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原发性肝癌包括肝细胞癌（HCC，75%~85%）和肝内胆管细胞癌（ICC，10%~15%），以及其他罕见类型。据统计，2020年全球约有1930万癌症新发病例和1000万癌症相关死亡，其中肝癌的发病率和死亡率在肿瘤中分别排在第6位和第3位。阿替利珠单抗-贝伐珠单抗联合治疗方案成为肝癌治疗的标准，标志着肝癌治疗进入了一个新时代。然而，肝癌的治疗仍面临诸多挑战，研究主要集中在降低总体死亡率、延长总体生存时间和提高患者生活质量等方面。需要进一步的研究来确定与肝癌相关的遗传特征、生物学机制和其他方面，以实现这些目标。传统上认为RNA结合蛋白（RBPs）只与RNA相互作用。它们可以结合不同类型的RNA，如rRNA、lncRNA和mRNA，并在包括RNA加工、RNA合成、选择性剪接、RNA稳定和翻译等重要过程中发挥关键作用。大规模的RBP ChIP-seq研究已经揭示了RBP在活性基因组区域的广泛存在。与转录因子一样，RBPs通过与染色质相互作用积极参与基因组的转录控制。越来越多的证据表明，具有结合DNA和RNA双重能力的蛋白质调节许多细胞过程，包括转录、翻译、DNA修复和应激反应。阐明这些DNA/RNA结合蛋白（DRBPs）在调节细胞活动中的作用有助于解开与人类发育和疾病相关的长期问题。该研究发表在《Cancer Letters》，IF：9.1。技术路线：
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主要研究结果：
1、整合分析DRBP亚群发现肝癌的关键基因FBL
通过分析Gene Ontology数据库和之前的研究，作者定义了124个潜在的新DRBP子集。随后，作者进行了一项分析，以评估它们在多种癌症中的表达模式和预后意义。对肿瘤组织和邻近非肿瘤组织的DRBPs表达水平进行的比较显示，在10多种癌症中，有表达显著不同的基因（图1A）。对51个表现出差异表达的DRBPs的进一步分析揭示了它们与多种癌症类型患者的总生存率之间的相关性（图1B）。根据基因表达水平和患者预后之间的显著相关性对癌症类型的数量进行排序，三个DRBPs-FBL，HNRNPL，PA2G4出现在突出位置（图1C）。这些DRBPs的表达水平与11种不同癌症类型患者的预后显著相关。其中，FBL在所有肿瘤类型中的变化倍数最高。其表达水平升高，且预后较差，需要特别关注。对不同数据集肝癌组织中FBL表达的进一步分析一致表明，与癌旁非肿瘤组织相比，肝癌组织中FBL mRNA水平上调（图1D）。此外，肝癌中FBL表达升高的患者往往有较短的总生存期（图1E）。![]()
图1 FBL高表达与HCC患者的不良预后相关
2、FBL在体内外均可促进肝癌细胞增殖
为了研究FBL在肝癌细胞中的生物学功能，作者首先使用CRISPR/Cas9技术敲除Huh7、SK-Hep1和MHCC97L细胞中的内源性FBL表达。敲除FBL后，肝癌细胞的增殖和集落形成能力明显下降（图2A）。同样，siRNA转染显著抑制FBL的mRNA和蛋白表达。siRNA转染也抑制细胞增殖和集落形成(图为了进一步验证FBL对细胞增殖能力的影响，作者设计了针对FBL mRNA 3'UTR区域的短发卡RNA（shRNA）来下调内源性FBL mRNA的表达。应用不同的shRNA构建FBL敲低后，在肝癌细胞中观察到细胞增殖和集落形成显著降低。恢复这些细胞中的FBL表达成功地恢复了这些细胞的增殖和集落形成（图2B）。体内实验检测FBL对肝癌细胞增殖的影响。将Huh7-Cas9来源的FBL敲除细胞稳定移植到裸鼠皮下。与对照组相比，FBL敲除组的肿瘤体积、重量和Ki67表达均明显降低（图2C）。综上所述，这些发现表明FBL在肝癌细胞中是一种致癌因子。![]()
图2 FBL在体内外均可促进肝癌细胞增殖
3、FBL与转录因子KHSRP相互作用
