![]()
肿瘤相关微生物群在癌症发展中起着至关重要的作用。越来越多的证据表明，核梭杆菌(Fn)参与多种肿瘤类型的进展。然而，潜在的机制仍不清楚。本研究发现Fn在肝细胞癌（HCC）、乳腺癌（BRCA）、食管鳞状细胞癌（ESCC）和结直肠癌（CRC）肿瘤组织中富集。在ESCC 组织中，METTL3 的表达与Fn 的丰度呈正相关。Fn 使ESCC、HCC、CRC和 BRCA 细胞存活和增殖，并能增加METTL3 的表达。此外，METTL3的过表达可促进ESCC细胞在体内和体外的增殖和迁移。机制上，细胞内Fn 感染增加 METTL3 的转录。METTL3促进c-Myc
mRNA在3′-非翻译区（3′-UTR）的甲基化，并以YTH
N6-甲基腺苷RNA结合蛋白1（YTHDF1）依赖的方式增强其mRNA的稳定性，这有助于Fn诱导的ESCC增殖和转移。该研究于2024年7月发表在《Journal
of Advanced Research》，IF：11.4。
技术路线：
![]()
主要研究结果：
1. 瘤内 F.nucleatumin 感染与 ESCC 组织中 METTL3 的表达呈正相关
据报道，Fn参与多种肿瘤类型的进展。首先，通过免疫荧光验证 Fn 在四种肿瘤组织（T）（结直肠癌，CRC，n = 3；乳腺癌，BRCA，n = 3；ESCC，n = 3；肝细胞癌，HCC，n = 3）中的富集程度高于匹配的正常组织（N）（图 1A）。使用 qPCR 法进一步确认了 22 例新鲜切除的 ESCC 标本的肿瘤组织和匹配的正常组织中 Fn-DNA 的相对丰度。如图 1B 所示，肿瘤组织中的 Fn-DNA 水平明显高于匹配的正常组织（P < 0.001）。然后，分析TCGA数据集中m6A修饰直接调控因子的基因表达，包括甲基转移酶样14（METTL14）、METTL3、脂肪量和肥胖相关蛋白（FTO）、Wilms'tumor 1-associated蛋白（WTAP）和alkB同源物5（ALKBH5）。研究结果表明，与正常组织相比，ESCC组织中METTL3和WTAP mRNA表达水平持续升高（图1C和图S1A）。此外，通过 qRT-PCR 证实，Fn 感染增加 Eca109 和 Kyse150 细胞中 METTL3 mRNA 的表达（图 1D）。为了进一步验证这些发现，随后进行 IHC 检测。ESCC肿瘤组织中METTL3的蛋白表达量明显高于匹配的正常组织（n = 10）（图1E-F）。接下来，Kaplan-Meier分析结果显示，METTL3高表达的ESCC、BRCA、HCC和CRC患者的总生存时间比METTL3低表达的患者短（图1G和图S1C）。对TCGA队列进行的进一步多变量和单变量Cox回归分析表明，METTL3过表达是ESCC的独立预测因素（图1H）。此外，通过 IHC 染色发现，与 Fn 阴性组织相比，Fn 阳性 ESCC 组织中 METTL3 的表达明显增加（P < 0.01）（图 1I）。此外，Fn的丰度与METTL3的表达呈正相关（R = 0.796，P = 0.006）（图1J）。总之，Fn作为一种瘤内细菌存在于各种肿瘤组织中，其丰度与METTL3的表达呈正相关，表明瘤内Fn可能通过上调METTL3的表达而影响ESCC患者的预后。![]()
图1.
F. nucleatum富集于各肿瘤组织，并与ESCC中METTL3的表达呈正相关
2. F.nucleatum 的细胞内繁殖促进肿瘤细胞中 METTL3 的表达
由于在多种类型的临床肿瘤样本中都能发现 Fn，利用 Fn 和肿瘤细胞共培养系统进一步测定 Fn 侵袭不同类型肿瘤细胞的能力。先用 Fn 培养肿瘤细胞，然后用 100 μg/mL 庆大霉素培养以消除细胞外的 Fn。Fn和ESCC细胞系（Eca109和Kyse150细胞）、BRCA细胞系（231和MCF7细胞）、HCC细胞系（Huh7和HepG2细胞）以及CRC细胞系（HCT116和SW480细胞）以10倍的MOI共培养24、48和72小时。如图 2A 所示，Fn 在肿瘤细胞的细胞质中被标记为红色荧光。此外，根据细菌菌落计数，细胞内 Fn 的数量在最初的 24 到 72 小时内稳步增加（图 2B）。在所有这些肿瘤细胞中，只有活的 Fn 在中等感染倍数（MOI = 10:1）下才会增加 METTL3 的表达（图 2C）。然而，在与大肠杆菌对照组或热杀灭 Fn 培养期间，没有观察到 METTL3 表达的明显变化（图 2C）。使用从 ESCC 组织样本（Fn-ESCC）中分离出的 Fn 菌株验证了相同的结果（图 2D）。同样，IF 染色显示，在 Fn 感染后 24 小时，细胞核中 METTL3 的荧光强度增强（图 2E）。这些结果表明，Fn 不仅能在肿瘤细胞内存活和繁殖，而且细胞内的 Fn 能显著上调肿瘤细胞中 METTL3 的表达。![]()
图2.
