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尽管癌症免疫疗法取得了突破，但其疗效在患者中似乎存在异质性，而调节肠道微生物群是提高免疫疗法疗效的潜在策略。MS-20，也称为“Symbiota®”，是一种由多种益生菌和酵母菌株发酵大豆基质产生的富含微生物代谢产物的后生元，先前研究显示MS-20在小鼠异种移植模型中诱导乳腺癌细胞凋亡并抑制肿瘤生长。该研究作者发现MS-20与抗PD1抗体联合使用可抑制动物肿瘤生长。此外，MS-20调节的细菌与肿瘤抑制和CD8+T细胞浸润有关。MS-20治疗还通过增强以下基因的表达来调节肠道免疫力： CCL19、CCL21和防御素，与DC募集和激活有关。此外，使用来自癌症患者的粪便样本，MS-20在体外调节了免疫检查点抑制剂（ICI）反应性细菌的丰度。这些发现表明，MS-20可能是一种很有前途的佐剂，可以将冷肿瘤转化为热肿瘤，并增强免疫疗法的疗效。用于提高免疫检查点介导的抗肿瘤治疗的疗效。该研究于2024年7月30日发表在《GutMicrobes》上，IF：12.2。技术路线：
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主要研究结果：
1. MS-20与抗PD1抗体联合使用可抑制结肠和肺癌模型中的肿瘤生长作者首先在预防性方案中使用小鼠CT-26异种移植模型来评估MS-20和抗PD1抗体对结肠癌治疗的联合作用。从第0天开始，每天给小鼠口服载体对照或1%、5%或15%的MS-20，同时植入2×105 CT-26细胞时。在第6、8、10和12天，给小鼠腹腔注射抗PD1抗体。与之前的研究一致，与载体对照组相比，单独使用抗PD1疗法可显著地减少肿瘤体积，但幅度不大。有趣的是，在与抗PD1抗体联合治疗的组中，肿瘤生长抑制的程度似乎与MS-20的剂量成正比。进一步在与临床观察相似的方案中测试了MS-20的效果。如图1a所示，分组后每天给药MS-20，并在指定时间点通过腹腔注射给药抗PD1抗体。与载体对照组和仅使用抗PD1抗体治疗组相比，MS-20和抗PD1抗体联合治疗显著降低了40%-70%的肿瘤生长（图1b）。同样，联合治疗组的平均肿瘤体积也显著低于载体对照组和抗PD1单药治疗组（图1c）。为了阐明MS-20单独使用的抗肿瘤作用，在肿瘤生长后，每天将小鼠随机分配接受载体对照组或1%、5%或15%的MS-20口服治疗。不同剂量MS-20治疗组和载体对照组之间的肿瘤生长没有显著差异。还对BALB/c小鼠结肠癌模型的存活率进行了28天的监测，与对照组和单独使用抗PD1组相比，同时接受MS-20和抗PD1抗体的小鼠存活率最高（图1d）。除了对结肠癌治疗的影响外，作者还研究了MS-20对抗PD1抗体在肺癌动物模型中疗效的影响。同样，与对照组和单独使用抗PD1抗体组相比，MS-20和抗PD1抗体联合治疗显著降低了肿瘤的生长和重量。接下来，检查在免疫疗法的抗肿瘤作用中起关键作用的肿瘤浸润CD8+T细胞。虽然单独使用抗PD1抗体治疗往往会增加CD8+信号，但与对照组相比，MS-20和抗PD1抗体联合治疗进一步增加了肿瘤微环境中的CD8+信号，如免疫组织化学所示。免疫荧光染色还观察到，单独使用抗PD1或与MS-20联合使用后，CD8+信号呈增加趋势。进一步研究肿瘤浸润性CD8+T细胞的功能，方法是分析CD62L-CD44+T细胞以识别效应记忆CD8+T细胞，此前已证明这些细胞与中枢记忆CD8+T细胞相比，表现出细胞毒性标志物（包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、颗粒酶B和穿孔素）的表达上调，并表现出抗肿瘤活性。