癌症转移是乳腺癌（BC）患者死亡的主要原因。肝脏是乳腺癌转移的常见部位，而乳腺癌肝转移（BCLMs）患者的5年生存率仅为8.5%左右。CircRNAs参与了多种与癌症相关的病理行为，其独特的结构和抗RNA降解性使其成为理想的诊断生物标志物和治疗靶标。因此，研究circRNA 在癌症转移中的作用和分子机制非常重要。通过circRNAs 微阵列和qRT-PCR 实验，CircLIFR-007 被确定为BC 转移中的关键环状 RNA。circLIFR-007在乳腺癌肝转移中起负调控作用。circLIFR-007通过导出hnRNPA1来促进细胞质中hnRNPA1和YAP的结合，从而上调YAP的磷酸化水平。过表达circLIFR-007可抑制肝转移相关蛋白SREBF1和SNAI1的表达，而这两种蛋白受转录因子YAP调控。从功能上讲，circLIFR-007能抑制乳腺癌细胞在体内和体外的增殖和转移。该研究于2024年6月发表在《Cancer Letters》，IF：9.1。
首先，通过测序circRNA芯片分析了3例乳腺癌患者原发肿瘤组织和配对的肝转移组织中circRNA的表达情况（图1）。。我们注意到，与原发灶相比，has_circ_0072305在肝转移灶中显著下调（图1B）。根据CircBank （http://www.circbank.cn/index.html）， has_circ_0072305被命名为circLIFR-007，因为它来源于LIFR （LIF Receptor Subunit Alpha）基因（gene ID:3977）的第2 ~ 13外显子（图1C）。基于circLIFR-007的后剪接连接点设计特异性引物进行PCR实验，并通过Sanger测序进行验证。利用从20对乳腺癌原发灶和肝转移灶中提取的RNA, qRT-PCR实验显示，与原发灶相比，circLIFR-007在肝转移灶中的表达显著下调（图1D）。检测人源正常乳腺上皮细胞株（MCF-10A）和乳腺癌细胞株中circLIFR-007的表达。结果显示，与MCF-10A相比，circLIFR-007在各乳腺癌细胞系中均有不同程度的降低，且在MCF-7和MDA-MB-231细胞系中的表达水平较低（图1E）。对MCF-7和MDA-MB-231细胞株的gDNA和cDNA进行PCR实验，收集产物进行核酸电泳。结果表明，circLIFR-007仅通过该特异性引物在cDNA中成功扩增，其亲本基因LIFR在gDNA和cDNA中均成功扩增，表明circLIFR-007具有环状RNA的结构特征（图1F）。进行RNase Rase酶消化实验和放线菌素D实验，circLIFR-007相对于其亲本基因LIFR更稳定（图1G和H）。然后，将细胞内容物进行细胞质/核分离，确定RNA的相对表达量。结果显示，circLIFR-007在细胞质中表达约40%，在细胞核中表达约60%（图1I）。且U6主要表达于细胞核，GAPDH主要表达于细胞质，证明细胞质/核分离成功。进行RNA FISH实验，观察到circLIFR-007在细胞核中分布较多，在细胞质中分布较少（图1J）。
接着研究了circLIFR-007是否调节乳腺癌细胞的生物学功能。在MCF-7和MDA-MB-231细胞系中敲低或过表达circLIFR-007，并通过qRT-PCR实验验证转染效率（图2A）。用MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞进行细胞集落形成实验。敲低circLIFR-007组的单细胞克隆数量高于阴性对照组，而过表达circLIFR-007circlifr -007处理组的单细胞克隆数量低于对照组（图2A）。CCK-8细胞增殖实验显示，在MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞中，敲低circLIFR-007在450 nm处的OD值明显高于阴性对照组，而过表达circLIFR-007在450 nm处的OD值明显低于阴性对照组（图2B）。通过transwell细胞迁移实验进一步研究circLIFR-007是否影响乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力从而调控转移。结果显示，与对照组相比，circLIFR-007敲低组的迁移乳腺癌细胞数量显著增加，并且circLIFR-007过表达组的数量显著减少（图2C）。采用transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力。与对照组相比，敲低circLIFR-007乳腺癌细胞的侵袭细胞数量显著增加，而过表达乳腺癌细胞的侵袭细胞数量显著减少（图2D）。接下来，在MCF-7和MDA-MB-231细胞系中进行伤口愈合测定，结果表明，与阴性对照组相比，在circLIFR-007过表达处理组中，伤口愈合百分比明显较低（图2E）。以上实验证明circLIFR-007抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。
由于circLIFR-007在体外调节生物学功能，作者研究了其是否在体内乳腺癌细胞中发挥作用。将过表达circLIFR-007的MCF-7或MDA-MB-231细胞及其相应的对照细胞分别皮下注射到雌性BALB/C裸鼠中（图3A和B），结果显示，circLIFR-007过表达组的肿瘤重量和体积明显低于对照组（图3C和D），证实circLIFR-007在体内抑制移植瘤的生长。为验证circLIFR-007在体内乳腺癌肝转移过程中的作用，通过isp注射敲低circLIFR-007的MCF-7 BC细胞及其相应的对照细胞。建立乳腺癌肝转移模型。注射后每14 d进行1次荧光成像检测，28 d后收集肝组织。结果显示，敲低组的转移灶荧光强度较对照组增强（图3E），敲低组的肝组织转移灶数量较对照组显著增加（图3F和G）。以上实验结果表明，敲低circLIFR-007促进乳腺癌肝转移。
