星形胶质细胞糖噬障碍加重缺血性中风的再灌注损伤

学术 2024-10-23 18:01 湖北

糖噬已经从一种替代的糖原降解途径演变为调节外周组织细胞代谢止血的多方面枢纽。然而，脑内糖噬的模式及其对缺血性卒中的潜在治疗作用仍不清楚。在这里，作者观察到在缺血性卒中患者和小鼠中，再灌注期间GABA A型受体相关蛋白样1 (GABARAPL1)的下调导致星形胶质细胞糖噬功能障碍。PI3K-Akt通路激活参与脑再灌注时GABARAPL1表达下调的过程。此外，糖噬功能障碍诱导的氨基葡萄糖缺乏通过降低GABARAPL1的转录因子特异性蛋白1和TATA结合蛋白的O-GlcNAcylation水平，从而抑制GABARAPL1在星形胶质细胞再灌注过程中的核转位，反馈抑制GABARAPL1。通过过表达GABARAPL1恢复星形胶质细胞的糖噬降低再灌注期间星形胶质细胞的DNA损伤和氧化损伤，并改善周围神经元的存活。此外，脑再灌注后急性期的低热量饮食可增强星形胶质细胞的糖噬流，加速神经功能恢复。总之，脑内糖噬将自噬、代谢和表观遗传学联系在一起，糖噬功能障碍会加重缺血性卒中后的再灌注损伤。该研究于2024年6月发表在《Redox Biology》，IF：10.7。

技术路线：

主要研究结果：

1. 脑再灌注期间 GABARAPL1 下调导致星形胶质细胞糖吞噬功能障碍

首先在小鼠MCAO/R模型中测定半暗带区域的糖代谢通量。通过电子显微镜，发现糖噬相关空泡的数量，包括糖噬体和糖噬体-溶酶体融合空泡，在mcao /R后6小时开始减少，在12小时达到最低，并保持稳定至少48小时(图1A)。然后，检测溶酶体中的糖原水平，以反映半暗带区溶酶体介导的糖原降解通量，并观察到溶酶体中的糖原水平在MCAO /R后12小时达到最低水平(图1B)。随着糖噬流的减少，脑糖原累积并在MCAO 后12小时达到最高水平(图1C)。接下来，采用体外OGD/R模型进一步证实星形胶质细胞在I/R中的糖代谢功能障碍。通过电子显微镜观察到OGD /R处理后星形胶质细胞糖噬相关空泡的数量减少(图1D)。此外，培养的星形胶质细胞在OGD /R处理后，溶酶体中的糖原水平降低(图1E)。培养的星形胶质细胞在OGD /R处理后糖原水平增加(图1F)。

之前的研究表明，含淀粉结合域蛋白 1（STBD1）通过与 GABARAPL1 结合引导糖原颗粒转运到糖吞噬小体，糖吞噬小体与溶酶体结合利用 GAA 分解糖原。随后进行了免疫荧光分析，观察到 STBD1 和 GAA 的表达保持不变，而 GABARAPL1 则大幅下调，并在 MCAO/R 后 12 h 达到最低水平（图 1G-I）。我们还使用 MACS 从半影中分选星形胶质细胞（以 ACSA-2标记），发现星形胶质细胞的 GAA 活性在 MCAO/R 后保持不变（图 1J）。在 OGD/R 模型中，免疫印迹（图 1K-M）显示 GABARAPL1 的表达也有所下降，并在 OGD/R 处理后 12 小时达到最低水平，而 STBD1 和 GAA 的表达则未受影响。GAA 活性在 OGD/R 处理后也没有变化（图 1N）。

获得10 名缺血性脑卒中患者的脑组织，这些患者在发病后 6 小时内接受了溶栓治疗，溶栓与死亡之间的时间间隔约为 12 小时。使用电子显微镜观察到，缺血性脑卒中患者脑再灌注后约 12 小时，半影区内糖原相关空泡数量减少（图 2A）。此外，脑卒中患者脑再灌注后约 12 小时，半影区溶酶体中的糖原水平也有所下降（图 2B）。在糖吞噬减少的同时，脑卒中患者半影区的糖原水平上调（图 2C）。脑卒中患者脑再灌注后约 12 小时，GABARAPL1 的表达下降，STBD1 和 GAA 的表达没有变化（图 2D-F）。此外，中风患者半影区的星形胶质细胞 GAA 活性也没有变化（图 2G）。

