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尽管高尿酸血症（HUA）与肾脏疾病的关联日益受到关注，但目前对其病理机制的理解尚不完全，而调节肠道微生物群可能为治疗相关肾脏疾病提供新的视角。该文章研究了HUA如何通过影响肠道菌群和激活NLRP3炎症小体来促进肾脏损伤。通过建立UOX基因敲除的大鼠模型，研究者发现HUA导致肠道菌群失调和肾脏功能障碍。16S rRNA测序和代谢组学分析揭示了与HUA相关的肠道菌群变化和肾脏中尿毒症毒素的积累。粪便微生物移植实验验证了HUA菌群对肾脏损伤的影响，且NLRP3炎症小体的激活在其中扮演了关键角色。研究结果表明，调节肠道菌群或抑制NLRP3炎症小体可能是治疗HUA相关肾脏疾病的有效策略。该研究于2024年7月21日发表在《Microbiome》上，IF：13.8。
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技术路线：
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主要研究结果：
1. UOX−/−大鼠出现明显的HUA和肾功能障碍在不同时间点从大鼠模型中收集血液、尿液、粪便和肾脏（图1A）。如图1B所示，WT和UOX−/−大鼠的体重没有显著差异。经Westernblot测定，UOX−/−大鼠肝脏中的UOX蛋白与WT大鼠相比显著减少（图1C）。与WT大鼠相比，UOX−/−大鼠的血清UA水平始终显著升高（图1D）。4至24周龄的UOX−/−大鼠血清UA水平稳定在约400μmol/L。两组之间的食物摄入量没有差异，但与WT对照组相比，UOX−/−大鼠的水摄入量显著增加。对24周观察期内的存活率进行Kaplan-Meier分析，结果显示两组之间没有显著差异。为了研究HUA对肾脏的影响，对4至12周龄的WT和UOX−/−大鼠进行了肾功能测定。与WT对照组相比，UOX−/−大鼠的血清肌酐(SCR)和血尿素氮(BUN)在8周时显著升高，24小时尿蛋白在12周时增加（图1E-H）。总之，这些发现表明UOX−/−大鼠被有效地确立为持续性和自发性HUA的模型，并且这种情况会导致严重的肾功能障碍。![]()
图1 UOX–/–大鼠出现明显的HUA和肾功能障碍。
检查4至24周龄大鼠的肾脏大体形态。与WT对照组相比，UOX−/−大鼠的肾脏形态明显受损，表现为表面不太光滑且存在结构损伤（图2A）。在12周龄时检查肾脏组织病理学。在偏振光下，在UOX−/−大鼠的肾间隙中观察到针状UA晶体（图2B）。苏木精和伊红(H&E)染色显示UOX−/−大鼠肾脏肾小管扩张，上皮细胞排列紊乱，炎症细胞浸润（图2C）。然后通过过碘酸-希夫(PAS)染色检测病理形态，该方法通过检测糖原含量来识别受损的小管。PAS染色显示UOX−/−大鼠肾脏存在明显肾小管损伤，表现为肾小管扩张、刷状缘膜损伤，管腔内上皮细胞脱落（图2D、F）。末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（Tunel）染色显示HUA促进UOX−/−大鼠肾脏细胞凋亡（图2E、L）。ELISA试剂盒检测尿液中N-乙酰-b-D-葡萄糖胺酶（NAGL）、肾损伤分子1（KIM-1）、视黄醇结合蛋白（RBP）、β2-微球蛋白（β2-MG）、胱抑素C（CysC）及肾小管损伤生物标志物。与PAS染色结果一致，UOX−/−大鼠尿液NAGL、KIM-1、RBP、β2-MG、CysC水平显著升高（图2G-K）。此外，透射电子显微镜（TEM）显示肾脏标本中肾小球基底膜增厚、系膜细胞增生、肾小管结构破坏（图2M）。这些结果表明HUA对UOX−/−大鼠肾脏造成严重损伤，尤其是肾小管损伤。![]()
