外泌体是存在于所有生物体液中的纳米囊泡，这使得它们作为癌症等疾病的非侵入性生物标志物具有吸引力。然而，外泌体的分离和检测非常复杂，需要全面的分子表征才能用于常规诊断。本研究探索利用多肽作为成本效益高且稳定的外泌体结合抗体的替代品。为了实现这一目标，本研究利用噬菌体技术在外泌体中选择对目标分子具有高特异性的肽段。蛋白质组学分析确定了38个该肽在外泌体膜上靶向候选蛋白。通过流式细胞术和磁驱动免疫分析成功地证实了肽段与乳腺癌源性外泌体的结合。此外，还测试了电化学生物传感器用于乳腺癌源性外泌体的检测和定量。该肽段显示出与侵袭性癌细胞系外泌体的有效结合，在特异性和恢复方面提供了有希望的结果。这项研究显示了开发快速、可获得的乳腺癌诊断工具的潜力，特别是在资源匮乏的医疗保健环境中。该论文于2024年7月发表在《Biosensors & bioelectronics》，IF：10.7。
据报道，在癌症中细胞外囊泡(EV)生物发生失调，导致血液和血清中外泌体成分的释放增加和改变。在之前的研究中，生物素-C3肽被成功地用于乳腺癌患者血清与乳腺良性疾病的区分。进行蛋白质组学研究，发现365个与生物素-C3肽具有一定亲和力的蛋白组，不包括与对照组共有的蛋白组，结果总结于图S3.1(补充数据)。选择38个仅位于血浆和细胞器膜上的蛋白进行进一步分析，因为它们可能是乳腺癌外泌体膜上生物素-C3肽的潜在靶点。38个蛋白质组中有27个通过STRING分析显示出一些相互作用，蛋白质家族的分类分析显示它们都参与与癌症相关的途径。在鉴定的38种蛋白中，发现了16种与乳腺癌相关的的蛋白，有11种来自线粒体。
有丝分裂囊泡是一种运输线粒体成分的细胞外小囊泡，目前正在研究其在癌症进展、转移和耐药中的潜在作用，将其定位为肿瘤学研究的焦点。例如，来自乳腺癌细胞的外泌体促进侵袭，诱导骨髓分化，抑制免疫反应，并通过线粒体递送赋予耐药性。线粒体蛋白可占外泌体总蛋白含量的10%。肿瘤细胞代谢的改变，特别是在侵袭性癌症如三阴性乳腺癌中，导致线粒体蛋白的积累。此外，健康对照样本中不存在线粒体蛋白，但来自癌症肿瘤的样本中存在线粒体蛋白。考虑线粒体在细胞代谢调节中的作用，结果表明生物素-C3肽是肿瘤形成、进展、治疗反应和/或转移的潜在标志物。总之，生物素-C3肽通过靶向这些不同的囊泡亚群表现出特异性。在囊泡中存在肿瘤特异性线粒体蛋白，而在健康对照组中不存在，这进一步强调了生物素-C3肽作为生物标志物在癌症相关研究中的重要性。
为了研究测序蛋白与生物素-C3肽之间的相互作用，使用在线服务器HDOCK进行了分子对接模拟。该分析加强了蛋白质组学分析的数据，表明生物素-C3肽与38个鉴定的蛋白质之间可能存在相互作用。值得注意的是，细胞色素氧化酶的c亚基(O00483)和线粒体细胞色素b-c1 Rieske复合体的c亚基(P47985)，以及内质网膜上的延伸synaptotagin -1 (Q9BSJ8)得分更高。
来自乳腺癌细胞系的外泌体的NTA分析显示，MCF-7、MDA-MB231、SKBr3和MRC-5(作为非致瘤性阴性对照)的大小分布相似，如图1 A-D所示。MCF-7外泌体的大小分布直方图在145 nm处有一个明显的峰，在215 nm处有一个较弱的峰。对于MDA-MB231外泌体，在130和185 nm处分别观察到两个峰，在295 nm处有一个较小的峰，对应于小聚集体。对于SKBr3外泌体，NTA分析显示在145 nm处有一个清晰的峰，在255 nm处有一个较小的峰，而MRC-5外泌体在125 nm处有一个峰，在285 nm处有一个较小的峰。
MCF-7、MDA-MB231、SKBr3和MRC-5细胞系的大小分布直方图的变化突出了每个细胞系释放的外泌体群体的差异，可能受到细胞起源或生理状态等因素的影响。然而，尽管存在这些差异，在100和200 nm之间的一致峰证实了纳米尺寸的细胞外囊泡的存在，通常被称为外泌体。这证实了细胞外囊泡分离方法的稳健性。除粒径分布外，还利用NTA估计了MCF-7的颗粒浓度，MCF-7对应的浓度为8.09 × 1010粒·mL−1 (SD为1.93 × 1010);1.14 × 1011粒·mL - 1 (SD 3.00 × 109);SKBr3为1.88 × 1011粒·mL−1(SD 1.40 × 1010)，MRC-5为2.28 × 1011粒·mL−1 (SD 8.00 ×109)。外泌体样品也用低温透射电镜成像，以评估囊泡的粒径和完整性，如图1所示，为每个细胞系样品的插图。