多项证据表明，转录因子之间的协同作用可以在DNA结合水平上建立，它们也相互影响彼此对DNA的结合能力。在本研究中，作者使用内源性FBL抗体在Huh7细胞中进行了免疫共沉淀（co-IP），并结合了SDS-PAGE和LC-MS/MS分析。通过比较FBL下拉组与IgG对照组，在FBL下拉组中鉴定出符合富集比大于4且包含4个以上特异性肽段的蛋白67个。在这些蛋白中，DKC1和NOP58属于位于核仁致密纤维成分内的前rRNA加工因子，并且先前的研究报道了它们与FBL相互作用的能力。值得注意的是，在人类转录因子数据库中注释了CIZ1、PATZ1、PROX1、CEBPZ和KHSRP等蛋白。FBL可能与转录因子相互作用，参与转录调控过程。为了鉴定与FBL结合的转录因子，作者使用STRING数据库（https://cn.string-db.org/）预测FBL与5个转录因子的相互作用。结果表明，FBL与CEBPZ和KHSRP之间存在潜在的相互作用（图3A）。随后的co-IP结果表明，FBL对KHSRP的亲和力高于对CEBPZ的亲和力（图3B）。此外，flag标记的FBL和ha标记的KHSRP在HEK 293T细胞中表达，co-IP结果显示FBL和KHSRP之间存在外源相互作用（图3C）。KHSRP被选为进一步研究的相互作用蛋白。免疫荧光共定位实验显示，FBL和KHSRP明显共定位于三种不同细胞系核仁周围的核质内（图3D）。FBL蛋白由一个GAR结构域、一个RB结构域和一个α-螺旋结构域组成，由321个氨基酸组成。作者通过删除或融合氨基酸序列产生了FBL的截短突变体，并将这些突变体与全长KHSRP共转染到HEK 293T细胞中，然后进行co-IP和免疫印迹（图3E，F）。实验结果表明，全长FBL可以与KHSRP以及ab、bc和ac截短突变体相互作用，其中ac截短突变体表现出更强的结合亲和力。这表明FBL的三个结合域都与KHSRP相互作用，并且KHSRP主要与GAR结构域和α-螺旋结构域结合。KHSRP由711个氨基酸组成，主要由n端结构域、KH结构域和c端结构域组成。作者生成了单个KH域截断突变体和n端/ c端融合突变体（图3G）。作者评估了这些KHSRP截短突变体和全长FBL之间的相互作用（图3H）。结果表明，只有KHSRP全长和b截短突变体能与FBL结合，而c截短突变体不能与FBL结合。因此，这些结果表明，FBL主要与KHSRP的KH结构域相互作用，而不与n端或c端相互作用。![]()
图3 FBL与转录因子KHSRP相互作用
4、KHSRP在体内外均可促进肝癌细胞增殖
接下来，作者进一步研究了KHSRP在肝癌中的表达和功能。KHSRP的表达分析表明，与非肿瘤组织相比，KHSRP在肝癌组织中有一致的过表达。此外，KHSRP低表达的肝癌患者的总生存期显著优于KHSRP高表达的患者。在两个数据集中，KHSRP表达与MKI67基因表达显著相关。同时，KHSRP的表达与肝癌患者的AFP水平和TNM分期显著相关，提示高表达的KHSRP可能作为患者不良预后的指标。随后，sgRNA和siRNA分别通过CRISPR/Cas9技术和转染在三个肝癌细胞系中敲低KHSRP。在sgRNA介导的KHSRP敲低后，三种肝癌细胞株的增殖和集落形成能力均被显著抑制（图4A）。恢复KHSRP表达后，3种肝癌细胞株的细胞增殖和集落形成能力相应恢复（图4B）。为了进一步研究KHSRP在体内促进肝癌细胞增殖的作用，作者进行了裸鼠皮下成瘤实验。KHSRP-KO组的肿瘤体积明显小于对照组（图4C）。综上所述，KHSRP在体内外均具有促进肝癌细胞增殖的作用。![]()
图4 KHSRP在体内外均可促进肝癌细胞增殖
5、FBL和KHSRP影响糖代谢及相关基因的表达