然后探索circlir007的分子作用机制。首先，设计circLIFR-007的探针并用于RNA pulldown实验。circLIFR-007的正义探针结合的蛋白质与阴性对照组有显著差异（图4A），对产物进行质谱分析，得到69个与探针特异性结合的蛋白质。根据三个筛选标准，circLIFR-007最显著的结合蛋白被确定为hnRNPA1（图4B）。提取MCF-7和MDA-MB-231细胞蛋白，与circLIFR-007的正义探针结合，进行RNA pulldown实验。Western blot检测结果表明，hnRNPA1与circLIFR-007结合，但未与对照探针结合（图4C）。RIP实验显示，在MCF-7和MDA-MB-231中，hnRNPA1富集到circLIFR-007，而IgG组未富集（图4D）。以上实验结果表明，circLIFR-007和hnRNPA1相互结合。
取小鼠肝转移灶组织切片进行IF-FISH检测。观察到，在circLIFR-007敲低组中，circLIFR-007在肝转移灶中的表达显著降低，并且circLIFR-007与hnRNPA1在空间位置上重叠（图4G）。近年来，circRNA被报道具有多种不同的功能。作者想知道与circLIFR-007和hnRNPA1结合的功能。Western blot检测显示，circLIFR-007对MCF-7和MDA-MB-231细胞中hnRNPA1的总表达没有影响（图4E）。在对照和过表circLIFR-007的MDA-MB-231细胞中成功进行核/质分离实验，产物用于测定hnRNPA1的表达。Western blot实验显示，过表达circLIFR-007增加hnRNPA1从细胞核到细胞质的转运，并计算相对表达量（图4F）。
根据之前的研究，hnRNPs蛋白家族经常与其他蛋白结合并共同发挥作用，并且与不良预后呈正相关。基于3个常用的蛋白质相互作用数据库（HIPredict, String, BioGRID），预测YAP与与肿瘤细胞转移最相关的蛋白hnRNPA1相互作用（图5A）。通过Co-IP实验验证hnRNPA1是否与YAP结合（图5B）。免疫荧光实验发现， hnRNPA1和YAP在空间位置上有重叠（图5C）。RNA下拉实验表明，circLIFR-007不与YAP结合（图5D）。根据相关文献，hnRNPs家族蛋白可与其他蛋白结合，调节其磷酸化水平。作者推测hnRNPA1与YAP结合影响其磷酸化水平。随后，使用蛋白成核转运抑制剂Leptomycin B （Lep-B）抑制hnRNPA1的核转运。Western Blot实验（图5E）显示过表达circLIFR-007后，细胞质中hnRNPA1和磷酸化YAP显著增加，而过表达circLIFR-007并加入Lep-B后，hnRNPA1和磷酸化YAP的表达降低（图5F和G）。这些结果表明，hnRNPA1促进细胞质中YAP的磷酸化水平。成功进行细胞核/细胞质分离实验（图1B）。Western blot检测显示，在circLIFR-007过表达组及其阴性对照组中，MST1、LATS1、YAP和TAZ的总蛋白表达量无显著差异（图5H），表明circLIFR-007对经典Hippo通路无影响。
由于circLIFR-007在肝转移中下调，作者推测其对肝转移的调控是器官特异性的。回顾相关研究，基于hTFTarget、SREBF1和SNAI1的已发表数据，发现它们与肝转移呈正相关，并受YAP/TEAD调控（图6A）。qRT-PCR实验验证，SREBF1和SNAI1的RNA表达在circLIFR-007过表达的乳腺癌细胞中显著下调，而在circLIFR-007敲低的乳腺癌细胞中显著上调（图6B）。Western Blot实验验证SREBF1和SNAI1的蛋白表达水平。结果表明，SREBF1和SNAI1的蛋白表达在过表达circLIFR -007乳腺癌细胞中明显下调，而在敲低circlif -007乳腺癌细胞中则上调（图6C）。之后，使用小鼠肝转移标本的组织切片进行免疫组织化学实验。结果证实，与阴性对照组相比，circLIFR-007敲低组hnRNPA1和YAP1在细胞核中表达更多，与对照组相比，敲低circLIFR-007组的肝转移灶中SREBF1和SNAI1的表达显著升高（图6D）。这些结果表明，circLIFR-007结合hnRNPA1促进其核外易位后解离，hnRNPA1结合YAP蛋白上调YAP蛋白的磷酸化水平并抑制其入核转录调节特异性肝转移相关蛋白的因子（图7）。
综上所述，本研究的结果提供了乳腺癌转移器官特异性的关键机制。circLIFR-007可作为一种新的生物标志物，与现有危险因素相结合，评估乳腺癌的复发转移风险。此外，circLIFR-007通过上调YAP的磷酸化水平在细胞质中诱捕YAP，并在物理上阻止YAP与TEAD的结合。这一发现为抑制YAP/TEAD转录因子提供了新的思路。
Zhang Y, Tan Y, Yuan J, Tang H, Zhang H, Tang Y, Xie Y, Wu L, Xie J, Xiao X, Li Y, Kong Y. circLIFR-007 reduces liver metastasis via promoting hnRNPA1 nuclear export and YAP phosphorylation in breast cancer. Cancer Lett. 2024 Jun 28;592:216907. doi: 10.1016/j.canlet.2024.216907. Epub 2024 Apr 27. PMID: 38685451.