为了评估生物素-C3肽的识别能力以及来自不同细胞系(包括MCF-7、MDA-MB231、SKBr3和MRC-5)的外泌体中配体靶点的存在，我们进行了基于流式细胞术的检测。生物素-C3肽识别的靶点存在于外泌体中，并且在细胞系之间存在差异，MFC-7衍生的外泌体阳性标记率为99.0%，MDA-MB231衍生的外泌体阳性标记率为96.5%，SKBr3衍生的外泌体阳性标记率为51.4%，MRC-5衍生的外泌体阳性标记率仅为1.9%。结果也在图2中总结为热图。因此，生物素-C3肽识别存在于乳腺癌细胞外泌体中的靶标，更相关的是，在MCF7和MDA-MB231细胞系中具有更大的强度。尽管在分子上不同，MCF7是腔内的，ER阳性，MDA-MB231是三阴性，但与SKBr-3相比，两者都被认为更具侵袭性，具有更大的转移潜力。关于外泌体的产生，我们知道，转移潜能高的肿瘤细胞倾向于产生更多的外泌体，这可能与肿瘤向其他器官的播散有关。因此，结果表明，有机制参与转移过程的分子不同亚型乳腺癌细胞。此外，由于成纤维细胞是肿瘤微环境中存在的一种细胞，因此该肽仅标记来自最具侵袭性细胞的外泌体而不标记成纤维细胞的特异性。
四联蛋白是一种完整的膜蛋白，在支持蛋白质结构和锚定细胞膜上起着至关重要的作用。外泌体显著表达四跨蛋白CD9、CD63和CD81，它们通常被用作外泌体通用生物标志物，并能影响它们的形成和组成。anti-CD63、anti-CD9和anti-CD81的结果以热图形式汇总在图2中。生物素-C3肽根据捕获和细胞系中使用的抗体不同，存在于外泌体中的差异识别靶标。对于用抗cd63捕获的外泌体，来自MFC-7的外泌体阳性标记率为92.4%，来自MDA-MB231的外泌体阳性标记率为95.0%，来自SKBr3的外泌体阳性标记率为0.4%，来自MRC-5的外泌体阳性标记率为0.03%(图S4.2)。对于用抗cd9捕获的外泌体，MFC-7衍生的外泌体阳性标记率为75.5%，MDA-MB231衍生的外泌体阳性标记率为46.9%，SKBr3衍生的外泌体阳性标记率为10.2%，MRC-5衍生的外泌体阳性标记率为3.5%。最后，对于用抗cd81捕获的外泌体，来自MFC-7的外泌体阳性标记率为74.1%，来自MDA-MB231的外泌体阳性标记率为11.4%，来自SKBr3的外泌体阳性标记率为41.5%，来自MRC-5的外泌体阳性标记率为30.4%。两种成功的免疫磁分离方法:直接分离和夹心分离。在直接方法中，外泌体直接固定在磁性颗粒上，并用生物素-C3肽标记。在三明治方法中，外泌体先前被抗体修饰的磁性颗粒捕获，并用生物素-C3肽标记(图2)。重要的是要强调，直接方法仅适用于使用纯化外泌体进行表达谱分析。在真实的基质中，固定与这些囊泡结合的抗体，如CD9、CD63和CD81四跨蛋白，已被证明适用于生物液体。因为外泌体必须事先分离以便进一步标记。在这种情况下，直接固定化纯化的外泌体呈现出与抗cd63捕获的外泌体相似的特征，因此这种四蛋白与肽结合是一种极好的候选者。因此，在进一步的实验中，anti-CD63被用于定量方法，包括磁免疫测定和电化学生物传感。
生物素-C3肽标记来自SKBr3谱系的较差外泌体，表明该肽能够识别EV的特定亚群。这些发现为选择最佳磁免疫分离方法分析不同细胞系外泌体提供了指导。生物素-C3肽的特异性标记可能有助于识别来自不同细胞亚型的外泌体，这可能对使用这些囊泡作为癌症诊断和治疗的生物标志物具有重要意义。事实上，低表达CD63的含tetraspanin的EV，尤其是CD9和CD81，主要来源于质膜，而低表达CD9的表达CD63的EV则形成于内部隔室，被称为外泌体。该研究评估了生物素-C3肽在使用带有抗CD9、抗CD63和抗CD81抗体的抗体修饰磁颗粒标记外泌体中的功效，结果表明，使用抗CD63抗体的方法与直接捕获来自MCF-7和MDA-MB231细胞系的外泌体获得的标记谱更相似。这些结果直接证实了蛋白质测序分析的发现，其中许多与生物素-C3肽结合的候选靶点是来自细胞器(如线粒体和内质网)的膜蛋白。此外，实验证实了使用抗CD63抗体进行外泌体免疫磁分离的有效性，使其成为进一步研究中生物分析方法发展的合适选择。
