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乳腺癌脑转移是一个临床挑战，患病率上升。然而，潜在的机制，特别是癌细胞如何适应遥远的大脑生态位以促进定植，仍然知之甚少。大脑独特的代谢特征是神经元和星形胶质细胞之间通过谷氨酸、谷氨酰胺和乳酸盐的耦合。在这里，作者发现具有高脑转移潜力的乳腺癌细胞的细胞外囊泡携带高水平的miR-199b-5p，与其他器官转移的癌症相比，脑转移乳腺癌患者血液中的miR-199b-5p水平更高。miR-199b-5p靶向溶质载体转运体（星形胶质细胞中的SLC1A2/EAAT2和神经元中的SLC38A2/SNAT2和SLC16A7/MCT2）劫持神经元-星形胶质细胞代谢偶联，导致这些代谢物在细胞外保留，促进癌细胞生长。作者的发现揭示了一种机制，通过非脑来源的癌细胞重新编程神经代谢来促进脑转移。该论文于2024年5月发表在《Nature Communications》，IF：14.7。技术路线：
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主要研究结果：
1. miR-199b与BC脑转移的关系
作者首先通过小RNA测序分析了42例IV期BC患者的血清miRNA。这些患者包括21例脑转移（病例）和21例无脑转移（但转移到其他器官如骨）的对照组，这些患者被选择为年龄，诊断时间和乳腺肿瘤的HER2/ER/PR状态相匹配。通过比较两组之间的差异，作者发现四种循环miRNA（miR-199b、miR-31-5p、miR-1299和miR-206）在脑转移患者中相对丰富且显著升高（fold change≥2；P < 0.05），平均每百万计数（CPM）≥10（图1a）。![]()
图1 miR-199b与乳腺癌脑转移相关
接下来，作者比较了亲本MDA-MB-231 MBC细胞系和体内选择的嗜脑亚系（MDA-231-BR3）之间的EV和细胞miRNA谱。与亲本细胞相比，来自脑向亚系的EV含有较高水平的miR-199b和较低水平的miR-31-5p，而未检测到其他两种预先选择的循环miRNA（图1b）。从细胞RNA中检测到miR-199b， miR-31-5p和miR-1299。但亲本和亲脑型MDA-MB-231之间没有显著差异（图1b）。基于MBC患者循环miRNA分析和使用亲脑型MBC细胞的EV miRNA分析的综合结果，作者选择将miR-199b作为后续研究的重点。先前的一项研究报道，与原发性脑肿瘤相比，miR-199b在转移性脑肿瘤中表达上调，进一步支持了该miRNA在脑转移中的作用。在同一组MBC患者中，循环miR-199b水平仅与脑转移相关，而与骨转移无关（图1c）。与嗜脑型MDA-MB-231的高miR-199b分泌相反，与亲本MDA-MB-231细胞和MCF10A非癌细胞相比，MDA-MB-231的嗜骨亚系和嗜肺亚系并没有表现出更高的EV miR-199b水平（图1d）。此外，T47D BC细胞的嗜脑亚系以及来源于BC患者脑转移的两个独立的BBM系，在小鼠中形成嗜脑转移，一个HER2+和一个TN，都显示出非常高的miR-199b分泌水平（图1d）。嗜脑BC细胞中较高的miR-199b分泌水平并不总是伴随着较高的细胞内水平（图1d）。这些结果共同表明，BC细胞衍生的EV包封的miR-199b参与靶细胞的重编程以影响脑转移。 2. EV miR-199b对代谢物流入的影响
为了确定miR-199b的潜在功能，本研究根据microRNA.org和RNA算法，预测了人类和小鼠中溶质载体（SLC）家族中的几种质膜转运蛋白作为miR-199b的靶标。这些基因包括EAAT2 （SLC1A2/GLT-1）的编码基因，它控制>90%的谷氨酸流入星形胶质细胞，以及SNAT2 （SLC38A2/ATA2/SAT2）和MCT2（SLC16A7），它们分别是谷氨酰胺和乳酸流入神经元的主要转运蛋白。EAAT2、SNAT2和MCT2基因各在3'UTR中携带两个miR-199b结合位点。作者将每个3'UTR克隆到荧光素酶报告基因中，使用野生型3'UTR或一个或两个突变的miR-199b位点，以确定对miR-199b的响应性。对于这三个基因，3'UTR中的两个miR-199b位点都参与了miR-199b对靶基因表达的抑制作用（图2a）。最后，转染miR-199b模拟物，而不是对照模拟物，在RNA和蛋白质水平上显著抑制正常人类星形胶质细胞（NHA）中内源性EAAT2的表达，以及分化的SH-SY5Y神经元模型中SNAT2和MCT2的表达（图2b， c）。![]()
