胰腺导管腺癌（PDAC）是最常见的胰腺癌类型，也是最致命的癌症形式之一，治疗选择有限。热休克蛋白70（HSP70）的过度表达是癌症的一个标志，与疾病的侵袭性和较差的临床结果强烈相关。然而，HSP70使肿瘤细胞在持续压力条件下茁壮成长的潜在机制尚未完全阐明。本研究发现PDAC在所有分析的癌症中相对于正常组织具有最高的HSP70表达。此外，HSP70的表达与肿瘤等级相关，并且在转移性PDAC中进一步增强。研究表明，HSP70的遗传或治疗性消融改变了线粒体亚细胞定位，损害了线粒体动力学，并促进线粒体肿胀以诱导凋亡。从机制上，研究发现靶向HSP70抑制了PTEN诱导的激酶1（PINK1）介导的与动力蛋白相关蛋白1（DRP1）的磷酸化。使用HSP70抑制剂AP-4-139B治疗在原发性和转移性小鼠模型中作为单一药物是有效的。此外，研究表明HSP70抑制促进了AMP激活蛋白激酶（AMPK）介导的Beclin-1的磷酸化，这是自噬通量的关键调节器。因此，研究发现自噬抑制剂羟氯喹（HCQ）增强了AP-4-139B在体内介导抗肿瘤活性的能力。总体而言，结果表明HSP70是一个多功能的肿瘤驱动因子，它协调线粒体动力学和自噬。此外，这些发现支持了同时抑制HSP70和自噬作为HSP70驱动的PDAC的新型治疗方法的合理性。该研究于2024年7月发表于《Cell Death & Differentiation》上，影响因子13.7。
与正常细胞不同，肿瘤细胞有相当一部分HSP70定位在线粒体上。我们试图利用一种独特作用的HSP70抑制剂AP-4-139B（也称139B），来针对PDAC中的这一潜在弱点，该抑制剂针对肿瘤细胞的多个区域包括线粒体中的HSP70。AP-4-139B是一种高特异性的抑制剂，针对应激诱导的HSP70。值得注意的是，AP-4-139B不与其他在正常表达且不会被应激显著诱导的HSP70家族成员结合，包括GRP75和BiP。为了测试AP-4-139B对PDAC中线粒体活动的影响，我们评估了TERT永生化的人类胰腺上皮细胞（hTERT-HPNE）与两种PDAC细胞系PANC-1和MIA PaCa-2的线粒体功能。每个细胞系在含有亚致死浓度的AP-4-139B（500纳摩尔）中孵育24小时，然后使用Seahorse XFe96分析仪进行线粒体压力测试。这些分析显示，非转化的hTERT-HPNE细胞在HSP70抑制（HSP70i）下基本上没有受到影响。然而，当PANC-1和MIA PaCa-2细胞用AP-4-139B处理时，它们的基础和最大氧消耗率显著降低，并伴随着ATP产生量的减少（图1A–F）。
HSP70已被证明可以抑制线粒体活性氧（ROS）。鉴于ROS的大量变化可以促进氧化应激以诱导细胞死亡，我们试图确定HSP70的抑制是否影响整体细胞内ROS以及线粒体ROS（mROS）的产生。为了测试这一点，我们进行了基于CellROX和MitoSOX的流式细胞术检测分析，以分别检测未经处理与经AP-4-139B处理的PDAC细胞中的ROS和mROS。我们发现HSP70的抑制增加了ROS水平，并且在多个经过测试的PDAC细胞系中，mROS随剂量增加而增加（图1G，H）。与这些发现一致，我们观察到经AP-4-139B处理的PANC-1和MIA PaCa-2细胞出现了剂量依赖性的线粒体膜电位（MMP）丧失（图1I，J）。总之，我们的结果提供了证据，表明HSP70的抑制损害了PDAC细胞中的线粒体功能。