与载体对照和抗PD1组相比，MS-20与抗PD1抗体联合治疗显著增加了效应记忆CD8+T细胞亚群（图1e）。此外，还检查了在免疫疗法中充当免疫抑制标志物的PD1。单独的抗PD1疗法不会抑制PD1+细胞，而与MS-20联合治疗可显著抑制PD1+细胞（图1f）。这些数据表明，抗PD1抗体增加了总CD8+T细胞，而将MS-20添加到抗PD1抗体中则进一步调节了免疫肿瘤微环境，这是通过增加活化的CD8+T细胞群和下调免疫耗竭标志物PD1的表达来实现的。最后，使用抗CD8中和抗体来消耗CD8+T细胞群，并确认这些细胞在MS-20加抗PD1治疗的抗肿瘤活性中的作用。值得注意的是，在抗CD8中和抗体存在的情况下，联合治疗的肿瘤抑制作用完全消失（图1g）。总之，这些数据表明口服MS-20可以增强抗PD1抗体的抗肿瘤活性并延长小鼠的生存期。将MS-20添加到抗PD1抗体中进一步增加效应记忆CD8+T细胞亚群并下调免疫衰竭标志物PD1。![]()
图1.MS-20加抗PD1抗体在体内抑制结肠癌生长
2. MS-20诱导的肠道菌群丰富增强了抗PD1抗体治疗的疗效从载体组、MS-20组、抗PD1抗体组和MS-20加抗PD1抗体组收集了粪便样本，随后分析了微生物群组成，以评估MS-20对肠道微生物群的影响。虽然四组之间的α多样性没有差异，但MS-20加抗PD1抗体组的β多样性与其他组有显著差异。各组之间的细菌分类不同，尤其是在MS-20加抗PD1抗体组中。与载体对照组相比，MS-20处理略微增加了瘤胃球菌科和拟杆菌科的丰度。与抗PD1抗体组相比，MS-20加抗PD1抗体组中毛螺菌科和颤螺菌科的丰度降低，而乳酸杆菌科和坦纳菌科的丰度增加。进行线性判别分析效应大小（LEfSe）以识别不同组间丰度不同的细菌。比较了对照组和MS-20组之间以及MS-20加抗PD1组和单独抗PD1抗体组之间的粪便微生物概况。MS-20加抗PD1抗体组中乳酸杆菌科的成员鼠乳酸杆菌和坦纳菌科的丰度高于抗PD1抗体组。类似地，与对照组和抗PD1抗体组相比，MS-20组和MS-20加抗PD1抗体组属于乳酸杆菌科的Clostridiumcolinum和Tyzzerellaspp的丰度降低，属于颤螺旋菌科的Clostridiumleptum的丰度降低。接下来用结肠癌小鼠模型进行了FMT实验，以进一步研究MS-20处理的肠道菌群对肿瘤免疫治疗效果的影响。最初，给小鼠口服含有抗生素组合的饮用水以消耗肠道菌群。随后，给小鼠皮下接种CT-26肿瘤细胞，并在肿瘤生长后随机分为四组。每天给小鼠口服对照组或MS-20处理的粪便菌群，并在指定时间点注射抗PD1抗体（图2a）。与其他组相比，接受MS-20治疗的供体粪便与抗PD1抗体联合治疗的小鼠的肿瘤重量显著降低（图2b）。此外，使用流式细胞术分析了受体小鼠肿瘤微环境中各种免疫细胞的浸润。与其他治疗方法相比，MS-20FMT与抗PD1抗体联合使用显著增加了总CD8+T细胞的浸润（图2c-d），并且倾向于增加CD11c+MHCIIhigh树突状细胞的比例（图2c）。相比之下，各组之间CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞或总CD4+T细胞的百分比没有差异（图2c）。由于PD1具有免疫抑制作用，接下来检查了T细胞亚群中PD1阳性细胞的百分比。CD8+PD1+T细胞在抗PD1治疗后似乎有所减少，但仅在同时接受MS-20治疗粪便的小鼠中达到统计学意义（图2c），而CD4+PD1+T细胞也因抗PD1治疗而减少，并且在MS-20FMT加抗PD1抗体组中减少幅度更大。此外，联合组CD8+T细胞百分比的增加通过免疫组织化学进一步证实（图2e）。总之，肿瘤生长的抑制和肿瘤浸润CD8+T细胞的增加可归因于MS-20处理的肠道微生物群增强的抗PD1活性。![]()