F. nucleatum 能在ESCC、BRCA、HCC和 CRC 细胞系中存活、增殖并上调METTL3 的表达
3. 上调的 METTL3 有助于 F. nucleatum 在细胞内繁殖并促进 ESCC 细胞的恶性行为
为进一步验证 Fn 诱导的 METTL3 在细菌和宿主细胞中的表达功能，构建稳定的 METTL3 敲除（sh-METTL3）和 METTL3 表达（oe-METTL3）的 Eca109 和 Kyse150 细胞。利用 Western 印迹验证了 METTL3 的表达（图 3A 和图 S2A）。当敲除 Eca109 和 Kyse150 细胞中的 METTL3 时，Fn 处理的 ESCC 细胞中上调的 METTL3 蛋白水平明显降低（图 3A）。正如预测的那样，敲除 METTL3 会削弱 Fn 介导的 Eca109 和 Kyse150 细胞增殖能力（图 3B）。此外，沉默 METTL3 能显著逆转 Fn 诱导的细胞迁移能力的增强（图 3C-D），这凸显了 METTL3 在维持 Fn 介导的功能方面的重要作用。如图 3E 所示，与对照细胞相比，METTL3 的过表达有利于 Fn 在宿主细胞中的繁殖，而 Fn 在 sh-METTL3 Eca109 和 Kyse150 细胞中的繁殖受到限制。综上所述，METTL3 能在 Fn 感染期间保护胞内细菌和宿主细胞。![]()
图3. METTL3参与F.
nucleatum诱导的ESCC细胞体外增殖和迁移
4. 通过高通量 RNA-Seq 和 m6A-Seq 鉴定 F.nucleatum 感染的 Eca109 细胞中的 METTL3 靶标
为研究 Fn 感染过程中特定基因的 m6A 修饰变化，进行差异转录组测序和差异 m6A 测序，目的是分析 Fn 感染的 Eca109 细胞和对照 Eca109 细胞的表达变化并绘制 m6A 修饰图。这些技术以简明直观的方式显示出来（图 4A）。与之前的研究结果一致，确定的 m6A 峰的分布在终止密码子近端表现出最显著的富集程度，在 mRNA 内含子和 mRNA 外显子区域观察到的比例相对更高（图 4B）。在这些细胞中，共识基团富集在 m6A 位点内（图 4C），与其他研究中描述的常见 m6A 基团相似。与之前的研究一致，m6A 信号在 mRNA 的终止密码子和 3′-非翻译区 (UTR) 中显示出更高的浓度（图 4D）。本研究利用 meRIP-seq 和 RNA-seq 数据检查了每个峰值与 mRNA 表达之间的关联，阐明了 m6A 和 RNA 水平发生显著变化的基因组环境。如图 4E 所示，与对照细胞相比，Fn 感染的 Eca109 细胞有 144 个高甲基化的 m6A 峰和更高的 mRNA 水平（折叠变化≥ 2，p < 0.05）。此外，m6A测序分析结果显示，Fn感染后，MYC mRNA终止密码子附近区域的m6A峰值显著升高（图4F）。此前有研究表明，METTL3可促进c-Myc在胃癌中的翻译。在 c-Myc mRNA 3′ UTR 的 m6A 修饰中发现 METTL3 的共识基序（GGACU），该基序与停止密码子相邻（图 4G）。RNA 测序结果显示，Fn 感染组的 Myc 表达量大幅增加（log2 FC | > 5，P < 0.001）（图 4H）。此外，通过基因本体（GO）富集分析确定，在感染 Fn 的 Eca109 细胞中，m6A 修饰存在于数量有限的基因中，这些基因与控制囊泡融合、纺锤体和氨基酸运输有关（图 4I）。进行 KEGG 通路富集分析（图 S3）。TCGA的基因表达谱交互分析（GEPIA）数据库显示，在ESCC组织中，Myc的表达与METTL3呈正相关（图4J）。这些结果表明，Fn诱导的Myc表达增加取决于METTL3的m6A甲基转移酶活性。![]()
图4. 在感染F. nucleatum 的ESCC 细胞中，METTL3 介导的MYC mRNA m6A 修饰增加。
5. F.nucleatum感染通过METTL3/YTHDF1/c-Myc轴促进ESCC的恶性行为
通过Western印迹验证METTL3激活后c-Myc的上调，并证实METTL3沉默会降低c-Myc蛋白的表达，而METTL3过表达则会增强其表达（图5A）。同时，在Fn感染的Eca109和Kyse150细胞中，c-Myc蛋白水平显著升高，而METTL3敲除抑制c-Myc的升高（图5A）。通过免疫沉淀 RNA 然后进行 qPCR（RIP-qPCR）证实 METTL3 与 c-Myc mRNA 之间的直接相互作用，并证实 c-Myc mRNA 是 METTL3 的靶标（图 5B）。比较为进一步证实m6A修饰有助于调控c-Myc的表达，用全局甲基化抑制剂3-脱氮腺苷（DAA）处理Eca109和Kyse150细胞。DAA 能明显降低 c-Myc 的 mRNA 和蛋白表达（图 5D）。