![]()
骨髓间充质干细胞（BMSC）随着骨骼微环境的变化而老化，可能会发生成骨不足或脂肪生成过多，最终导致骨密度降低和老年性骨质疏松症骨折风险增加。本研究旨在探讨骨细胞衰老对骨微环境的影响及其对衰老过程中骨骼微环境的影响。从2月龄和16月龄小鼠中分离出原代骨细胞，分别获得年轻的骨细胞衍生细胞外囊泡（YO-EVs）和衰老骨细胞衍生的EVs（SO-EVs）。研究发现，YO-EVs可显著提高BMSCs的碱性磷酸酶活性、矿化沉积和成骨相关基因的表达，而SO-EVs则促进BMSCs的脂肪生成。YO-EVs和SO-EVs均未对原代巨噬细胞/单核细胞的破骨细胞生成产生产生影响。作者构建的转基因小鼠旨在追踪骨细胞来源的 EV 分布，揭示了嵌入骨基质中的大量骨细胞来源的 EV。此外，发现成熟的破骨细胞从骨切片中释放出骨细胞衍生的 EV，在调节周围培养基的功能方面起着关键作用。在静脉注射到年轻和老年小鼠模型中后，与SO-EVs相比，YO-EVs显示出骨量和生物力学强度的显着增强。骨切片免疫染色结果显示，YO-EV治疗增加了骨表面成骨细胞的数量，而SO-EV治疗促进了骨髓中脂肪细胞的形成。YO-EVs和SO-EVs的蛋白质组学分析表明，原肌球蛋白-1（TPM1）在YO-EVs中富集，增加了BMSCs的基质刚度，从而促进了成骨。具体来说，siRNA 介导的 Tpm1 耗竭在体外和体内都消除了 YO-EVs 的促成骨活性。作者的研究结果表明，YO-EVs在维持骨吸收和形成之间的平衡方面发挥了至关重要的作用，并且其促成骨活性随着年龄的增长而下降。因此，YO-EVs和递送的TPM1具有作为老年性骨质疏松症治疗靶点的潜力。该研究于2024年4月发表于《J
Nanobiotechnology.》，影响因子10.1。
技术路线
![]()
研究思路
1、YO-EVs促进BMSC成骨分化和SO-EVs促进BMSC成脂分化
在这项研究中，作者从2个月大和16个月大的C57BL/6小鼠中分离出了原代年轻成骨细胞（YO）和衰老成骨细胞（SO）。通过基因表达分析，作者检测了与成骨细胞和衰老相关的标记基因。成骨细胞特异性标记基因牙本质基质酸性磷酸蛋白1（Dmp1）和成骨细胞特异性标记基因Ⅰ型胶原蛋白α1链（Col1a1）被分析，以确认YO和SO的成骨细胞特性（补充图S1A）。此外，为了确定细胞的衰老状态，作者评估了衰老标记物P16和P21的表达水平。作者的结果显示，SO的P16和P21表达水平明显高于YO，证实了它们的衰老状态（补充图S1B）。随后，作者通过超速离心法多次收集细胞培养液，以获得YO衍生的细胞外囊泡（YO-EVs）和SO衍生的细胞外囊泡（SO-EVs）。与先前报告[27]一致，通过透射电子显微镜（TEM；图1A）和纳米粒子追踪分析（NTA；图1B）显示，分离出的EVs呈现出杯状形态，直径分别为117.5±32.5纳米（YO-EVs）或107.5±40.5纳米（SO-EVs）。流式细胞仪分析（图1C）显示，分离出的EVs表现出典型的EV标记，如CD63（YO-EVs和SO-EVs均为100%阳性）、CD81（YO-EVs和SO-EVs分别为100%和99.1%阳性）以及TSG101（YO-EVs和SO-EVs分别为98.2%和98.6%阳性）。这些结果证实了从成骨细胞中获得的囊泡是EVs。![]()
图1 YO-EVs促进BMSC成骨分化和SO-EVs促进BMSC成脂分化
