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转移是结直肠癌(CRC)患者死亡的主要原因，血管生成是肿瘤侵袭和转移的关键因素。lncRNAs在肿瘤细胞的各种生物学过程中发挥调控作用，然而，lncRNAs在CRC相关血管生成中的作用及其潜在机制仍有待阐明。LOC101928222在结直肠癌中表达上调，与较差的预后相关。此外，LOC101928222促进CRC的迁移、侵袭和血管生成。机制上，LOC101928222与IGF2BP1通过m6A依赖性途径协同稳定HMGCS2 mRNA，导致胆固醇合成增加，最终促进结直肠癌的发展。总之，这些发现证明了一种新的、基于LOC101928222的机制参与了胆固醇合成的调节和CRC的转移潜力。LOC101928222-HMGCS2-胆固醇合成途径可能是诊断和治疗结直肠癌转移的有效靶点。本文于2024年7月发表于“Journal of Experimental & Clinical Cancer
Research”（IF=11.4）上。技术路线：
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结果：
1）LOC101928222在结直肠癌中表达上调，与预后不良相关
为了探索可能影响CRC进展的lncRNAs，我们通过下载GEO数据库中的“CRC组织/相应正常组织”（GSE126092）、“CRC患者血液样本/健康捐献者血液样本”（GSE4988）以及“CRC原发组织/肝转移组织”（GSE92914）的微阵列数据进行了差异表达分析（图1A）。我们鉴定出了一些差异表达的lncRNAs，其中PVT1和LOC101928222在所有三个数据集中均显著上调（图1B）。由于PVT1在CRC中报道较多，我们选择了LOC101928222作为研究对象。随后，UCSC数据库显示LOC101928222缺乏蛋白质编码能力（图1C）。分析TCGA公共数据集发现，LOC101928222在CRC中上调（图1D，E）。接着，我们在51对来自CRC患者的样本中进一步分析了LOC101928222的表达，发现其中37对样本中，CRC组织的LOC101928222表达高于正常周围组织（图1F）。原位杂交（ISH）的CRC组织微阵列进一步验证了CRC样本中LOC101928222的表达升高（图1G）。同样，与FHC细胞相比，SW480、SW620和LOVO细胞中的LOC101928222表达也增加（图1H）。我们的分析进一步表明，LOC101928222的表达升高与CRC病理阶段（III/IV）以及较差的生存率显著相关（图1I，J）。总之，这些结果表明LOC101928222在CRC中上调，并与较差的临床结果相关。![]()
2）LOC101928222在体外和体内促进结直肠癌的进展
为了进一步研究LOC101928222在CRC中的生物学功能，我们设计了LOC101928222过表达载体和短发夹RNA（shRNAs）。接下来，shRNA1和shRNA2显示出优越的敲减效率，因此被选中进行后续的实验研究（图2A）。通过管形成实验检测了LOC101928222对血管生成的影响，结果显示LOC101928222的敲减抑制了HUVECs的管形成能力（图2B）。Transwell实验结果表明，LOC101928222的敲减减少了CRC细胞的迁移和侵袭能力（图2C）。接下来，为了探索LOC101928222在体内的作用，建立了异种移植肿瘤模型和转移模型。我们发现LOC101928222的敲减在体内抑制了肿瘤生长和迁移（图2D）。进一步地，将稳定转染的CRC细胞通过裸鼠的脾脏远端和尾静脉分别注射到转移模型的肝脏和肺中。肝脏和肺中更高的荧光强度和更多的转移结节表明LOC101928222促进了转移。免疫组化（IHC）显示，与对照组相比，shLOC101928222组中CD31和CD34的表达下调（图2E, F）。因此，这些结果表明，CRC细胞的肿瘤发生和转移可能通过上调LOC101928222的表达而得到促进。![]()
3）LOC101928222通过调节HMGCS2促进CRC进展