图2 HUA导致严重的肾脏组织病理学损伤
3. HUA促进肾脏纤维化和肾脏NLRP3炎症小体的激活纤维化是多种肾脏疾病的共同病理特征，慢性炎症被认为是HUA的典型病理特征。Masson三色染色及Ⅲ型胶原染色显示UOX−/−大鼠肾脏间质纤维化明显（图3A、B、D、E）；CD68免疫荧光染色显示HUA大鼠肾脏巨噬细胞数量增多（图3C）；UOX−/−大鼠血清中MCP-1、IL-1β、IL-6等炎症因子表达持续上调（图3F~H）。Westernblot结果显示，NLRP3、cleavedcaspase1p20、IL-1β蛋白表达上调（图3I、J），提示与WT大鼠相比，UOX−/−大鼠肾脏中NLRP3炎症小体被激活。这些结果提示HUA激活了UOX−/−大鼠NLRP3炎症小体，促进了肾脏纤维化。![]()
图3 HUA促进肾脏纤维化和肾脏NLRP3炎症小体的激活。
为了研究HUA对肠道菌群的影响，研究者进行了16SrRNA测序，以揭示各组之间肠道微生物群落特征的差异。从UOX−/−同窝大鼠和WT同窝对照大鼠中采集了粪便样本，以减少基于遗传背景的偏差。根据α多样性指数（包括ACE、Shannon和Chao1指数），WT和UOX−/−大鼠之间的微生物丰富度和均匀度相似。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA)显示各组之间的微生物群落相对分离（图4A）。在门水平上，WT和UOX−/−大鼠的肠道微生物群主要由厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形菌门组成（图4B）。与野生大鼠相比，UOX−/−大鼠的变形菌门显著增加，而厚壁菌门减少（图4C和D）。使用线性判别分析效应大小（LEfSe）分析对组间粪便细菌属水平上差异丰度的分类群进行鉴定，如图4E所示。LEfSe分析结果显示，包括大肠杆菌志贺氏菌在内的六个细菌属在UOX−/−大鼠中富集，而其他两个分类群在WT大鼠中富集（图4G-N）。此外，使用KEGG注释和功能富集，鉴定出25个在UOX−/−和WT大鼠之间表现出不同富集水平的功能类别（图4O）。值得注意的是，UOX−/−大鼠中与肠道来源的尿毒症毒素相关的功能，包括色氨酸和苯丙氨酸代谢，有所增加。此外，KEGG通路分析还显示，HUA扰乱的微生物群与细菌入侵上皮细胞增加和丁酸代谢降低有关。为了评估HUA导致的肠道微生物群紊乱是否对肠道屏障功能产生影响，使用FITC-葡聚糖评估了肠道通透性。与WT大鼠相比，UOX−/−大鼠的肠道通透性显著增加（图4P）。在患有HUA的大鼠中，使用HE和阿尔新蓝(AB)染色对结肠组织进行组织学检查发现了几个值得注意的发现。这些包括粘液层变薄、杯状细胞丢失以及炎症细胞浸润增加（图4Q和R）。此外，与野生大鼠相比，UOX−/−大鼠结肠中紧密连接蛋白（如ZO-1、occludin和claudin-1）的表达水平较低。综上所述，这些结果表明UOX−/−大鼠的HUA导致肠道菌群失调和肠道屏障功能受损。![]()
图4 HUA导致UOX−/−大鼠肠道菌群失调、肠道屏障功能受损。