为了评估YO-EVs和SO-EVs对骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化成成骨和成脂系谱的影响，作者首先进行了初步研究，以确定这些外泌体被小鼠原代BMSCs的内化潜力。为了便于评估，作者使用了DiI（一种红色的亲脂性染料）来标记YO-EVs和SO-EVs，然后通过超滤去除任何多余的染料。接下来，BMSCs暴露于DiI标记的YO-EVs或SO-EVs中3小时，随后未结合的外泌体被洗去。共聚焦显微镜成像显示BMSCs的核周区域有大量红色荧光信号，表明这些外泌体已成功被BMSCs内化。然后，作者探索了YO-EVs和SO-EVs调节BMSCs分化命运的潜力。在成骨诱导下，YO-EVs（而非SO-EVs）显著增加了碱性磷酸酶（ALP）染色的强度（图1D，E）和培养基中ALP活性（图1F），表明增强了BMSCs的成骨活性。一致地，Alizarin Red S（ARS）染色强度（图1G，H）和定量实时PCR（qRT-PCR）分析（图1I）显示，YO-EVs（而非SO-EVs）强烈促进了BMSCs的钙结节形成，并在成骨诱导期间上调了与成骨相关的基因——跑马相关转录因子2（Runx2）的表达。相比之下，SO-EVs（而非YO-EVs）在BMSCs成脂分化过程中显著增加了脂滴形成，并上调了与成脂相关的基因——过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Pparg）的表达，这一点通过Oil Red O（ORO）染色（图1J，K）和qRT-PCR分析（图1L）得到了证实。此外，通过RANKL诱导的原代骨髓巨噬细胞/单核细胞（BMMs）也评估了YO-EVs和SO-EVs对成骨细胞分化的影响。抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色强度和qRT-PCR分析显示，YO-EVs和SO-EVs在成骨细胞诱导期间对成骨细胞融合（图1M，N）或与成骨细胞生成相关的基因——组织蛋白酶K（Ctsk；图1O）的表达都没有明显影响。综上所述，这些结果表明，尽管YO-EVs促进了BMSCs的成骨作用，但它们随着年龄的增长失去了这种能力，反而在BMSCs上表现出了促进成脂的效果。2、骨基质释放的年龄相关性EVs对BMSC分化的影响
为了研究成骨细胞衍生的外泌体在皮质骨中的存在，作者构建了外泌体示踪转基因小鼠模型以可视化外泌体的分布。CD63蛋白是一种广泛存在于外泌体中的膜蛋白，作为几乎所有外泌体的通用标记物。作者通过基因改造构建了转基因小鼠。具体来说，作者利用同源重组CRISPR/Cas9技术将“loxp-mCherry-loxp-eGFP”表达框架敲入Cd63基因的终止密码子，从而创建了Cd63loxp-mCherry-loxp-eGFP外泌体示踪小鼠。这些小鼠在所有细胞中表现出mCherry融合蛋白的组成性表达。与Cre重组酶工具小鼠交配后，loxp-mCherry-loxp序列被切除，导致eGFP融合蛋白在特定细胞中的条件性表达，使作者能够追踪某些细胞释放的外泌体定位。小鼠牙本质基质酸性磷酸蛋白1（Dmp1）启动子已被广泛认可为识别成骨细胞的最常用标记物。为了实现成骨细胞的靶向突变，作者使用了Dmp1Cre小鼠，这些小鼠在小鼠Dmp1启动子的控制下表达Cre重组酶。为了产生CD63条件性突变体，Dmp1Cre小鼠与Cd63loxp-mCherry-loxp-eGFP小鼠进行了杂交。对得到的Dmp1Cre;Cd63loxp-mCherry-loxp-eGFP小鼠进行了基因分型，并在补充图S3中进行了描述。从Dmp1Cre;Cd63loxp-mCherry-loxp-eGFP小鼠制备的皮质骨切片用于观察mCherry和eGFP的荧光信号。如图2A所示，在骨表面发现了显著的mCherry红色荧光表达，主要来自成骨细胞和破骨细胞，而在皮质骨基质内的成骨细胞的核周区域检测到相对较少的mCherry信号。有趣的是，在骨基质内检测到大量点状eGFP绿色信号，表明这些信号绝大多数来自成骨细胞衍生的外泌体，这些外泌体在生理条件下自然渗透骨基质。骨基质中的内容物主要是通过破骨细胞吸收释放的，通过骨基质微管系统的次要贡献。