图1. 在MCAO/R 和 OGD/R 期间,由于GABARAPL1 的下调，星形胶质细胞的糖吞噬功能受阻。

图2.在脑缺血再灌注过程中，由于 GABARAPL1 的下调，人脑半影区的星形胶质细胞糖吞噬功能受阻。

2. 星形胶质细胞 PI3K-Akt 通路激活参与驱动脑再灌注过程中 GABARAPL1 的下调

目前，GABARAPL1在小鼠星形胶质细胞中的确切转录因子仍不清楚。因此，进行反向ChiP-MS来研究GABARAPL1启动子与其TF之间的结合相互作用，并在培养的小鼠星形胶质细胞中发现103个GABARAPL1相关TFs(图3A)。其中55个TFs在OGD/R处理后保持不变，19个TFs上调，29个TFs下调(图3A)。为揭示OGD/R后GABARAPL1下调的上游通路，进行RNA测序，以检测培养的星形胶质细胞中KEGG通路的变化。在上调的KEGG通路中，被激活的PI3K-Akt通路的基因比例最高(图3B)。因此聚焦于PI3K-Akt通路，并进行免疫印迹分析，以确认在培养的星形胶质细胞中，OGD/R处理后均上调的磷酸化PI3K/PI3K和磷酸化Akt/Akt的比值(图3C和D)。结合反向ChiP-MS的结果(图3A)和GenomeNet (https://www.genome.jp/)中的PI3K-Akt KEGG通路图，只有乳腺癌1蛋白(BRCA1)，叉头框O1 (FoxO1)，维甲酸X受体α (RXRA)，cAMP反应元件结合蛋白1 (CREB1)和Myc原癌基因蛋白(c-MYC)同时作为GABARAPL1的转录因子和PI3K-Akt通路的关键下游节点。因此们进行反向ChiP免疫印迹，并观察到在OGD/R处理后，BRCA1与GABARAPL1启动子的结合增强(图3E)。对于FoxO1, CREB1和c-MYC, OGD/R处理后，联合降低，RXRA保持不变(图3F-I)。PI3K抑制剂LY294002 (LY)可以影响GABARAPL1启动子与BRCA1、FoxO1、RXRA、CREB1和c-MYC的相互作用(图3E-I)，阻断OGD/R处理后GABARAPL1的减少(图3J)，这表明在脑I/R中，BRCA1、FoxO1、RXRA、CREB1和c-MYC是PI3K- akt激活介导的GABARAPL1下调的下游节点。

在 MCAO/R 后的半影区星形胶质细胞中，磷酸化 PI3K 的水平升高，而 PI3K 的水平没有变化（图 3K 和 L）。MCAO/R 后星形胶质细胞中磷酸化 Akt 的水平升高，但 Akt 的水平没有变化（图 3M 和 N）。

图3.星形胶质细胞 PI3K-Akt 通路激活参与驱动脑再灌注过程中GABARAPL1 的下调

3. 糖吞噬功能障碍导致的葡萄糖胺水平下降加剧脑再灌注过程中星形胶质细胞中 GABARAPL1 的下调

目前的知识表明，星形胶质细胞的糖吞噬作用将糖原分解为葡萄糖。推测星形胶质细胞的糖噬作用可能将脑糖原降解为葡萄糖和葡萄糖胺。为了证实这一假设，用细胞外引导的信号肽取代GAA酶的溶酶体引导的信号肽，从而使用真核表达系统将重新合成的GAA (rGAA)与细胞内的GAA分离(图4A)。我们用rGAA消化星形胶质细胞中的溶酶体糖原。与煮沸RGAA处理的星形胶质细胞相比， RGAA处理的星形胶质细胞的葡萄糖和氨基葡萄糖水平均上调(图4A)。糖噬衍生的葡萄糖与葡萄糖胺的比值约为3∶1(图4A)。因此，脑糖噬可以同时将糖原降解为葡萄糖和氨基葡萄糖。检测OGD /R后星形胶质细胞蛋白的O-GlcNAcylation酰化水平，并选择GABARAPL1相关TF的O-GlcNAcylation水平进行进一步分析(图4B)。其中，10个TF的氨基酸序列中含有O-GlcNAcylation位点，其中6个TF的O-GlcNAcylation基化水平在ogd /R处理后显著降低(图4B)。结合反向ChiP-MS的结果(图3A)，在OGD/R处理后，只有SP1和TBP表现出O-GlcNAcylation和GABARAPL1相关结合条件的变化。