近期研究表明，具有生物能量活性的线粒体会移动到皮质细胞骨架上，并定位到焦点粘附复合体上，以调节促瘤途径，包括增强肿瘤细胞的移动性和侵袭性。据我们所知，HSP70对线粒体亚细胞定位的影响从未被研究过。为了测试这一点，我们将PANC-1和MIA PaCa-2细胞在有无AP-4-139B的情况下在盖玻片上培养24小时。然后，我们使用MitoTracker DeepRed对细胞进行染色，随后进行共聚焦显微镜观察和皮质线粒体分析，如前所述。我们发现HSP70的抑制导致线粒体从周边/皮质细胞骨架重新分布到两个PDAC细胞系测试的核周区域（图2A-C）。使用针对应激诱导的HSP70家族成员HSPA1A的合并siRNA也观察到类似的结果，HSPA1A部分定位在肿瘤细胞的线粒体上。鉴于HSP70在线粒体动力学中的功能性角色尚未确定，我们还想确定HSP70的抑制是否影响线粒体动力学。使用时间延迟视频显微镜，我们发现遗传性或治疗性的HSP70消融显著损害了线粒体的运动性，这体现在AP-4-139B处理的PDAC细胞中线粒体运动速度的降低和单个线粒体移动距离的减少（图2D-F）。
线粒体的亚细胞分布和运动能力都受到线粒体结构的影响，而线粒体结构又受到线粒体分裂和融合过程的调节。这些过程还调节线粒体稳态，并有助于维持最佳的线粒体功能。为了测试HSP70抑制对线粒体结构的影响，我们使用Mito Hacker分析了经AP-4-139B处理的PDAC细胞中用MitoTracker Red染色的线粒体的结构特征。我们观察到，在PANC-1和MIA PaCa-2细胞中，HSP70抑制导致线粒体网络的几个结构特征显著差异，包括线粒体的圆度和宽度（图2G，H）。总的来说，这些发现表明线粒体肿胀，这是线粒体细胞死亡的一个关键形态学特征。这些数据也与分裂和融合活动平衡的转变一致。为了进一步扩展这些发现，我们通过时间延迟视频显微镜分析了PDAC细胞的线粒体，并发现遗传性或药理性抑制HSP70损害了PANC-1和MIA PaCa-2细胞的线粒体网络，表现为线粒体分裂和融合事件的速率降低（图2I，J）。综合起来，我们的结果支持HSP70调节线粒体动力学和亚细胞器运输的概念，这两者对PDAC的进展和转移至关重要。此外，HSP70抑制诱导的线粒体肿胀支持了抑制HSP70可以促进线粒体细胞死亡程序的前提。
DRP1是一种GTPase，促进了促进胰腺癌所需的代谢和线粒体变化。因此，我们假设HSP70抑制对我们在本文中描述的线粒体动力学的影响可能依赖于DRP1。为了测试这一点，我们首先评估了HSP70抑制对DRP1在丝氨酸616上的磷酸化的影响，这种磷酸化修饰促进了线粒体分裂。我们发现，用AP-4-139B抑制HSP70显著降低了三个不同的PDAC细胞系中丝氨酸616的磷酸化DRP1水平（图3A–C）。西方印迹分析的定量表明，在HSP70抑制后DRP1丝氨酸616磷酸化的时间依赖性减少（图3D–F）。我们还观察到，在PDAC细胞中HSP70抑制后DRP1在丝氨酸637上的磷酸化同时增加。为了使用HSP70的遗传性消融来实验性地重现这些结果，我们将PANC-1和Hs776T细胞转染了一组HSPA1A siRNA，并评估了DRP1在丝氨酸616上的磷酸化。HSP70的沉默导致两种PDAC细胞系中DRP1丝氨酸616磷酸化水平显著降低（图3G–I）。这些数据表明，HSP70的抑制改变了DRP1的磷酸化，这可能部分解释了HSP70抑制如何损害线粒体动力学。