图2.MS-20处理的粪便增强了抗PD1抗体的功效
接下来，评估FMT后受体小鼠的肠道菌群组成。四组之间的α多样性没有差异，而MS-20诱导的粪便菌群加抗PD1抗体组的β多样性与其他组有显著差异（图3a-b）。细菌分类学分析还显示MS-20FMT加抗PD1抗体组的细菌组成不同（图3c）。具体来说，在MS-20FMT加抗PD1抗体组中，毛螺菌科的丰度降低，而乳酸杆菌科、巴恩斯氏菌科和坦纳菌科的丰度增加（图3c）。LEfSe显示，与单独使用抗PD1抗体组相比，MS-20FMT加抗PD1抗体组中的Clostridiales、Clostridiumleptum、Candidatusarthromitus和Ruminococcusbromii有所增加（图3d）。相比之下，属于毛螺菌科的Clostridiumcolinum和Tyzzerellaspp.的丰度下降（图3d）。这一发现与先前的研究结果一致，在该研究中，Clostridiales与黑色素瘤患者的肿瘤浸润免疫细胞（如CD3+和CD8+细胞）呈正相关。此外，R.bromii在对免疫疗法有反应的肝细胞癌(HCC)和非小细胞肺癌(NSCLC)Akk+患者中富集。通过LEfSe鉴定的细菌（图3d）通过成对比较进行分析，使用非参数Spearman相关性与肿瘤重量（图2b）或CD8+细胞丰度（图2d）进行分析，以揭示肠道微生物群与抗肿瘤活性之间的相关性。有趣的是，MS-20加抗PD1抗体富集的细菌与肿瘤重量呈负相关，但与肿瘤微环境中的CD8+T细胞呈正相关。另一方面，用MS-20加抗PD1抗体治疗后丰度降低的细菌与肿瘤重量呈正相关，但与肿瘤浸润CD8+T细胞呈负相关（图3e）。在这些细菌中，在MS-20加抗PD1抗体组中富集的Epulopisciumspp.和R.bromii与肿瘤重量呈显著的负相关。此外，R.bromii与肿瘤内CD8+T细胞呈正相关（p<0.05）。值得注意的是，在口服MS-20的小鼠中，R.bromii的丰度趋于增加，与抗PD1治疗无关（图S4a）。此外，在有或没有抗PD1联合治疗的情况下，接受MS-20治疗供体FMT的小鼠中R.bromii也富集（图S4b）。相反，毛螺菌科细菌A2与肿瘤重量呈正相关，而毛螺菌科和毛螺菌科细菌A2与肿瘤微环境中的CD8+T细胞呈负相关（图3e）。综上所述，这些数据表明MS-20形成的独特微生物群组成在增强抗PD1抗体治疗的有效性方面起着关键作用。关键细菌种类，如R.bromii，与肿瘤重量减轻和肿瘤微环境中CD8+T细胞的浸润相关。![]()
图3.MS-20明显调节与肿瘤减少和CD8T细胞浸润相关的肠道微生物群
由于MS-20是口服给小鼠服用的，通过转录组分析研究了MS-20对小鼠结肠组织中信使RNA表达模式的影响。与对照组相比，基于KEGG网络分析，MS-20治疗组的IL-17信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用通路和TNF信号通路显着上调（图4a）。与抗PD1组相比，MS-20加抗PD1抗体治疗组中涉及细胞粘附分子、T细胞受体信号通路、肠道免疫网络IgA产生和白细胞跨内皮迁移途径的基因增加（图4b）。这些数据表明MS-20加抗PD-1抗体治疗可能调节肠道免疫细胞的成熟和归巢。不同实验组中差异表达基因（DEG）的层次聚类如图4c所示。