV ALK+TGF-β1治疗抑制了PI3K、Akt和mTOR的磷酸化水平，以及p50和p65的激活（图6f）。因此，hOM-MSCs分泌TGF-β1通过与小胶质细胞膜ALK受体相互作用进一步激活PI3K-Akt信号通路，从而调节免疫反应（图7）。
共有5名患者接受hOM-MSCs的椎管内植入，然后在移植后进行血清和脑脊液分析，随后的随访期为1至6个月（图8a）。所有受试者对该手术耐受良好，术后期间未报告严重不良事件（图8a）。
该研究的第一位参与者是一名67岁的女性（病例1），她患有帕金森病已有20年。植入hOM-MSCs后，左旋多巴的口服维持剂量显著减少，从手术前的1.0 g/d降至0.5 g/d。患者的情绪、日常生活活动、运动测试和治疗并发症都有所改善。治疗一个月后，UPDRS总分从79分降至51分。此外，在Hoehn和Yahr评分量表（从3级到2级）以及Schwab和England日常活动量表（由50%恢复到70%）上均观察到改善。6个月随访期间获得的结果显示，UPDRS总分为69分，Hoehn和Yahr评分为2.5级，Schwab和England每日活动量表为60%。病例1对手术表现出良好的耐受性，在术后期间没有报告严重不良事件。
队列中的第二名参与者是一名79岁的男性（病例2），他被诊断患有帕金森病10年。植入hOM-MSCs后，左旋多巴的口服维持剂量从手术前的0.75 g/d显著降低到0.25 g/d。患者表现出情感、日常生活工具活动和运动功能评估的增强。治疗一个月后，UPDRS总分从89分降至61分。此外，在Hoehn和Yahr评分量表中观察到从3级到2级的改善。Schwab和英格兰每日活动量表显示，从50%恢复到70%。术后6个月的随访结果显示，UPDRS总分为78分，Hoehn和Yahr评定量表为3级，Schwab和England每日活动量表为60%。病例2对该手术表现出极好的耐受性，术后期间未报告严重不良事件。
该I期试验队列中的第三名参与者是一名67岁的男性（病例3），他被诊断患有帕金森病已有20年。补充hOM-MSCs后，左旋多巴的口服维持剂量从手术前的1.0 g/d显著降低到0.25 g/d。患者的情绪、日常生活活动、运动测试和治疗并发症都有显著改善。治疗一个月后，UPDRS总分从85分降至59分。此外，Hoehn和Yahr评分量表从3级提高到2级。施瓦布和英格兰的日常活动量表显示，从50%恢复到70%。术后6个月的随访结果显示，UPDRS总分为80，Hoehn和Yahr评分为3级，Schwab和England每日活动量表为50%（附加文件2：表S4）。病例3对手术表现出极好的耐受性，术后期间未报告严重不良事件。
该研究的第四名参与者是一名71岁的男性（病例4），他患有帕金森病4年。植入hOM-MSCs后，左旋多巴的口服维持剂量从手术前的1.5 g/d显著减少到0.25 g/d。患者的情绪、日常生活活动、运动测试和治疗并发症都有所改善。治疗一个月后，UPDRS总分从101降至55。此外，Hoehn和Yahr评分量表从4级提高到2级，Schwab和英格兰日常活动量表显示从30%恢复到60%。术后6个月的随访结果显示，UPDRS总分为81分，Hoehn和Yahr评定量表为3级，Schwab和England每日活动量表为50%。病例4对手术表现出良好的耐受性，术后期间未报告严重不良事件。
最后，队列中的第五名参与者是一名62岁的女性（病例5），她被诊断患有帕金森病已有13年。植入hOM-MSCs后，左旋多巴的口服维持剂量从手术前的1.5 g/d显著降低到0.5 g/d。患者的情绪、日常活动和运动测试都有所改善。治疗一个月后，UPDRS总分从75分降至53分。此外，Hoehn和Yahr评分量表从3级提高到2级，Schwab和英格兰日常活动量表从50%恢复到70%。术后6个月的随访结果显示，UPDRS总分为70分，Hoehn和Yahr评分量表为3级，Schwab和England每日活动量表为60%。病例5对手术表现出良好的耐受性，术后期间未报告严重不良事件。
Western印迹结果显示，TGF-β1和CD206的蛋白表达上调，而IL-1β在细胞移植后5天和11天下调。这些变化表现出时间依赖性的渐变。ELISA结果显示，与细胞移植后5天和11天的移植前水平相比，细胞治疗后多巴胺（DA）水平显著升高，同时存在抗炎因子TGF-β1、IL-4和IL-10。此外，细胞移植后5天和11天，促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的浓度显著降低。这两种变化也表现出随时间变化的梯度（图8c，d）。总体而言，5名帕金森病患者在接受hOM-MSCs治疗后，神经功能得到有效改善，术后期间没有发生任何严重不良事件。
据作者所知，这项研究首次尝试研究临床级hOM-MSCs对PD模型和患者神经功能恢复的影响，以及它们在PD小鼠模型中的潜在预防作用。总的来说，数据表明，hOM-MSC分泌的核心功能因子TGF-β1通过改善SN中的小胶质细胞免疫调节和自噬稳态，在hOM-MS调节多巴胺能神经元线粒体功能的恢复中起着关键作用，这些都与神经炎症反应密切相关。从机制上讲，暴露于hOMMSCs可部分通过TGF-β1介导的激活PD患者SN内小胶质细胞中的ALK-PI3K-Akt信号通路来增强神经炎症反应和神经功能恢复。此外，hOM-MSCs的椎管内移植已被证实可以改善PD患者的神经功能恢复，并调节神经炎症反应。因此，作者建议使用hOM-MSCs进行治疗和预防可能是治疗PD和其他进行性炎症相关神经退行性疾病的有前景和有效的神经保护候选药物。这些发现增加了TGF-β1可以单独使用或与hOM-MSCs联合用于PD治疗的可能性。
Zhuo Y, Li WS, Lu W, Li X, Ge LT, Huang Y, Gao QT, Deng YJ, Jiang XC, Lan ZW, Deng Q, Chen YH, Xiao Y, Lu S, Jiang F, Liu Z, Hu L, Liu Y, Ding Y, He ZW, Tan DA, Duan D, Lu M. TGF-β1 mediates hypoxia-preconditioned olfactory mucosa mesenchymal stem cells improved neural functional recovery in Parkinson's disease models and patients. Mil Med Res. 2024 Jul 22;11(1):48. doi: 10.1186/s40779-024-00550-7. PMID: 39034405; PMCID: PMC11265117.