我们随后寻求确定HSP70抑制如何影响DRP1磷酸化以调节PDAC中线粒体动力学的机制。已经显示MAP激酶ERK2能够磷酸化DRP1的丝氨酸616以促进线粒体分裂和胰腺肿瘤生长。令人惊讶的是，我们发现用AP-4-139B处理的PDAC细胞在ERK1/2的磷酸化或总水平上没有显示出任何显著变化，表明HSP70i介导的DRP1调节独立于ERK1/2。尽管还有几种其他蛋白激酶可以调节DRP1在丝氨酸616的磷酸化，我们接下来专注于那些（1）被分类为真正的HSP70客户蛋白和（2）已经被牵涉到DRP1介导的线粒体动力学中的激酶。在这些激酶中，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PTEN诱导的激酶1（PINK1）已经被报道在过表达研究中与HSP70相互作用，并且已经被显示磷酸化DRP1的丝氨酸616以调节线粒体动力学。我们发现用能够减少丝氨酸616的DRP1磷酸化的AP-4-139B浓度处理的PDAC细胞也显示出PINK1蛋白水平的显著降低（图3J）。西方印迹分析显示，先前报道调节丝氨酸616的DRP1磷酸化的其他激酶，包括AKT、CDK1、CDK5和GSK-3β，在HSP70抑制后并没有显著影响（图3J）。
鉴于PINK1是一种固有不稳定的蛋白，它既会受到切割也会受到蛋白酶体降解，我们试图确定它是否会与HSP70相互作用并受到HSP70的调节。为了测试这一点，我们首先在PANC-1和MIA PaCa-2细胞中进行了内源性HSP70和PINK1的共免疫荧光（co-IF）。我们发现测试的两种PDAC细胞系都显示出PINK1和HSP70的显著共定位，主要在细胞质中（图3K）。接下来，我们使用共免疫沉淀（co-IP）和邻近连接测定（PLA）两种检测方法来评估HSP70与PINK1的相互作用能力。使用PINK1抗血清的免疫沉淀显示PANC-1和MIA PaCa-2细胞的免疫沉淀复合物中有HSP70（图3L）。此外，在PANC-1细胞中进行的PLA证实了HSP70和PINK1之间的相互作用（图3M）。最后，我们在PANC-1细胞中共表达了PINK1-YFP和mScarlet-HSP70，并发现与mScarlet-Vector对照相比，HSP70的过表达在用环己酰亚胺（CHX）处理后导致PINK1水平增加（图3N）。综合这些数据支持PINK1是HSP70的一个真正客户蛋白的观点，并支持HSP70抑制通过抑制PINK1-DRP1轴来调节PDAC中线粒体动力学的新机制。
鉴于DRP1和线粒体动力学在肿瘤侵袭表型中的作用，我们想要确定AP-4-139B对PDAC迁移和转移的影响。在这些研究中，我们使用了AP-4-139B的浓度和时间点，这些浓度和时间点在细胞作为单层生长时不会抑制细胞增殖且没有细胞毒性。这些实验揭示了，在用AP-4-139B处理后，PANC-1和MIA PaCa-2细胞的迁移能力显著受损（图4A）。到了36小时，DMSO对照组的细胞迁移填充了90%以上，而经AP-4-139B处理的迁移填充大约只有50%（图4B）。为了进一步支持这些发现，我们对单细胞进行了活细胞成像，以确定对HSP70抑制的2D肿瘤细胞运动能力。同样，在非细胞毒性剂量下，我们注意到用AP-4-139B处理后，PANC-1和MIA PaCa-2细胞的运动能力显著受损（图4C–E）。对这两种细胞系的西方印迹分析显示，HSP70抑制导致包括Snail、Slug和β-Catenin在内的几种EMT标记物的减少，这可能部分解释了经AP-4-139B处理的PDAC细胞迁移潜力的降低。
我们接下来想要评估HSP70抑制在体内抑制胰腺癌转移的能力。为了实现这一目标，我们使用了MIA PaCa-2 PDAC细胞系，该细胞系通常用于转移性检测，因为它能够在尾静脉注射后在肺部形成殖民。我们通过尾静脉向NSG小鼠注射MIA PaCa-2细胞，随后每隔一天腹腔注射10 mg/kg的AP-4-139B（图4F）。我们发现，用AP-4-139B治疗小鼠能够显著减少转移潜力；这伴随着肺重量的减少以及在用AP-4-139B治疗的小鼠肺部转移中，增殖标志物Ki67染色的减少（图4G–J）。在这个剂量下，我们没有发现明显的毒性迹象，因为用AP-4-139B治疗的小鼠没有体重下降的证据。综合数据支持AP-4-139B在体内对抗转移性PDAC的有效性。