图2 miR-199b靶向SLC转运体EAAT2、SNAT2和MCT2
使用人NHA和分化的SH-SY5Y神经元模型，作者证实这些脑细胞在培养条件下具有荧光标记的EV（图3a）。与MCF10A EV或PBS对照处理相比，只有嗜脑性MDA-231或MDA-231的EV过表达和分泌miR-199b，而不分泌无关的miRNA miR-211（补充图2a，b）导致脑细胞中EAAT2，SNAT2和MCT2的显著下调（图3b，c）。相反，与来自对照MDA-231-BR3细胞的EV相比，来自表达抗miR-199b miRNA抑制剂的嗜脑性MDA-231细胞的EV提高了这些基因的表达（图3b，b，c）。与来自对照BBM细胞的EV相比，来自表达anti-miR-199b的BBM细胞的EV处理也导致脑细胞中EAAT2、SNAT2和MCT2的表达更高（图3c）。![]()
图3 EV miR-199b抑制星形胶质细胞和神经元中EAAT2、SNAT2和MCT2的表达
少突胶质细胞也有EAAT2和MCT2的表达；然而，在本研究中，作者主要关注星形胶质细胞和神经元的代谢偶联途径。接下来，作者测量了星形胶质细胞对培养基中谷氨酸的消耗以及SH-SY5Y神经元对谷氨酰胺和乳酸的消耗。当用高miR-199b EV预处理脑细胞时，所有三种代谢物的消耗都被抑制（图4a）。当用表达anti-miR-199b的MDA-231-BR3的EV预处理细胞时，这些影响被消除（图4a）。为了证实EV miR-199b介导的EAAT2、SNAT2和MCT2调控在这些效应中的作用，作者使用携带每个靶基因cDNA的质粒过表达EAAT2（在NHA中）、SNAT2（在SH-SY5Y中）和MCT2（在SH-SY5Y中），发现这些靶点的恢复阻断了miR-199b对代谢物流的影响（图4b-d）。![]()
图4 EV miR-199b抑制星形胶质细胞和神经元中代谢物的流入
接下来，作者采用离体器官型脑切片培养系统（图5a）来证实小鼠脑切片培养中的神经元和星形胶质细胞可以占用EV（图5b），并且高miR-199b水平的EV（来自miR-199b过表达和嗜脑性MDA-MB-231细胞）下调脑切片中EAAT2、SNAT2和MCT2的表达（图5c）。同时，在高miR-199b EV处理两天后，培养基中剩余的细胞外谷氨酰胺和乳酸水平显著升高（图5d），表明净流入脑细胞受到抑制，尽管在此时间点和培养条件下培养基中的谷氨酸水平低于检测阈值。为了进一步测试miR-199b诱导的细胞外谷氨酰胺和乳酸潴留是否影响癌细胞生长，作者将荧光标记的MDA-231或MDA-231-BR3细胞播种到EV处理的脑切片上，并在三天后测量荧光强度以评估癌细胞生长。具有不同水平miR-199b的EV在体外不直接影响这些癌细胞的生长。对于这两种癌细胞系，在高miR-199b EV处理的脑切片上可以看到癌细胞的生长增强（图5e）。当作者测试谷氨酰胺或乳酸代谢能力受损的癌细胞时，这种效应减弱了（通过siRNA对抗GLS或MCT1；图5f），表明谷氨酰胺和乳酸介导了促生长作用。此外，作者用从EV处理的脑切片中收集的条件培养基（CM）处理MDA-231癌细胞，添加或不添加谷氨酰胺或/和乳酸，并在体外评估CM中的癌细胞生长情况。与对照EV处理的脑切片相比，高miR-199b EV处理的脑切片的CM（含有更高水平的谷氨酰胺和乳酸）导致癌细胞生长增强。在对照EV处理的脑切片中添加谷氨酰胺或乳酸，以匹配高miR-199处理组的CM中检测到的水平，部分挽救癌细胞生长，而添加谷氨酰胺和乳酸完全再现了高miR-199b EV的作用（图5）。在脑切片研究中，EV处理在实验期间没有显著影响脑细胞活力。![]()
图5 EV miR-199b促进脑切片上BC细胞的生长
3. miR-199b在BC脑转移中的作用
