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食管鳞状细胞癌(Esophageal
squamous cell carcinoma, ESCC)是食道癌最常见的类型，多发于东亚国家。由于ESCC的发病隐匿，缺乏特定的生物标志物，大多数患者在诊断时通常会出现局部晚期肿瘤，总体生存率很低。肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境中最丰富的炎性细胞亚群，在ESCC发生和发展起重要作用。SUMO化是一种新兴的蛋白质修饰方式，通过调节蛋白稳定性，参与肿瘤免疫和炎症反应。然而，关于ESCC相关巨噬细胞中SUMO底物蛋白及其潜在机制尚未完全阐明。作者发现ESCC相关巨噬细胞的SUMO化修饰可以诱导巨噬细胞替代激活进而推动ESCC细胞增殖、迁移和侵袭。该研究于2024年8月发表在《Cell Communication and Signaling》，IF=8.2。技术路线：
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研究结果：
1. SENP3在ESCC巨噬细胞中上调
研究者发现与癌旁组织相比，ESCC中巨噬细胞的比例显著增加（图1A），同时，SENP3在ESCC组织巨噬细胞中显著积累（图1B和C）。研究者通过多重免疫荧光染色进一步验证SENP3的定位，与正常组织相比，肿瘤组织中CD68阳性巨噬细胞的SENP3显著上调（图1D和E），这是巨噬细胞的常见标志物。此外，与正常鳞状上皮相比，EC巨噬细胞中的SENP3逐渐上调。提示SENP3在巨噬细胞中积累可能与ESCC进展有关。![]()
图1 SENP3在ESCC巨噬细胞中上调
2. 巨噬细胞中SENP3的缺失促进体内和小鼠模型中ESCC进展
为研究巨噬细胞中SENP3对ESCC的影响，在体外诱导的巨噬细胞中敲除SENP3，培养并收集上清（图2A）。与NC组相比，经shSENP3条件培养基处理的体外ESCC细胞增殖和迁移能力（图2B-E）。此外，在动物实验中，shSENP3巨噬细胞上清液处理的ESCC细胞可以显著促进裸鼠肿瘤形成（图2F）。为了进一步研究SENP3在体内巨噬细胞中的作用，用化疗药物4-NQO（100mg/L）治疗SENP3敲降小鼠（图2G），与对照相比，巨噬细胞SENP3缺失促进了肿瘤生长（图2H）。免疫组化结果显示，Senp3 敲降小鼠食管组织中Ki-67阳性细胞的比例更高（图2I）。这些数据表明，巨噬细胞中SENP3的特异性缺失在体内和体外都能促进ESCC增殖和迁移，表明其具有抗肿瘤作用。![]()
图2 巨噬细胞中SENP3的缺失促进体内和小鼠模型中ESCC进展
3. 巨噬细胞中SENP3的缺失促进ESCC中巨噬细胞的替代激活
使用流式细胞术检测细胞表面抗原，发现SENP3缺失会增加CD206阳性巨噬细胞比例，表明SENP3对巨噬细胞的替代激活至关重要（图3A）。评估SENP3敲降的M0巨噬细胞和诱导的M2的代谢情况，发现SENP3敲降的M2细胞中的ECAR和OCR增加，表明糖酵解和线粒体呼吸水平上调（图3B和C）。此外，替代激活相关基因，包括MRC1、ARG1、CCL22、IL-10等，在SENP3缺陷的巨噬细胞中上调（图3D）。SENP3缺失组细胞上清液的分泌组检测表明，抗肿瘤因子（CCL5和IL-β）下调，促肿瘤因子（IL-10和TGF-β）上调（图3E）。巨噬细胞中SENP3的特异性缺失促进了替代激活，并构建了抑制性的免疫环境。随后，从对照和Senp3敲除小鼠中提取骨髓来源的巨噬细胞，诱导获得M2巨噬细胞进行RNA-seq，数据显示，Senp3缺失促进了几种促癌细胞因子的产生（图F和G）。总之，SENP3对巨噬细胞替代激活至关重要，SENP3缺失促进抑制免疫微环境的形成。![]()
图3 巨噬细胞中SENP3的缺失促进ESCC中巨噬细胞的替代激活
4. SENP3介导IRF4的K349位点去SUMO化