5. 患有HUA的大鼠肾脏中肠道来源的尿毒症毒素显著增加肠道代谢物是肠肾轴的关键介质，因此在肾脏健康中发挥重要作用。肠道微生物组的KEGG功能预测分析结果表明，HUA引起的肠道菌群失调会增加肠道尿毒症毒素的产生。因此，采用靶向代谢组学分析比较UOX−/−和WT大鼠的肾脏代谢组学特征。OPLS-DA模型的结果显示WT和UOX−/−大鼠之间存在明显的分离（图5A）。进一步进行了200次置换的随机置换检验以评估OPLS-DA模型的稳健性。结果表明OPLS-DA模型没有过拟合，可以进一步处理。以VIP>1阈值和p<0.05为标准，在WT组和UOX−/−组之间共鉴定出266种代谢物。其中，与WT组相比，UOX−/−大鼠中有180种代谢物上调，86种代谢物下调。分类结果显示，这些代谢物主要属于氨基酸、肽及其类似物、核苷、核苷酸及其类似物、有机酸及其衍生物、鞘脂、糖及其衍生物、吲哚和杂环化合物等（图5B）。在改变的代谢物中，几种尿毒症毒素，包括IS、对甲酚(PC)、马尿酸(HA)、苯乙酰谷氨酰胺(PAGln)、苯乙酰甘氨酸(PAGly)、犬尿氨酸(KA)、L-犬尿氨酸(KYN)、喹啉酸(QA)和甲基胍(MG)，在UOX−/−大鼠中上调(图5D)。已知这些毒素中的大多数来自肠道微生物群对饮食中的芳香化合物（包括色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸）的代谢。使用KEGG通路进一步分析改变的代谢物（图5C）。与肠道微生物组一致，代谢物富集的KEGG通路分析表明，UOX−/−大鼠的色氨酸代谢上调。此外，氨基酸的生物合成、嘌呤代谢、丙酮酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、TCA循环和cAMP信号传导也上调，而维生素的消化和吸收、硫胺素代谢和嘧啶代谢在UOX−/−大鼠中下调。进一步进行Pearson相关性分析，以了解差异富集微生物与代谢物之间的关联（图5E）。相关性分析表明，UOX−/−组中富集的大肠杆菌-志贺氏菌、伯克霍尔德菌、Caballeronia、Paraburkholderia和肠球菌与肠源性尿毒症毒素呈强正相关性，而WT组中富集的ButyricicoccaceaeUCG-009与这些改变的代谢物呈负相关性。此外，代谢物与肾功能参数之间的相关性分析显示，这些肠源性尿毒症毒素与UA水平和肾功能参数呈强正相关性。网络中还显示了鉴别性微生物、鉴别性代谢物和肾功能参数之间的相关性。这些结果表明，UOX−/−大鼠中上调的肠源性尿毒症毒素可能参与HUA诱导的肾损伤。![]()
图5 肠道来源的尿毒症毒素在 HUA 大鼠的肾脏中显著增多。
6. 移植“HUA菌群”促进缺血/再灌注(I/R)小鼠的肾脏损伤和NLRP3的激活为了进一步证实肠道菌群对HUA诱导性肾损伤的作用，将WT同窝仔鼠和UOX−/−同窝仔鼠的粪便菌群移植到肠道菌群耗尽的小鼠体内，该小鼠先前已接受5天的氨苄西林、新霉素、万古霉素和甲硝唑抗生素(ABX)联合治疗。ABX治疗小鼠的菌群耗尽表现为细菌DNA载量显著下降，血琼脂平板上无可培养细菌。在2周的FMT后进行I/R损伤以诱发急性肾损伤(图6A)。收集受体小鼠的盲肠内容物进行16SrRNA基因测序，以研究FMT对假手术或I/R小鼠肠道菌群的影响。基于属相对丰度的PCoA分析显示，重新定植HUA菌群的小鼠与对照菌群的微生物群落相对分离。与上述大鼠的发现一致，预测的KEGG功能通路分析显示，在重新定植HUA菌群的Sham和I/R小鼠中，色氨酸代谢均显著增加。HUA菌群受体小鼠在I/R损伤后血清IS水平升高，进一步证明了色氨酸代谢增加。此外，HUA菌群受体小鼠在I/R损伤后NOD样受体信号通路相关功能增强。这些结果表明，通过FMT在受体小鼠中成功重建了UOX−/−和WT大鼠的肠道菌群。随后研究了HUA菌群对FMT后小鼠肾脏损伤的影响。如图6B-C和E-G所示，HUA菌群并不直接诱导肾脏损伤。相比之下，接受HUA菌群的小鼠在I/R手术后与对照组相比表现出更严重的肾脏损伤。这表现为SCR和BUN水平升高，以及肾小管损伤加剧。