为了展示针对胰腺癌中HSP70的靶向治疗潜力和临床相关性，我们首先使用癌症基因组图谱（TCGA）（https://www.cancer.gov/tcga）分析了不同肿瘤类型中HSP70（HSPA1A）的mRNA表达，并与正常组织进行了比较。我们发现与正常组织相比，HSP70在几种不同的癌症类型中有显著的过度表达（图5A）。更重要的是，PDAC是肿瘤与正常组织中HSP70比例最高的癌症类型，突显了HSP70作为PDAC特异性靶标的潜力。我们还发现，与Grade I肿瘤相比，Grade II/III胰腺癌中HSP70表达最高（图5B），并且在转移性疾病中表达也有所增加（图5C）。
接下来，我们在一组经三种不同的HSP70抑制剂处理的人类PDAC细胞系上进行了细胞活性实验：VER-155008、PET-16和AP-4-139B。VER-155008对降低PDAC细胞活性的能力很小到适中，PET-16以细胞类型特异性的方式显示了对活性的影响，而AP-4-139B在所有测试的PDAC细胞系中的细胞毒性明显更强（图5D）。我们通过在五种PDAC细胞系上进行西方印迹分析扩展了这些发现，发现AP-4-139B是唯一能够诱导所有细胞系死亡的HSP70抑制剂，与其他测试的HSP70抑制剂相比，通过诱导多种细胞死亡标志物，包括Cleaved Lamin A和Cleaved Caspase 3。在相同浓度下，与已建立的HSP90抑制剂17-AAG相比，AP-4-139B在刺激PDAC细胞死亡方面也显示出优越的效力（图5E）。接下来，我们评估了AP-4-139B在六种不同基因型的PDAC细胞系中的GI50（生长抑制-50），包括具有不同KRAS和TP53突变的细胞系。我们还比较了AP-4-139B与其他HSP70抑制剂的毒性，以及作为AP-4-139B阴性对照的VY-3-277。VY-3-277由TPP基团加连接链组成，但不包含抑制HSP70所需的平面基团。正如预期的那样，VY-3-277的GI50值是AP-4-139B的15到60倍。此外，无论基因型如何，AP-4-139B在所有测试的PDAC细胞系中的表现都优于VER-155008和PET-16。为了确认AP-4-139B的效果直接归因于HSP70的抑制，我们使用CRISPR/Cas9技术生成了两个独立的HSP70敲除（KO）MIA PaCa-2细胞系。我们发现，HSP70的缺失导致MIA PaCa-2细胞对AP-4-139B的抗性显著增加（图5F）。值得注意的是，其他HSP70家族成员的蛋白水平，包括同源的HSPA8（HSC70）和线粒体HSPA9（GRP75），在HSP70-KO细胞中不受影响。总的来说，我们的数据强烈支持AP-4-139B通过特别针对应激诱导的HSP70来影响PDAC细胞的活性。
我们之前对经AP-4-139B处理的黑色素瘤细胞的线粒体进行了无偏倚的蛋白质组学分析，并鉴定了包括MRPS14和NDUFA6在内的新型HSP70客户蛋白。在用AP-4-139B的GI50处理的三种人类PDAC细胞系上进行的西方印迹分析显示，在所有测试的细胞系和时间点上，MRPS14和NDUFA6的水平显著降低，而像BAK这样的非HSP70客户蛋白的水平则不受影响（图5G）。在几种测试的小鼠PDAC细胞系中也发现了类似的结果，证实了AP-4-139B对PDAC细胞线粒体的直接效力。有趣的是，VER-155008和HSP90抑制剂17-AAG并没有引起MRPS14的减少（图5E），这与HSP70和HSP90在蛋白质稳态和癌症中有一些不重叠的角色的观点一致。