研究者使用JASSA软件预测并筛选了可能受到SUMO2/3修饰的转录因子，发现IRF4具有高SUMO修饰得分。通过体外Co-IP实验验证了SENP3与IRF4的结合（图4A）。发现IRF4在巨噬细胞替代激活后被SUMO2/3显著修饰（图4B）。通过突变IRF4的K349位点，证实此位点对IRF4的SUMO2修饰至关重要（图4C）。利用HEK293T细胞过表达SENP3 WT和SENP3 C532A突变体，证明SENP3能去SUMO2/3修饰IRF4（图4D）。SENP3的敲除增加了IRF4的SUMO2修饰，表明SENP3是IRF4的去SUMO化酶，且K349位点是SUMO2的结合位点（图4E）。以上实验结果表明，IRF4的SUMO化有助于提高巨噬细胞的替代激活能力，而SENP3通过去SUMO化作用调节IRF4的活性。![]()
图4 SENP3介导IRF4的K349位点去SUMO化
5. SUMO化修饰增强IRF4的稳定性并促进巨噬细胞的替代激活
WB实验证明SENP3介导的SUMO化可以调节IRF4的活性（图A和B）。流式细胞术检测发现，IRF4-K349R转染的巨噬细胞替代激活减少，IRF4的SUMO化水平可以显著增加CD206阳性细胞的比例。Flag-IRF4-WT和Flag-IRF4-1K349R转导的巨噬细胞之间CD206阳性细胞比例的差异减小(图5C)，证实SENP3介导的SUMO化修饰可以调节IRF4的活性。研究者使用CHX抑制IRF4翻译，在接触CHX 4-12小时后，IRF4-K349R更容易降解，其蛋白质水平远低于IRF4-WT组（图5D）。为了进一步解释这个问题，通过免疫沉淀纯化了IRF4蛋白，与野生型相比，Flag-IRF4-K349R显示出更高水平的IRF4多泛素结合形式（图5E）。在动物实验中，Senp3 cKO-小鼠巨噬细胞IRF4的水平显著升高（图5F）。综上，SENP3通过调节IRF4的SUMO化修饰，增强了在IL-4诱导下IRF4蛋白的稳定性，这可能是SENP3缺失促进巨噬细胞替代激活的机制之一。![]()
图5 SUMO化修饰增强IRF4的稳定性并促进巨噬细胞的替代激活
6. 巨噬细胞中SENP3低表达与ESCC患者预后不良有关
最后，研究者分析了ESCC患者巨噬细胞中的SENP3水平和临床病理数据。单变量回归分析显示，淋巴管浸润（p＜0.001）、SUVmax≥8（p=0.003）和CD206阳性细胞中SENP3的相对低表达（p=0.011）与ESCC患者的淋巴结转移显著相关（图6A）。CD206阳性细胞中SENP3强度相对较低的患者似乎具有较高的原发性肿瘤SUVmax（图6B和C）。此外，TCGA-ESCA数据库显示，SENP3表达低的患者M2巨噬细胞的比例较高（r=-0.22，p=0.0336）（图6D）。最后，对CD206阳性细胞中SENP3低表达和高表达两组患者进行了生存分析，结果表明无复发和总体生存率没有显著统计学差异（图6E）。综上所述，巨噬细胞中SENP3低表达与ESCC患者预后不良有关。![]()
图6 巨噬细胞中SENP3低表达与ESCC患者预后不良有关
结论：
这项研究表明巨噬细胞中SENP3通过结合IRF4并介导IRF4去SUMO化，SENP3的缺失导致IRF4的SUMO化增强，进而诱导ESCC相关巨噬细胞的替代激活，促进ESCC发展。参考文献
Zhang S, Gu J, Wang W, Sun L, Jiang T, Yang
X, Yin J, Lin M, Lin D, Wang H, Tan L. Suppression of SENP3 enhances macrophage
alternative activation by mediating IRF4 de-SUMOylation in ESCC progression.
Cell Commun Signal. 2024 Aug 9;22(1):395. doi: 10.1186/s12964-024-01770-z.
PMID: 39123188; PMCID: PMC11312810.![]()
常规分子实验：RT-qPCR、WB、IHC、Co-IP
细胞实验：流式细胞术、慢病毒构建、细胞外酸化率(ECAR)检测、细胞耗氧量(OCR)检测
动物模型及病理分析：构建基因敲除ESCC小鼠模型
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课题设计与申报|分子生物学实验|细胞功能|机制调控|多组学检测分析