主要的破骨细胞前体，骨髓巨噬细胞/单核细胞，通过核因子κB配体的受体活化剂（RANKL）激活，并与来自年轻或衰老小鼠的骨片一起培养或不一起培养，以获得相应的条件培养基（YB-OC-CM或SB-OC-CM）。为了证明破骨细胞对骨片的吸收活性，作者在14天培养期后进行了扫描电子显微镜（SEM）分析。SEM图像清晰地显示了暴露于破骨细胞培养的骨片上的吸收陷窝；相比之下，没有经过破骨细胞诱导的对照骨片没有显示出这样的陷窝（补充图S4）。为了模拟从骨基质中释放的成骨细胞衍生的外泌体，然后提取了不同条件下破骨细胞的培养基（CM），分析外泌体数量的变化及其对BMSC成骨和成脂分化的影响。由于外泌体蛋白浓度通常被视为外泌体丰度的衡量标准，比较了各种CM中外泌体蛋白水平。如图2B所示，与单独的破骨细胞相比，破骨细胞与骨片共培养大大增强了CM中外泌体的生成。然而，年轻和衰老骨片中外泌体蛋白水平没有显著差异，YB-OC-CM和SB-OC-CM组中外泌体蛋白量相当。与分离的YO-EVs和SO-EVs对BMSC分化的影响一致，YB-OC-CM的应用被发现显著增强了BMSC在成骨诱导期间的ALP活性（图2C-D）、钙结节形成（图2E-F）和Runx2的表达（图2G）。而SB-OC-CM对这些参数没有表现出任何明显的影响（图2C-G）。相反，ORO染色（图2H-I）和Pparg表达分析（图2J）表明，与OC-CM和YB-OC-CM相比，SB-OC-CM对BMSC成脂有显著影响。此外，还研究了从YB-OC-CM（YB-OC-CM中的EVs）和SB-OC-CM（SB-OC-CM中的EVs）提取的外泌体对BMSC分化的影响。与相应的CM类似，YB-OC-CM和SB-OC-CM中的EVs分别增强了BMSC的成骨或成脂分化（图2C-J），强调了来自骨片的OC-CM中外泌体的不可或缺作用。这些发现暗示，在骨吸收过程中，成骨细胞衍生的外泌体可能从骨基质中释放出来，并影响BMSC分化命运。![]()
图2 骨基质释放的年龄相关性EVs对BMSC分化的影响。
3、YO-EVs和SO-EVs对年轻和老年小鼠骨量的影响
YB-OC-CM中外泌体的强大合成代谢效应对BMSC成骨作用，以及从原代年轻成骨细胞分离出的YO-EVs的相似活性，促使作者探究它们在体内刺激骨形成中的潜在作用。为了确定成骨细胞衍生的外泌体在生理条件下能否到达骨组织，作者将YO-EVs和SO-EVs用1,1'-二辛基-3,3,3',3'-四甲基吲哚三碳菁碘化物（DiR）近红外荧光染料标记，并通过静脉注射到3个月大的野生型（WT）小鼠体内，随后使用光谱体内成像系统监测外泌体在骨组织中的分布。体外荧光成像显示，在注射后24小时，骨组织中出现了强烈的荧光信号，这表明YO-EVs和SO-EVs都能有效地渗透到WT小鼠的骨组织中（补充图S5）。接下来，作者旨在研究通过每周两次静脉注射YO-EVs一个月是否能够加速3个月大年轻小鼠的成骨作用，并减轻15个月大老年小鼠的年龄相关性骨质流失（图3A）。同时，也评估了SO-EVs对骨的影响。通过微计算机断层扫描（µCT）重建的年轻和老年小鼠的股骨图像显示，接受YO-EV治疗的小鼠骨量增加，而接受SO-EV治疗的小鼠骨量减少，与给予溶剂的对照组相比，如图3B和F所示。值得注意的是，接受YO-EV治疗的年轻和老年小鼠显示出显著更高的松质骨量特征，这由显著提高的松质骨体积分数（Tb. BV/TV）、松质骨数量（Tb. N）和/或松质骨厚度（Tb. Th），以及减少的松质骨间距（Tb. Sp）来表示，与相应的对照组相比。相比之下，SO-EVs的给药导致年轻小鼠的Tb. BV/TV和Tb. N显著减少，并伴随着Tb. Sp的增加（图3C）；在老年小鼠中也观察到了相同的趋势，SO-EVs导致Tb. BV/TV和Tb.