本文首次研究了一种磁驱动的光学重排ELISA，利用生物素-C3肽检测乳腺癌细胞系的外泌体。图3 A图显示了磁捕获和比色反应过程的方案，图3 B图显示了来自MCF-7、MDA-MB231、SKBr3乳腺癌细胞系和MRC-5成纤维细胞系的外泌体作为非致瘤性阴性对照的校准图。构建不同外泌体浓度(150 ~ 4.8 × 106 μL−1)的校准图。吸光度值采用非线性回归(四参数logistic方程)拟合。MCF-7、MDA-MB231和SKBr3细胞系外泌体的检出限分别为330 μL−1 (r2 = 0.9928)、388 μL−1 (r2 = 0.9904)和473 μL−1 (r2 = 0.9708)。与先前的研究(从105到102外泌体μL−1)相比，这些值代表了3个数量级的改进，与基于类似免疫磁分离(IMS)原理的其他磁驱动免疫分析相比，这些研究采用了不同的原理来实现光学读出，包括在三明治免疫分析格式中的第二种标记抗体。
来自不同癌细胞系(MCF-7、MDA-MB231、SKBr3和成纤维细胞MRC-5作为阴性对照)的外泌体检测的校准图如图4所示，浓度范围为150 ~ 4.8 × 106 μL−1。
基于抗CD63的外泌体磁分离，然后使用生物素-C3肽和链亲和素-多hrp进行电化学检测，如图4 b所示。调整后的信号分别获得了175 μL−1 (r2= 0.9907)、189 μL−1 (r2 = 0.9914)和262 μL−1 (r2 = 0.9809)的外泌体，来自MCF-7、MDA-MB231和SKBr3细胞系的外泌体LOD, MCF-7细胞系的LOD最低，正如预期的那样。与先前的研究(从105到102外泌体μL−1)相比，这些值代表了3个数量级的改进，与其他基于类似原理的外泌体免疫磁分离(IMS)的免疫传感器相比，但依靠不同的原理来实现电化学读出，包括在三明治免疫传感格式中的第二标记抗体。值得注意的是，在简化的分析程序中，根据外泌体中固有的碱性磷酸酶活性，发现的LOD与生物传感器具有相同的顺序。此外，在电化学基因传感中，基于IMS的外泌体分离和预浓缩，随后进一步采用双标记RT-PCR作为一种策略，通过使用常见的和普遍存在的转录物GAPDH来放大信号。这种改进可以明显地归因于生物素-C3肽与链亲和素-多HRP结合用于标记，在这种情况下实现电化学读出，由于与抗体相比尺寸更小，这在改善扩散和结合动力学方面是有利的，就像外泌体的情况一样。鉴于缺乏普遍接受的评估外泌体分析准确性的金标准，对耗尽的人血清中的外泌体进行了标准恢复研究。目的是验证通过免疫磁分离回收外泌体的效率，并评估样品制备和分析过程中的潜在损失。磁性酶联免疫吸附试验(elisa)和磁驱动生物传感器电化学检测回收率研究结果表明回收率在91.2至111.9之间，在人血清中具有良好的重现性，特别是在MCF-7和MDA-MB231外泌体的生物传感装置中。将修饰的MPs与抗cd63结合，然后根据噬菌体展示选择的肽进行检测，并结合到乳腺癌肿瘤蛋白配体上，在富集的血清基质中恢复和检测外泌体方面提供了有希望的结果，而无需进一步的样品处理或稀释。
本研究提出了一种用于乳腺癌源性外泌体的生物传感装置，包括用ANTID63进行免疫磁分离和基于生物素-C3肽的电化学读出。LOD比以前的研究提高了三倍，达到175外泌体μL-1的量级。通过噬菌体展示获得的肽通过各种方法证明了检测外泌体的有效性，并增强了对侵袭性细胞系的LOD。来自噬菌体的肽由于其稳定性、成本效益、可扩展性和可重复性，在生物传感器中比抗体具有优势。生物素-C3肽有望作为患者监测的预后工具，尽管进一步的临床验证是必要的。用于电化学读出的墨盒的设计是一个用户友好的功能，最大限度地减少了用户干预的需要，也有助于系统的易用性和可重复性，并防止移液和洗涤步骤。在电池操作的便携式设备中集成电化学读数，可以进行现场和护理点测试。所有这些特性都可能对实际应用程序产生重大影响，并结合起来显著改善LOD。总之，虽然这项研究已经证明了生物素-C3肽在检测癌症源性外泌体的生物传感装置中的预后潜力，但还需要进一步的验证，包括对该方法有效性的临床验证和评估其对患者预后的影响。
da Fonseca Alves, R., Pallarès-Rusiñol,
A., Rossi, R., Martí, M., Vaz, E. R., de Araújo, T. G., Sotomayor, M. D. P. T.,
& Pividori, M. I. (2024). Peptide-based biosensing approaches for targeting
breast cancer-derived exosomes. Biosensors & bioelectronics, 255, 116211. https://doi.org/10.1016/j.bios.2024.116211
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