用放线菌素 D 阻止感染 Fn 的 Eca109 和 Kyse150 细胞的转录。qRT-PCR 分析结果表明，Fn 明显延长 c-Myc mRNA 在 Eca109 和 Kyse150 细胞中的半衰期（图 5E）。METTL3 靶标转录本稳定性的增加是通过 YTHDF1 介导的 m6A 依赖性机制实现的。RIP-qPCR揭示在Eca109细胞中，抑制METTL3可影响YTHDF1和c-Myc mRNA的直接相互作用，表明METTL3、YTHDF1和c-Myc mRNA之间存在密切联系（图5F）。敲除 YTHDF1 能显著降低 c-Myc 在 Eca109 细胞中的表达（图 5G）。这些结果表明，甲基化的c-Myc mRNA被YTHDF1识别，METTL3/YTHDF1增强其mRNA的稳定性。为了进一步确定Fn是否以依赖c-Myc的方式发挥致癌功能，在ESCC细胞中进行c-Myc功能缺失试验。在 Eca109 和 Kyse150 细胞中沉默 c-Myc ，Fn 处理的 ESCC 细胞中上调的 c-Myc 蛋白水平明显降低（图 5H）。细胞生长通过 CCK-8 和集落形成试验进行评估。不出所料，c-Myc 基因敲除抑制受 Fn 感染的 Eca109 和 Kyse150 细胞的增殖（图 5I-J）。细胞迁移通过划痕伤口愈合和 Transwell 试验进行评估。沉默 c-Myc 能明显逆转 Fn 诱导的细胞迁移能力的增强（图 5K-L），突出 c-Myc 在维持 Fn 介导的功能方面的重要作用。这些发现表明，Fn感染可上调METTL3/c-Myc轴，从而促进ESCC细胞的增殖和迁移；这些结果证实c-Myc是METTL3介导的m6A修饰在ESCC中的功能靶点。![]()
图5.
C-myc是METTL3介导的m6A修饰的下游靶标，随后与YTHDF1结合增强c-Myc的表达
6.F.nucleatum通过METTL3介导的体内c-Myc mRNA m6A修饰加速ESCC肿瘤发生和转移
通过皮下注射Eca109细胞、sh-METTL3 Eca109细胞和oe-METTL3 Eca109细胞建立人食管鳞癌裸鼠移植瘤模型，验证METTL3在体内肿瘤生长中的潜在作用。图6A提供实验的示意图。24天后，手术切除肿瘤(图6B)。Fn感染增加了肿瘤生长，而在Eca109细胞中敲低METTL3明显抑制Fn诱导的肿瘤生长(图6C-D)。此外，从大体图像和肺HE染色分析获得的数据表明，Fn给药后转移灶的数量显著增加。然而，在Eca109细胞中敲低METTL3可显著抑制Fn诱导的肺转移(图6E-G)。此外，使用免疫组化染色和western blot分析来评估METTL3和c-Myc蛋白水平(图6H-I)。此外，通过qPCR分析，与Eca109 -肿瘤对照组织相比，oe-METTL3 Eca109 -肿瘤组织中Fn-DNA的丰度较高，而sh-METTL3肿瘤组织中Fn-DNA的丰度较低(图6J)。结果表明，Fn感染和METTL3过表达增加了c-Myc的表达，而METTL3敲低抑制c-Myc的表达。综上所述，这些结果表明METTL3是食管鳞癌生长和转移的重要基因，增加肿瘤组织中Fn的丰度。Fn通过上调c-Myc的表达促进食管鳞癌的侵袭和转移。![]()
图6.
Fn 通过上调 METTL3 促进ESCC 的增殖和转移
结论
综上所述，本研究表明，Fn侵入肿瘤细胞可促进METTL3的表达，有利于胞内细菌和宿主细胞的生存和增殖。瘤内 Fn 介导的 METTL3 上调通过增加 ESCC 中 MYC 的 m6A 水平大大增强其致癌功能。根除Fn感染可能是治疗ESCC的一种有前途的策略。参考文献
Guo S, Chen F, Li L, Dou S, Li Q, Huang Y, Li
Z, Liu W, Zhang G. Intracellular Fusobacterium nucleatum infection increases
METTL3-mediated m6A methylation to promote the metastasis of esophageal
squamous cell carcinoma. J Adv Res. 2024 Jul;61:165-178. doi:
10.1016/j.jare.2023.08.014. Epub 2023 Aug 22. PMID: 37619934; PMCID:
PMC11258656.![]()
常规分子实验：RNA 提取和qRT-PCR，免疫荧光，WB，MeRIP-seq，RNA 稳定性检测，免疫组化
细胞实验：菌株培养，细胞培养，建立稳定的细胞系，siRNA转染，细胞内存活试验，克隆形成，Transwell
动物模型及病理分析：人食管鳞癌裸鼠移植瘤模型
![]()
谢谢！
课题设计与申报|分子生物学实验|细胞功能|机制调控|多组学检测分析