为了研究FBL和KHSRP通过转录调控共同促进肝癌细胞增殖的分子机制，作者对KHSRP进行了CUT&Tag实验，并对siFBL和siKHSRP转染Huh7细胞进行了RNA-seq实验。结合之前获得的FBL的CUT&Tag结果，对CUT&Tag数据的组合分析表明，FBL和KHSRP可以共同占据下游基因的区域（图5A）。同样，在FBL敲低后显著上调的基因中，也有较高比例的基因在KHSRP敲低后显著上调，提示FBL和KHSRP对大部分基因具有相似的调控作用，可能存在协同作用。为了识别受FBL和KHSRP转录调控的基因，作者对4个数据集进行了整合分析（图5B）。结果表明，FBL和KHSRP共结合的基因子集在两个RNA-seq数据集中表现出很强的表达变化相关性。在siFBL和siKHSRP处理后显著下调的基因中，FBL和KHSRP可能通过与这些基因的启动子区结合来调节转录。对这些显著改变的基因进行GO和Reactome分析，发现与糖代谢相关的通路显著富集，包括糖酵解、果糖代谢和丙酮酸代谢等过程（图5C）。为了验证FBL和KHSRP是否影响肝癌细胞的葡萄糖代谢过程，作者对转染siNC、siFBL和siKHSRP的Huh7细胞样本进行了靶向代谢谱分析。结果显示，敲低FBL或KHSRP后，与葡萄糖代谢相关的细胞代谢物发生了显著变化（图5D）。大多数糖酵解中间体（葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、磷酸二羟丙酮等）和磷酸戊糖途径中间体（d-红糖-4-磷酸、d-核酮糖-5-磷酸、甘油醛-3-磷酸等）在敲低FBL或KHSRP后积累。作者分析了这5个受FBL和KHSRP调控的候选基因在Huh7和SK-Hep1细胞系中的表达变化，发现PFKFB4的变化最显著（图5E）。PFKFB4是一种参与糖酵解过程的多功能酶，在多种癌症中能够平衡糖酵解和磷酸戊糖途径，从而促进肿瘤的发生。为了验证FBL和KHSRP对PFKFB4的调控作用，作者检测了不同处理条件下两种不同细胞系中FBL、KHSRP和PFKFB4的mRNA和蛋白水平。实验结果表明，FBL或KHSRP的mRNA和蛋白水平的降低对应着PFKFB4的mRNA和蛋白水平的降低（图5F）。FBL或KHSRP在mRNA和蛋白水平的过表达也导致PFKFB4的mRNA和蛋白水平的增加（图5G）。这些发现为PFKFB4在肝癌细胞中的表达确实受到FBL和KHSRP的调控提供了有力的证据。![]()
图5 FBL和KHSRP影响糖代谢及相关基因的表达
6、肝癌细胞中PFKFB4的表达受FBL和KHSRP增强子驱动的方式调控
鉴于FBL和KHSRP结合到PFKFB4的启动子区域，并影响Pol II在PFKFB4启动子的富集，作者进一步研究了FBL和KHSRP调节PFKFB4的具体分子机制。首先，作者综合分析了FBL和KHSRP
CUT&Tag数据，Huh7细胞的组蛋白修饰ChIP-seq数据，以及HepG2细胞的Hi-C数据，发现了一个位于PFKFB4启动子上游约75 kb的假定DNA区域，该区域可能与PFKFB4启动子空间连接。FBL和KHSRP均在该区域内显示结合峰（图6A，B）。根据EnhancerDB数据库，注释的HepG2-enh20580增强子被确定为PFKFB4的潜在调节子，并且该增强子覆盖了观察到的DNA区域。根据启动子组蛋白修饰H3K27ac和H3K4me3以及增强子组蛋白修饰H3K27ac和H3K4me1的特征，结合Huh7细胞的ATAC-seq数据，作者确定了PFKFB4的启动子区域（chr3:48556579-48557571）和增强子区域（chr3:48617279-48620390）。ChIP-qPCR显示FBL和KHSRP在PFKFB4启动子和增强子区域显著富集（图6C，D）。为了证明增强子区域对PFKFB4转录水平的影响，作者进行了两个不同的实验。首先，作者设计了两对sgRNA，用于靶向PFKFB4增强子区域之前和之后的序列，并将这些组合用于CRISPR/Cas9敲除（图6B）。实时荧光定量PCR显示，四个增强子敲除细胞组的PFKFB4