IgA生成信号通路上游的基因，例如编码树突状细胞(DC)中MHC亚基的H2-Ob、对CD4活化很重要的Icos和编码B细胞活化因子受体的Tnfrs13c，在MS-20加抗PD1组中的表达水平高于载体对照组和抗PD1组(图4d)。此外，与载体对照组相比，编码参与T细胞活化的蛋白质的Grap2和Lat的表达在MS-20加抗PD1组中上调。联合治疗组中两种CCR7配体(CCL19和CCL21a)和CCR7的表达上调(图4e)。CCR7通常在双阴性和单阳性胸腺细胞（初始T细胞、中央记忆T细胞、调节性T细胞、初始B细胞、半成熟/成熟树突状细胞和NK细胞）上表达。CCR7充当关键调节器，引导稳态淋巴细胞进入次级淋巴器官。先前的研究表明，CCL19和CCL21是树突状细胞成熟和迁移的强效诱导剂。此外，CCL19/CCL21-CCR7轴对于T细胞和B细胞归巢至关重要。这些数据表明MS-20可能调节结肠细胞中免疫细胞吸引的细胞因子，但需要进一步的实验来证实这些发现。此外，属于α-防御素家族的Defa1、Defa3、Defa4和Defa23的基因表达水平因MS-20单独使用或MS-20加抗PD1治疗而增加。值得注意的是，人类α-防御素也是多种免疫细胞类型的化学引诱剂，例如未成熟的树突状细胞、巨噬细胞和肥大细胞。总体而言，单独口服MS-20或与抗PD1抗体联合使用会影响肠道免疫环境。![]()
图4.MS-20治疗后肠道免疫力增强
5. MS-20体外调节免疫治疗相关和结肠癌相关病理细菌为了研究体外微生物群落特征，建立一个离体粪便培养系统，用于研究MS-20是否能够调节癌症患者的微生物群落组成。从七名结直肠癌患者中采集粪便样本，然后用载体对照组或MS-20处理24小时。载体组和MS-20组之间的α多样性没有显著差异。β多样性分析显示存在显著差异，MS-20组的微生物群落与载体对照组不同（图5a）。MS-20处理导致微生物组成在科水平上与载体样品不同（图5b）。在MS-20存在下，毛螺菌科、瘤胃球菌科、双歧杆菌科和韦荣球菌科的丰度增加，而拟杆菌科、蛋杆菌科和消化链球菌科的丰度降低。差异丰度分析显示，MS-20处理后，几种免疫疗法应答相关细菌的丰度增加，包括Faecalibacteriumprausnitzii、Blautiawexlerae、Fusicatenibactersaccharivorans和Bifidobacteriumlongum。相反，MS-20处理后，无应答相关细菌的丰度降低，包括Hungatellahathewayi和Clostridiumsymbiosum（图5c）。此外，在结肠癌患者中富集的Bilophilawadsworthia和Enteroclosteraldensis的丰度在MS-20组中降低（图5c）。作者还收集了8个来自NSCLC患者的粪便样本进行分析。同样，MS-20处理后，F.prausnitzii、F.saccharivorans和Agathobaculumbutyriciproducens的丰度增加。这些结果共同表明MS-20调节与免疫疗法反应相关的细菌和可能与结肠癌病理有关的致病菌。RT-qPCR用于确定所鉴定的细菌与MS-20治疗之间是否存在相关性。MS-20给药显著增加了F.prausnitzii、F.saccharivorans和B.longum的丰度（图5d），并且F.prausnitzii和B.longum的丰度表现出剂量反应效应（线性混合回归模型，分别为p=0.021和p=0.005）。进一步分析微生物共现网络，以研究载体对照和MS-20治疗组之间的相互作用。MS-20治疗后，R.bromii与Parasutterellaexcrementihominis、Roseburiainulinivorans和F.saccharivorans呈正相关，但在载体对照组中未发现这些相关性（图5e）。