N的减少（图3G）。然而，无论是YO-EVs还是SO-EVs在年轻和老年组中都没有显示出皮质厚度（Ct. Th）的显著变化（图3D和H）。此外，三点弯曲测试表明，YO-EVs对年轻和老年小鼠股骨的极限载荷值有积极影响，而AB-EVs则导致这两个组的这一参数减少（图3E和I）。这些结果表明，YO-EVs可能对骨骼强度有有益的影响，而SO-EVs可能具有有害的影响。![]()
图3 YO-EVs和SO-EVs对年轻和老年小鼠骨量的影响
4、YO-EVs增强骨形成和SO-EVs促进骨髓中脂肪积累
此外，收集了用溶剂、YO-EVs或SO-EVs处理的小鼠的股骨组织和血液样本，以评估成骨细胞、成脂细胞和破骨细胞的活性。为了评估成骨细胞活性，进行了骨钙素（OCN）的免疫组织化学染色。结果显示，在年轻的（图4A-B）和老年小鼠（图4I-J）的松质骨骨表面上，接受YO-EVs处理的小鼠成骨细胞数量显著增加。相反，与接受溶剂处理的组相比，SO-EVs导致成骨细胞数量显著减少（图4A-B和I-J）。此外，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）评估了血清OCN水平，结果证实了YO-EVs对年轻小鼠成骨活性的有益影响。然而，无论是年轻还是老年小鼠接受SO-EVs处理，与接受溶剂处理的对照小鼠相比，血清OCN水平都呈现出下降趋势（图4C）。这些发现表明，YO-EVs参与了青春期的骨形成，但在骨骼老化期间失去了这些能力。随着年龄的增长，骨髓间充质干细胞（BMSCs）在分化命运上发生了向成脂而非成骨的转变。这种现象导致骨组织中脂肪细胞的积累，通常观察到的是“黄色骨髓”，而不是年轻小鼠中发现的“红色骨髓”。为了评估成脂活性，进行了脂肪细胞中发现的蛋白Perilipin（PLIN）的免疫荧光染色。溶剂处理组在年轻小鼠的骨髓中显示出适度数量的脂肪细胞（图4D-E），而在老年小鼠中观察到脂肪细胞数量的增加（图4L-M）。值得注意的是，SO-EVs的应用显著增加了年轻和老年组脂肪细胞的数量，与溶剂处理组相比（图4D-E和L-M）。相反，YO-EVs的给药倾向于减少年轻和老年组骨髓脂肪细胞的数量（图4D-E和L-M），这可能是由于YO-EVs更倾向于BMSCs的成骨分化而非成脂分化。鉴于骨形成和吸收的持续过程，作者还研究了成骨细胞衍生的外泌体对外破骨细胞活性的影响。具体来说，作者检查了YO-EVs和SO-EVs对年轻和老年小鼠破骨细胞形成和活性的影响。抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色（图4F-G和N-O）以及血清中I型胶原蛋白C末端肽（CTX-I）的ELISA分析（图4H和P）显示，YO-EVs和SO-EVs对任一年龄组的破骨细胞形成和活性都没有显著影响。这些发现表明，YO-EVs的干预可能改善骨形成，但这种有益的效应随着年龄的增长而丧失。此外，作者的结果还揭示了成骨细胞衍生的外泌体不影响成骨细胞生成。需要进一步阐明这些复杂过程的潜在机制，以更好地理解骨代谢。![]()
图4 YO-EVs增强骨形成和SO-EVs促进骨髓中脂肪积累
5、YO-EVs和SO-EVs的蛋白质组学分析比较
男性骨质疏松症主要归因于骨组织微环境的改变，其中外泌体作为细胞间通讯的调节因子发挥着重要作用。值得注意的是，YO-EVs被发现比SO-EVs更能促进BMSCs的成骨分化。为了阐明YO-EVs促成骨效应的潜在机制，作者采用了结合TMT标记和LC−MS/MS的策略，对YO-EVs和SO-EVs中加载的蛋白质含量进行了全面分析。作者的分析揭示了在YO-EVs和SO-EVs之间表达增强的436种不同蛋白质（超过1.5倍，P < 0.05）（图5A），其中335种和101种蛋白质分别在YO-EVs和SO-EVs中显著表达（图5A）。此外，为了深入了解生物学背景和相关生物过程，进行了基因本体（GO）分析。在YO-EVs中差异富集的蛋白质中，发现83个分子功能（MF）项、135个生物过程（BP）项和104个细胞组分（CC）项显示出相当的富集，差异超过1.5倍（补充图S6-8）。根据补充图S6所示的结果，观察到YO-EVs含有较高比例的与细胞骨架调控相关的蛋白质，分子功能中最丰富的关键词是“肌动蛋白丝结合”、“马达活性”、“微丝马达活性”和“肌动蛋白依赖性ATP酶活性”。此外， tropomyosin 1（TPM1）被鉴定为YO-EVs中最丰富的细胞骨架调控相关蛋白质，但其在SO-EVs中的表达下降了约8.24倍（图5B）。