由于lncRNAs的定位与其功能机制密切相关，我们首先进行了核和细胞质分离及FISH实验，发现LOC101928222在SW480和LOVO细胞中同时定位于细胞核和细胞质中（图3A, B）。为了寻找潜在的LOC101928222靶基因，我们进行了RNA高通量测序，发现与shLOC101928222组相比，shNC组中有458个基因上调，236个基因下调（图3C）。基因富集分析显示，LOC101928222与管形成和细胞迁移显著相关（图3D）。然后，我们选择了RNA测序结果中差异表达最显著的基因进行qRT-PCR验证，并与测序结果高度一致（图3E）。分析发现HMGCS2存在于管形成和细胞迁移途径中，进一步的实验发现LOC101928222敲减后HMGCS2表达下调，而LOC101928222过表达后HMGCS2表达上调（图3F）。我们随后进行了拯救实验，发现HMGCS2的过表达逆转了LOC101928222敲减介导的血管生成、细胞迁移和细胞侵袭的减少（图3G, H）。这些发现表明，LOC101928222可以通过其对HMGCS2表达的调节作用，促进CRC中的血管生成和转移。![]()
4）LOC101928222通过与IGF2BP1相互作用调控HMGCS2的表达
我们接下来探讨了LOC101928222是如何影响HMGCS2表达的。研究表明，lncRNAs通过与RNA结合蛋白（RBPs）相互作用，对下游基因进行调节控制。因此，我们使用LOVO细胞进行了RNA下拉实验，以识别与LOC101928222相互作用的RBPs。根据银染结果，sense-LOC101928222和antisense-LOC101928222下拉了显著不同的55–70 kDa的蛋白质（图4A）。通过质谱分析，该蛋白质被鉴定为IGF2BP1（64 kDa）。通过RNA下拉和western blot实验，确认了LOC101928222与IGF2BP1在SW480和LOVO细胞中的相互作用（图4B）。随后的RIP实验也证明了LOC101928222与IGF2BP1的直接相互作用（图4C）。为了进一步确定LOC101928222的哪个片段与IGF2BP1结合，我们进行了删除图谱分析和RNA下拉实验。我们发现LOC101928222的Del5片段（864–1150 bp）可以与IGF2BP1结合（图4D）。有趣的是，我们进一步观察到LOC101928222的敲减或过表达并不影响IGF2BP1的表达（图4E），同样，IGF2BP1也不影响LOC101928222的表达（图4F）。这表明LOC101928222可能与IGF2BP1形成复合物，从而影响下游靶基因的表达。随后的分析揭示了IGF2BP1与HMGCS2之间的正相关关系（图4G）。我们然后确认了IGF2BP1的敲减会影响HMGCS2的表达（图4H），并且HMGCS2 mRNA可以与IGF2BP1相互作用，如RIP实验所检测到的（图4I）。当LOC101928222被敲减时，HMGCS2的富集减少了（图4I），这表明LOC101928222通过结合IGF2BP1来调节HMGCS2的表达。![]()
5）LOC101928222/IGF2BP1复合物通过稳定HMGCS2 mRNA促进CRC进展
IGF2BP1作为一种m6A“阅读器”，并且作为RBP稳定目标mRNAs。因此，我们假设LOC101928222可能通过与IGF2BP1相互作用来稳定HMGCS2 mRNA。随后，我们敲减了LOC101928222或IGF2BP1，发现HMGCS2 mRNA的稳定性降低了。当同时敲减LOC101928222和IGF2BP1时，HMGCS2 mRNA的稳定性比单独敲减LOC101928222或IGF2BP1时降低得更多（图5A）。敲减IGF2BP1减弱了LOC101928222过表达介导的HMGCS2 mRNA稳定性增加（图5B）。根据人类蛋白质图谱和免疫荧光（IF）分析，我们发现HMGCS2和IGF2BP1在CRC细胞中主要定位于细胞质（图5C）。我们然后进行了拯救实验，结果显示敲减IGF2BP1减少了LOC101928222过表达引起的血管生成、迁移和侵袭的增加（图5D, E）。总之，我们证明了LOC101928222通过与IGF2BP1协作增强HMGCS2 mRNA的稳定性，最终促进CRC的进展。![]()
6）LOC101928222通过METTL16介导的m6A依赖途径与IGF2BP1协同稳定HMGCS2 mRNA