mRNA水平显著低于对照组（图6E）。另一方面，enCRISPRi系统被用来评估增强子活性抑制后PFKFB4表达的变化。建立了稳定表达enCRISPRi-KL系统的Huh7细胞，并根据FBL和KHSRP的增强子结合位点设计了2条gRNA（图6B）。结果表明，这两个gRNA有效地引导enCRISPRi系统到适当的位点来调节PFKFB4 mRNA的表达水平，而在对照组中没有检测到变化（图6F），这表明这个增强子区域确实影响PFKFB4的表达，并且FBL和KHSRP通过结合其增强子和启动子区域共同激活PFKFB4的转录。![]()
图6 PFKFB4在肝癌细胞中受到FBL和KHSRP增强子驱动的调控
7、PFKFB4是FBL/KHSRP介导的促进细胞增殖所必需的
鉴于FBL可以与KHSRP协同激活PFKFB4转录，作者接下来基于TCGA和GEO数据库分析了FBL、KHSRP和PFKFB4在HCC中的表达水平。在肝癌患者中，PFKFB4的表达水平与肿瘤大小和TNM分期显著相关。值得注意的是，在HCC患者中PFKFB4的mRNA水平与FBL和KHSRP的mRNA水平显著相关，组织学分级高的HCC患者的Spearman相关系数高于组织学分级低的HCC患者（图7A）。这些相关性在来自GepLiver数据集的105个肝癌组织样本的独立队列中进一步得到证实（图7B）。为了研究FBL和KHSRP介导的PFKFB4的生物学功能，作者在三个肝癌细胞系中敲低PFKFB4的表达，然后在这些细胞中过表达FBL或KHSRP，然后评估对这些肝癌细胞体外增殖能力的影响。采用4组Huh7细胞进行体内实验。结果表明，敲低PFKFB4抑制了所有三个肝癌细胞系的增殖和克隆形成能力，而过表达FBL或KHSRP恢复了这些能力（图7C）。抑制PFKFB4表达还导致裸鼠皮下异种移植瘤的肿瘤体积和重量减少，而在PFKFB4敲低细胞中过表达FBL或KHSRP则恢复了肿瘤体积和重量（图7D）。作者进一步建立了两个敲除FBL或KHSRP的肝癌细胞株，然后恢复PFKFB4的表达，检测它们对肝癌细胞增殖和糖酵解相关代谢产物的影响。结果显示，在Huh7-Cas9细胞中敲低FBL或KHSRP导致葡萄糖摄取、乳酸生成和丙酮酸生成减少。在这两组中，PFKFB4表达的恢复分别导致葡萄糖摄取、乳酸生成和丙酮酸生成的恢复（图7E）。综上所述，这些结果表明FBL和KHSRP通过激活PFKFB4共同调控肝癌细胞的增殖。![]()
图7 PFKFB4是FBL/ KHSRP介导的细胞增殖促进所必需的
结论：
综上所述，该研究确定了FBL是肝癌的致癌DRBP。作者证明了FBL与另一个致癌DRBP KHSRP相互作用，在染色质上形成复合体。该复合物影响代谢基因的转录，导致肝癌细胞中葡萄糖代谢的重编程。具体来说，FBL和KHSRP通过增强子介导的机制调节糖酵解酶PFKFB4的转录，最终促进细胞增殖(图7F)。FBL/KHSRP-PFKFB4轴可能成为肝癌治疗的新靶点。参考文献：
Liu Y, Shi Q, Liu Y, Li X, Wang Z, Huang S,
Chen Z, He X. Fibrillarin Reprograms Glucose Metabolism by Driving the
Enhancer-Mediated Transcription of PFKFB4 in Liver Cancer. Cancer Lett. 2024
Aug 23:217190. doi: 10.1016/j.canlet.2024.217190.![]()
常规分子实验：Co-IP，ChIP-seq，CUT&Tag
细胞实验：细胞培养，构建细胞系
动物模型及病理分析：小鼠体内成瘤实验
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谢谢！
课题设计与申报|分子生物学实验|细胞功能|机制调控|多组学检测分析