定量实时PCR（qRT-PCR）分析被用来测量从3个月大的年轻小鼠和15个月大的老年小鼠获得的骨基质和骨髓样本中Tpm1基因表达的变化。图5C描述了随着年龄的增长，骨基质中Tpm1表达的显著下降，而在骨髓样本中没有观察到显著变化。通过构建表达TPM1的慢病毒载体来评估TPM1过表达对成骨和成脂分化的直接影响（图S9A）。感染后，这些BMSCs经历了成骨或成脂分化协议。作者的结果表明，BMSCs中TPM1的过表达导致成骨分化显著增加，这一点通过增强的ARS染色得到证实（图S9B-C）。相反，过表达TPM1的BMSCs中，成脂分化（由ORO染色指示）减少（图S9D-E）。为了验证TPM1在YO-EVs中的基本作用，成骨细胞经历了TPM1的耗竭，通过进行qRT-PCR分析来验证产生的沉默效果。在针对Tpm1的三种合成候选特异性小干扰RNA（siRNA）分子中，si-Tpm1-1显示出最有效的抑制作用，因此被选为进一步研究（图5D）。以前的研究表明，TPM1通过增强肌动蛋白应激纤维的稳定性，促进BMSCs的成骨分化。在这项研究中，作者研究了YO-EVs和SO-EVs对成骨诱导期间BMSCs的聚合纤维肌动蛋白（F-actin）聚合的影响。F-actin染色表明，富含TPM1的YO-EVs加强了F-actin聚合，而TPM1含量低的SO-EVs导致F-actin聚合较少（图5E-F）。为了验证TPM1在调节BMSC分化命运中的关键作用，作者对比了来自si-Control处理的年轻成骨细胞（YOsi−Control-EVs）或si-Tpm1处理的年轻成骨细胞（YOsi−Tpm1-EVs）的EVs的效果。ARS染色（图5G-H）和Runx2表达分析（图5I）揭示了用YOsi−Tpm1-EVs处理的BMSCs产生的矿化结节形成显著减少，与用YOsi−Control-EVs处理的相比。此外，ORO染色（图5J-K）和Pparg表达分析（图5L）表明YOsi−Tpm1-EVs并没有显著提高YO-EVs在成脂期间影响小鼠BMSCs中脂滴产生能力。这些发现表明，TPM1作为YO-EV诱导的BMSCs成骨分化的关键介质，最有可能通过调节F-actin聚合来发挥作用。![]()
图5
YO-EVs和SO-EVs的蛋白质组学分析比较
6、TPM1对YO-EV促进的骨形成的贡献
为了进一步研究TPM1是否涉及体内YO-EV诱导的骨形成过程，作者进行了一项研究，其中3个月大的小鼠每周一次通过静脉注射接受YOsi−Control-EVs、YOsi−Tpm1-EVs或等量的溶剂，为期一个月，框架与图3A中的类似。与作者的预期一致，CT分析显示TPM1的抑制显著阻碍了YO-EVs促进松质骨形成的能力，其特征是与YOsi−Control-EVs组相比，YOsi−Tpm1-EVs组的Tb. BV/TV、Tb. N和Tb.
Th水平显著降低，以及Tb. Sp水平显著升高（图6A-B）。然而，在用YOsi−Control-EVs、YOsi−Tpm1-EVs或溶剂处理的小鼠中，Ct. Th没有统计学上的显著变化（图6C）。此外，三点弯曲测试表明，YOsi−Tpm1-EV组的股骨极限载荷值倾向于低于YOsi−Control-EVs组（图6D）。![]()
图6 TPM1对YO-EV促进的骨形成的贡献
参考文献
Wang ZX, Lin X, Cao J, Liu YW, Luo ZW,
Rao SS, Wang Q, Wang YY, Chen CY, Zhu GQ, Li FX, Tan YJ, Hu Y, Yin H, Li YY, He
ZH, Liu ZZ, Yuan LQ, Zhou Y, Wang ZG, Xie H. Young osteocyte-derived
extracellular vesicles facilitate osteogenesis by transferring tropomyosin-1. J
Nanobiotechnology. 2024 Apr 25;22(1):208. doi: 10.1186/s12951-024-02367-x.
PMID: 38664789; PMCID: PMC11046877.![]()
组学实验：蛋白质组学分析
常规分子实验：qRT−PCR；酶联免疫吸附试验；免疫染色
细胞实验：原代细胞的提取和培养；骨细胞来源的 EV 的分离；破骨细胞生成分化试验；EV的细胞内化
动物模型及病理分析：动物模型构建；EV示踪剂转基因小鼠
![]()
谢谢！
课题设计与申报|分子生物学实验|细胞功能|机制调控|多组学检测分析