在I/R损伤后，HUA菌群受体小鼠的UA水平始终高于对照组，而假手术小鼠没有差异（图6D）。随后，在HUA菌群受体小鼠的肾脏I/R手术后评估了NOD样受体之一NLRP3炎症小体的活性。正如预期的那样，在重新植入HUA微生物群的I/R小鼠中，NLRP3、cleavedcaspase-1p20和IL-1β的表达显著上调（图6H和I）。进一步研究了HUA菌群对受体小鼠肠道屏障的影响。结肠切片H&E和AB染色显示，与对照组相比，HUA菌群受体小鼠的黏液层变薄，炎症细胞浸润增加（图6J和K）。HUA菌群受体小鼠的肠道屏障受损还表现为血清LPS水平升高（图6N）和紧密连接蛋白（包括ZO-1、occludin和claudin-1）表达降低（图6L和M）。总之，这些发现揭示了HUA菌群在促进肾脏损伤、触发肾脏NLRP3炎症小体激活和损害肠道屏障完整性方面的作用。![]()
图6 “HUA菌群”移植促进I/R小鼠肾脏损伤及NLRP3的激活。
7. NLRP3的激活是“HUA菌群”对肾脏损伤产生有害影响的原因预测的KEGG功能通路分析表明NOD样受体信号通路可能参与HUA菌群相关的肾损伤。为了探讨NLRP3炎症小体在介导HUA菌群促进肾损伤中的潜在作用，在NLRP3−/−小鼠中进行了菌群移植后I/R手术实验（图7A）。与WT小鼠相比，移植不同菌群的NLRP3−/−小鼠肾脏在I/R手术后SCR、BUN、UA水平和组织学变化无明显差异，但在HUA菌群受体小鼠中仍检测到更高水平的肠源性尿毒症毒素IS（图7BH）。正如预期，NLRP3−/−小鼠肾脏中NLRP3、cleavedcaspase-1p20和IL-1β的表达在I/R手术后保持不变（图7I和J）。此外，通过H&E和AB染色、紧密连接蛋白表达和血清LPS水平可证实，在NLRP3−/−小鼠中未观察到由WT小鼠引起的肠道屏障损伤（图7K-O）。这些发现表明，HUA菌群激活NLRP3炎症小体是I/R小鼠肾脏损伤和肠道屏障损伤加剧的原因。![]()
图7 NLRP3的激活是“HUA 菌群”对肾脏损伤产生有害影响的原因
结论
研究结果提供了证据表明，HUA诱导的肠道菌群失调在肾损伤的发展中起着重要作用。此外，确定了NLRP3激活是该过程的潜在介质。这些结果表明，靶向微生物群和NLRP3炎症小体可能是治疗肾脏疾病的一种有前途的策略。参考文献
Zhou X, Ji S, Chen L, Liu X,
Deng Y, You Y, Wang M, He Q, Peng B, Yang Y, Chen X, Kwan HY, Zhou L, Chen J,
Zhao X. Gut microbiota dysbiosis in hyperuricaemia promotes renal injury
through the activation of NLRP3 inflammasome. Microbiome. 2024 Jun
21;12(1):109. doi: 10.1186/s40168-024-01826-9. PMID: 38907332; PMCID:
PMC11191305.![]()
生信分析：肠道微生物组成分析、代谢组学分析、KEGG功能分析、Spearman相关性分析
常规分子实验：16S测序、qPCR、免疫组化染色、WB、肠道通透性测定、粪便菌群移植实验（FMT）、酶联免疫吸附测定（ELISA）
动物模型及病理分析：基因敲除模型、I/R 损伤的小鼠模型
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课题设计与申报|分子生物学实验|细胞功能|机制调控|多组学检测分析