然后，我们评估了AP-4-139B对体内肿瘤生长的影响能力。我们的数据揭示了，当小鼠每隔一天用10 mg/kg的AP-4-139B治疗时，HSP70的抑制显著减缓了PANC-1和MIA PaCa-2肿瘤异种移植物的进展，与单独使用载体相比（图5H）；这一点通过两种异种移植模型的肿瘤体积和肿瘤重量在终点的确认（图5I）。然后我们使用免疫组化（IHC）分析肿瘤组织，发现用AP-4-139B治疗导致Ki67（增殖）和CD31（血管生成）的免疫染色减少，以及细胞死亡标志物Cleaved Lamin A和Cleaved Caspase 3的染色增加（图5J，K）。在这个剂量下，我们没有发现明显的毒性迹象，因为没有体重下降或异常胰腺结构的证据。值得注意的是，我们在用AP-4-139B治疗的PANC-1和MIA PaCa-2异种移植物的肿瘤组织中观察到PINK1免疫荧光显著减少（图5L，M）。综合起来，联合数据支持AP-4-139B作为单一药剂通过部分靶向体内线粒体功能来减缓肿瘤进展的前提。
几份报告已经确定PDAC中自噬的基线水平升高，并可能作为对抗细胞毒性治疗的保护性、抗凋亡机制。然而，HSP70在癌症中调节自噬的直接作用仍然有些有争议，可能部分是由于不同研究中肿瘤特异性差异造成的。为了确定HSP70的抑制是否影响PDAC中的自噬，我们使用几种生化技术来调查HSP70抑制后自噬通量的变化。首先，我们在表达串联荧光报告基因mCherry-EGFP-LC3B的PDAC细胞系上评估自噬通量。LC3B是与自噬相关的蛋白，它经历翻译后修饰，导致其脂化并结合到自噬泡上。我们发现，用AP-4-139B抑制HSP70在四个人类PDAC细胞系中导致自噬通量增加（图6A，B）。然后，我们进行了西方印迹分析，监测与自噬体相关的脂化的LC3B-II的诱导以及Beclin-1的磷酸化，Beclin-1是早期自噬启动和吞噬泡组装的关键驱动因素。我们发现，HSP70的抑制显著增强了LC3B-II的水平和Beclin-1的激活，这一点通过在丝氨酸93上的增强磷酸化得到证实（图6C）。为了扩展这些发现并确认HSP70抑制对自噬的影响，我们在存在或不存在自噬抑制剂氯喹（CQ）的情况下进行了额外的自噬通量测定。正如预期的那样，用AP-4-139B处理PDAC细胞导致自噬通量显著增加；然而，在CQ存在的情况下，HSP70i介导的自噬诱导显著被取消（图6D）。因此，通过在四个人类PDAC细胞系中使用多种测定方法在不同条件下监测自噬，我们的数据支持HSP70抑制导致PDAC中自噬通量的诱导这一前提。
AMPK是一个关键的能量感受器，通过磷酸化被激活。一旦激活，AMPK可以随后促进Beclin-1的磷酸化以诱导自噬。我们发现用AP-4-139B处理的PDAC细胞在AMPK的苏氨酸172位点上表现出明显的磷酸化诱导，这是一个公认的AMPK激活标志（图6E）。此外，我们在存在或不存在针对AMPK（PRKAA1）的合并siRNA的情况下，对经AP-4-139B处理的PDAC细胞进行了自噬通量分析。这些实验揭示了通过siRNA沉默AMPK抑制了AP-4-139B在PDAC细胞中诱导自噬的能力（图6F–H）。虽然这些数据加强了AMPK在HSP70i诱导的自噬中的作用，但HSP70抑制激活AMPK的机制尚不清楚。最近的报告显示AMPK是通过线粒体ROS的诱导而被激活的。鉴于HSP70抑制在PDAC细胞中显著增加了线粒体ROS，我们假设HSP70抑制后的AMPK激活可能也是通过类似的机制发生的。为了测试这一点，我们用线粒体特异性ROS清除剂Mito-TEMPO对PK-8和TCC-Pan2细胞进行了3小时的预处理，然后用AP-4-139B抑制HSP70。有趣的是，我们发现用Mito-TEMPO预处理PDAC细胞显著抑制了AP-4-139B诱导AMPK在苏氨酸172位点上的磷酸化能力（图6I, J）。总的来说，这些发现支持HSP70抑制通过部分诱导线粒体ROS来激活AMPK介导的自噬的观点。