为了进一步探讨HMGCS2中是否存在m6A修饰，我们使用了SRAMP网站评估来确定HMGCS2中五个潜在的m6A修饰位点（图6A）。然后我们分析了CRC中METTL3、METTL14和METTL16的表达，发现METTL14和METTL16在CRC中高表达（图6B）。我们接着检查了CRC细胞系中METTL3、METTL14和METTL16的表达，发现METTL16的表达高于METTL3和METTL14（图6C）。有趣的是，我们在LOVO细胞中敲减了METTL16进行高通量测序，发现HMGCS2是METTL16的潜在靶基因（图6D）。进一步的验证显示，敲减METTL16降低了HMGCS2的表达（图6E）。我们然后进行了删除图谱分析和RNA下拉实验，发现LOC101928222的Del1片段（864–1150 bp）与METTL16结合（图6F）。MeRIP研究的结果表明，METTL16的耗竭减少了HMGCS2上m6A甲基化的富集（图6G）。随后进行的MeRIP-qPCR实验确认了m6A修饰主要存在于HMGCS2 mRNA的3′-UTR（图6H）。最后，我们的实验揭示了敲减METTL16后HMGCS2 mRNA稳定性显著降低（图6I）。综上所述，这些数据表明LOC101928222通过与IGF2BP1协同作用，通过METTL16介导的HMGCS2 mRNA的3′-UTR上的m6A甲基化来稳定HMGCS2 mRNA。![]()
7）LOC101928222介导CRC中胆固醇水平升高，导致其进展及相关分子的临床关系
研究表明，HMGCS2与肿瘤中的胆固醇代谢密切相关。因此，我们对CRC中的HMGCS2进行了通路相关性分析，发现HMGCS2与脂质和胆固醇代谢途径紧密相关（图7A）。此外，HMGCS2是胆固醇生物合成途径的一部分（图7B）。我们随后发现，LOC101928222或HMGCS2或IGF2BP1的敲减降低了CRC细胞中的胆固醇合成，而过表达HMGCS2或IGF2BP1可以挽救LOC101928222或HMGCS2敲减导致的胆固醇合成减少（图7C）。为了证明胆固醇对CRC血管生成的影响，我们用不同剂量的胆固醇处理CRC细胞，结果显示胆固醇处理以剂量依赖性方式逆转了LOC101928222敲减诱导的血管生成减少，其中10 μM胆固醇的效果最为显著（图7D）。我们然后进行了Transwell挽救实验，发现10 μM胆固醇也逆转了LOC101928222敲减诱导的迁移和侵袭减少（图7E）。最后，我们在体内测试了相关基因的促肿瘤生成功能。如图7F，G所示，LOC101928222或HMGCS2敲减降低了CRC细胞在裸鼠中的肿瘤起始能力，而过表达HMGCS2或IGF2BP1可以挽救LOC101928222或HMGCS2敲减的CRC细胞的肿瘤起始能力。并且各组异种移植中的胆固醇浓度与肿瘤生长的变化一致（图7H）。以上结果提示，LOC101928222通过HMGCS2诱导CRC中胆固醇含量增加，从而导致CRC进展。HMGCS2、IGF2BP1和METTL16在CRC组织中的整体表达水平较高（图8A，B）。随后的分析表明，HMGCS2和IGF2BP1在CRC中上调（图8C）。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，HMGCS2、IGF2BP1和METTL16的高表达与CRC患者的预后不良显著相关（图8D）。总的来说，这些结果证明了LOC101928222通过与IGF2BP1协同作用，通过m6A依赖性途径稳定HMGCS2 mRNA，导致胆固醇合成增加，最终促进CRC的发展（图8E）。![]()
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结论：
我们发现LOC101928222与IGF2BP1协同作用，通过METTL16介导的m6A依赖途径稳定HMGCS2 mRNA，导致胆固醇合成增加，从而促进CRC的发展。我们的发现有助于更深入地了解结直肠癌转移的分子机制，并可能促进结直肠癌更有效和个性化治疗策略的发展。参考文献：
Chang L, Ding J, Pu J, Zhu J, Zhou X, Luo Q, Li J, Qian M, Lin S, Li J,
Wang K. A novel lncRNA LOC101928222 promotes colorectal cancer angiogenesis by
stabilizing HMGCS2 mRNA and increasing cholesterol synthesis. J Exp Clin Cancer
Res. 2024 Jul 4;43(1):185. doi: 10.1186/s13046-024-03095-8.![]()
常规分子实验：qRT‑PCR，FISH，WB，pull down，RIP，免疫荧光，MeRIP qRT‑PCR，IHC
细胞实验：Transwell，管形成实验
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谢谢！
课题设计与申报|分子生物学实验|细胞功能|机制调控|多组学检测分析