在已鉴定的细菌中，R.inulinivorans和F.saccharivorans与免疫治疗反应有关。37在上述动物研究中，在口服或通过FMT从MS-20治疗的供体接受MS-20的小鼠中，R.bromii的丰度趋于增加（图3d和图S4）。在这里，研究人员还观察到在体外MS-20治疗后癌症患者粪便中R.bromii的水平升高（图5f），这表明R.bromii可能是受MS-20影响的关键细菌之一。随后进行了MetaCyc分析，揭示了MS-20治疗改变的几种途径（图5g）。在这些途径中，检测到MS-20治疗后硫胺素二磷酸生物合成和棕榈酸生物合成途径增加（图5h）。先前的研究确定了与结肠癌患者分期和生存期相关的微生物群风险评分，其中硫胺素二磷酸生物合成和棕榈酸生物合成途径在结肠癌风险较低的患者中富集。相反，组氨酸降解和B6生物合成途径被MS-20治疗下调（图5i），组氨酸降解途径在结肠癌风险较低的患者中减少。简而言之，这些数据表明MS-20治疗后降解和嘌呤降解减少。另一方面，MS-20组的L-异亮氨酸生物合成和支链氨基酸生物合成上调。有趣的是，在接受单独免疫疗法或联合化疗并经历较长总生存期的NSCLC患者的粪便分析中，核苷和核苷酸降解途径受到抑制，而涉及氨基酸生物合成途径的代谢途径上调。总之，MS-20调节了癌症患者体外的微生物组成和免疫疗法反应相关细菌。MS-20调节的微生物群的预测代谢途径可能与NSCLC患者晚期CRC风险较低和对免疫疗法反应较好有关。![]()
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图5.MS-20在体外调节癌症患者的微生物群
结论
MS-20与抗PD1抗体联合使用可抑制动物肿瘤生长。如FMT动物模型所示，用MS-20处理后观察到的不同肠道菌群增强了抗PD1抗体的功效并增加了肿瘤内CD8T细胞。此外，MS-20调节的细菌（如R.bromii）与肿瘤抑制和CD8T细胞浸润有关。MS-20治疗还通过增强以下基因的表达来调节肠道免疫力：CCL19、CCL21和防御素，与DC募集和激活有关。此外，使用来自癌症患者的粪便样本，MS-20在体外调节了免疫检查点抑制剂（ICI）反应性细菌的丰度。这些发现表明，MS-20可能是一种很有前途的佐剂，可以将冷肿瘤转化为热肿瘤，并增强免疫疗法的疗效。![]()
图6.MS-20的拟议作用机制
参考文献
LeePJ,HungCM,YangAJ,HouCY,ChouHW,ChangYC,ChuWC,HuangWY,KuoWC,YangCC,LinKI,HungKH,ChangLC,LeeKY,KuoHP,LuKM,LaiHC,KuoML,ChenWJ. MS-20 enhances the gut microbiota-associated antitumor effects of anti-PD1antibody.
GutMicrobes.2024Jan Dec;16(1):2380061.doi:10.1080/19490976.2024.2380061.![]()
生信分析：肠道微生物组成分析、KEGG功能分析、免疫浸润分析、Spearman相关性分析、基因集富集分析
常规分子实验：16S测序、实时PCR、免疫组化染色、实时荧光定量PCR、免疫荧光染色
细胞实验：流式细胞术、粪便微生物离体培养
动物模型及病理分析：皮下异种移植模型
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谢谢！
课题设计与申报|分子生物学实验|细胞功能|机制调控|多组学检测分析