接下来，我们想要确定HSP70和自噬抑制的组合是否可能对PDAC治疗有效。为此，我们用AP-4-139B、CQ或这两种抑制剂的组合对待了一系列PDAC细胞系。BLISS协同分析揭示了AP-4-139B和CQ的组合在所有四个测试的PDAC细胞系中表现出协同活性（图7A）。鉴于CQ通过影响溶酶体功能间接抑制自噬，我们使用阻断自噬途径特定组分的抑制剂进行了额外的协同实验，包括Spautin-1和MRT68921。Spautin-1抑制了启动自噬体形成的泛素特异性肽酶USP10和USP13；MRT68921靶向自噬前启动复合体的催化组分蛋白激酶ULK1/2。像CQ一样，Spautin-1和MRT68921在所有四个测试的PDAC细胞系中与AP-4-139B协同。然后我们对这四个PDAC细胞系进行了西方印迹分析，发现用AP-4-139B和CQ的组合处理导致诱导凋亡，证据是Cleaved Lamin A、Cleaved Caspase 3和Cleaved PARP的水平增加，与任一药剂单独使用相比（图7B）。然后我们进行了克隆形成生存实验，发现将AP-4-139B与CQ组合使用显著损害了PK-8和MIA PaCa-2细胞的克隆形成能力，与任一药剂单独使用相比（图7C, D）。总之，我们的数据表明AP-4-139B与自噬抑制剂协同作用，抑制PDAC在体外的进展。
接下来，我们评估了同时抑制HSP70和自噬对体内PDAC肿瘤生长的影响。为了测试这一点，我们将PK-8细胞皮下注射到NSG小鼠的侧腹中。当肿瘤体积达到大约50立方毫米时，小鼠被随机分为四组（每组7-9只小鼠）：对照组、AP-4-139B（每次10毫克/千克，隔日腹腔注射）、羟氯喹（HCQ；每天50毫克/千克腹腔注射），或组合治疗（AP-4-139B每次10毫克/千克，隔日；HCQ每天50毫克/千克）。对肿瘤生长的分析显示，AP-4-139B作为单一药剂对PK-8肿瘤有显著的疗效，而HCQ治疗对肿瘤生长几乎没有影响。值得注意的是，HCQ增强了AP-4-139B在体内的疗效，与单独使用AP-4-139B相比，组合疗法显著减少了肿瘤体积（图7E）。这种组合疗法似乎耐受性良好，因为我们没有观察到这些小鼠的体重发生显著变化。此外，从使用AP-4-139B和HCQ组合治疗的小鼠身上收获的肿瘤明显小于单独使用AP-4-139B或HCQ治疗的小鼠的肿瘤（图7F, G）。总的来说，我们的发现提供了证据，表明同时抑制HSP70和自噬可能代表了一种抑制PDAC生长的新型治疗策略。
Ferretti GDS, Quaas CE, Bertolini I, Zuccotti A, Saatci O, Kashatus JA, Sharmin S, Lu DY, Poli ANR, Quesnelle AF, Rodriguez-Blanco J, de Cubas AA, Hobbs GA, Liu Q, O'Bryan JP, Salvino JM, Kashatus DF, Sahin O, Barnoud T. HSP70-mediated mitochondrial dynamics and autophagy represent a novel vulnerability in pancreatic cancer. Cell Death Differ. 2024 Jul;31(7):881-896.