为了评估脑内BC源性EV的体内功能，作者首先检测了脑细胞对静脉注射MDA-MB-231 EV的摄取情况。作者使用免疫荧光检测GFAP+星形胶质细胞和MAP2+神经元中人类特异性CD63，表明人类细胞来源的电动汽车（图6a），证实循环电动汽车能够穿过血脑屏障并影响脑细胞。携带不同水平miR-199b的EV在脑细胞摄取效率上没有表现出差异。由于EV转移的人CD63蛋白在小鼠脑细胞中预期会降解，因此预计EV在脑细胞中的实际摄取效率将高于本文所检测到的。在采集脑组织前，将表达miR-199b的MDA-MB-231或对照组的EV静脉注射至尾静脉，每周两次，持续5周。高miR-199b EV处理导致脑组织中miR-199b水平升高（图6b），EAAT2、SNAT2和MCT2表达水平降低（图6c、d）。作者进一步分离脑组织分离后的间质部分和含细胞部分，并测量无细胞间质部分中代谢物的水平。与接受生理盐水或低miR-199b EV的对照组相比，接受高miR-199b EV处理的小鼠大脑显示出更高水平的细胞外谷氨酰胺、谷氨酸和乳酸（图6e）。相比之下，这些小鼠的肺组织在细胞外谷氨酰胺和乳酸水平上没有显着差异（图6f），而肺间质中未检测到谷氨酸。接下来，在接受EV治疗的小鼠中，作者将荧光素酶标记的MBC细胞注射到乳腺脂肪垫中，以监测脑转移的发展。5周后，接受高miR-199b EV的小鼠显示出更高程度的脑转移（图6g）。相比之下，各组间原发乳腺肿瘤的生长没有明显差异（图6h），这表明高miR-199b EV处理组脑转移的增强与原发肿瘤负荷的不同无关。接下来，作者评估了miR-199b对脑BC肿瘤生长的影响。将稳定过表达miR-199b的荧光素酶标记的MDA-MB-231细胞或对照注入雌性小鼠脑内，建立脑内肿瘤。通过生物发光成像检测，miR-199b过表达肿瘤组与对照组相比，脑部肿瘤生长增强（图7a，b）。这与miR-199b对癌细胞增殖的直接影响不太可能相关，因为在体外培养时，过表达miR-199b的细胞的增殖率低于对照细胞（图7c）。为了描述谷氨酰胺在脑代谢中的潜在变化，作者给患有脑内BC肿瘤的小鼠注射了13c标记的谷氨酰胺。在全脑解离后，通过二维核磁共振分析无细胞间质部分，以量化13c标记的代谢物。在携带高miR-199b肿瘤的大脑中检测到较高的13c标记的谷氨酸、醋酸盐和缬氨酸的细胞外水平和较低的GABA水平（图7d）。这一结果与miR-199b诱导谷氨酸细胞外保留的假设功能一致，并表明谷氨酰胺合成GABA减少，可能是由于谷氨酰胺摄取减少到神经元。将mcherry标记的表达anti-miR-199b或对照的嗜脑性MDA-MB-231细胞注入脑内后，表达anti-miR-199b的肿瘤在脑内的生长受到显著抑制（图7e）。对注入13c标记的谷氨酰胺进行追踪显示，在携带抗miR-199b肿瘤的大脑中，13c标记的谷氨酰胺、谷氨酸和琥珀酸的细胞外水平较低，而GABA和苏氨酸的水平较高（图7f）。在另一项实验中，作者在心脏内注射T47D- br2细胞之前，通过静脉注射miR-199b过表达和分泌或不含miR-199b的T47D BC细胞的EV来治疗小鼠。在该模型中，高miR-199b EV治疗增强了脑转移的发展（图7g-i），但对肺和肝脏转移没有显著影响。作者还观察到卵巢转移，这可能与ER+肿瘤模型中需要雌激素的ER信号传导有关。因此，脑内肿瘤生长模型、胸脑转移模型和血行转移模型的结果共同支持BC细胞源性EV miR-199b促进脑转移的作用。![]()
图6 EV miR-199b调节脑内代谢物转运蛋白，促进胸脑转移![]()
图7 miR-199b促进脑内BC肿瘤的生长并改变谷氨酰胺代谢结论：
本文章目前的机制研究表明，治疗中有机会阻断癌症EV诱导的脑细胞代谢重编程，可保护正常的脑功能，同时抑制脑转移。参考文献：
Ruan X, Yan W,
Cao M, et al. Breast cancer cell-secreted miR-199b-5p hijacks neurometabolic
coupling to promote brain metastasis. Nat Commun. 2024;15(1):4549. Published
2024 May 29. doi:10.1038/s41467-024-48740-0.![]()
生信分析：Small RNA-seq数据分析、单细胞RNA-seq分析
常规分子实验：培养基代谢物分析、代谢物谱分析（NMR）、RNA提取、逆转录和定量PCR、Small RNA-seq、Western blot、免疫荧光
细胞实验：细胞和构建、脑切片培养
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课题设计与申报|分子生物学实验|细胞功能|机制调控|多组学检测分析