电子显微镜检查观察到随着GABARAPL1过表达，糖噬相关空泡的数量增加(图4C)。当GAA在OGD /R处理后被敲低时，这种作用被阻断(图4C)。此外，培养的Ve-GA星形胶质细胞经ogd /R处理后，星形胶质细胞溶酶体中的糖原水平也增加，而培养的Ve-GA+sh-GAA星形胶质细胞经OGD /R处理后，溶酶体中的糖原水平降低(图4D)。因此，GABARAPL1过表达后星形胶质细胞内糖原的积累减少，当OGD /R处理后GAA被抑制时，糖原的积累进一步增强(图4E)。GABARAPL1过表达增强氨基葡萄糖水平的降低(图4F)。当GAA在OGD /R治疗后进一步下调时，这种作用被阻断(图4F)。在培养的Ve-GA星形胶质细胞中，O-GlcNAcylation化的底物UDP-GlcNAc的水平也增加，而在培养的Ve-GA+sh-GAA星形胶质细胞中，OGD /R处理后UDP-GlcNAc的水平降低(图4G)。通过免疫共沉淀来拉低星形胶质细胞的SP1和TBP，观察到在OGD/R后，随着GABARAPL1的过表达，SP1和TBP的O-GlcNAcylation化水平增加，当GAA被敲低时，这一水平进一步降低(图4H和I)。在培养的Ve-GA星形胶质细胞中，两者在OGD/R处理后增强，在培养的Ve-GA+sh-GAA星形胶质细胞中降低(图4J和K)。伴随着O-GlcNAcylated SP1 和 TBP的改变，GABARAPL1过表达增加了SP1和TBP的核转位，这一作用被OGD/R处理后GAA敲低阻断(图4L和M)。随着GABARAPL1的过表达而增加，当GAA被敲低时进一步降低(图4N和O)。

在小鼠星形胶质细胞中，SP1 有 6 个 O-GlcNAcylated 氨基酸位点，TBP 有 2 个 O-GlcNAcylated 氨基酸位点（图 4B）。随后研究了哪个 O-GlcNAcylation 位点决定SP1 和 TBP 的核转运。使用 NLS Mapper 预测SP1 和 TBP 氨基酸序列中的核定位信号（NLS），发现 S613、S699 和 S703 定位在 SP1 的 NLS 中，而 S238 定位在 TBP 的 NLS 中（图 4P 和 Q）。此外，构建 SP1 氨基酸突变体培养星形胶质细胞（S493A、S613A、T641A、S642A、S699A 和 S703A）和 TBP 氨基酸突变体培养星形胶质细胞（T113A 和 S238A），分别将苏氨酸或丝氨酸变为丙氨酸。发现，SP1 S613A 突变体而非其他突变体显著影响了 SP1 的核转位（图 4P）。S238A 突变而非 T113A 突变决定TBP 的核转位（图 4Q）。为进一步确定 GABARAPL1 启动子与 SP1 和 TBP 之间的准确结合域，使用 JASPAR 数据库预测结合域。SP1 结合域可能位于两个区域（-2000 至 -448 和 -447 至 +40），TBP 结合域可能位于四个区域（-2000 至 -1504, -1503 至 -1179, -1178 至 -462 和 -461至 +40）。因此，将 GABARAPL1 启动子截断为 SP1 的两个片段和 TBP 的四个片段。根据双荧光素酶报告系统的测定，我们观察到 SP1 位于 -2000 至 -448 区域（图 4R）。基于这些发现，星形胶质细胞在脑缺血再灌注过程中存在一个正反馈环路来加重糖吞噬功能障碍。具体来说，星形胶质细胞的糖吞噬功能障碍会抑制糖原衍生的葡糖胺水平，从而通过O-GlcNAcylation抑制SP1和TBP的核转位，并反馈性地加剧GABARAPL1的下调。

图4. 糖吞噬功能障碍导致的葡萄糖胺水平下降加剧了脑再灌注过程中星形胶质细胞中GABARAPL1 的下调

4. 恢复星形胶质细胞的糖吞噬功能可改善缺血性中风后的再灌注损伤

通过构建他莫昔芬诱导的星形胶质细胞特异性 GABARAPL1 过表达转基因小鼠模型（KI-GA）来确定星形胶质细胞糖吞噬功能的恢复是否能改善脑再灌注损伤的体内结局。GABARAPL1-loxP 小鼠和 ALDH1L1-CreERT2 小鼠的七周大后代每天腹腔注射他莫昔芬（30 毫克/千克）一周，以条件性过表达 MCAO/R 后的星形胶质细胞 GABARAPL1（图 5A）。为证实糖吞噬恢复对脑I/R的特异性，在KI-GA转基因模型中通过向侧脑室和右纹状体注射带有靶向GAA基因的shRNA的AAV（KI-GA+KD-GAA），有条件地敲除星形胶质细胞GAA的表达。电子显微镜观察发现 KI-GA 转基因小鼠的糖吞噬通量增强，并在 MCAO/R 后被 GAA 敲除后进一步抑制（图 5B）。KI-GA转基因小鼠溶酶体中的糖原水平也被上调，并在MCAO/R后被GAA敲除进一步抑制（图5C）。此外发现KI-GA转基因小鼠的脑糖原水平降低，但在MCAO/R损伤后进一步阻断星形胶质细胞GAA后，脑糖原水平升高（图5D）。

随着星形胶质细胞嗜糖通量的增加，KI-GA 转基因小鼠的梗死体积也随之缩小（图 5E）。在 MCAO/R 后三天抑制星形胶质细胞 GAA 时，这种效应被阻断（图 5E）。为评估 KI-GA 和 KI-GA+KD-GAA 转基因小鼠的感觉运动功能，对其进行了神经行为测试，包括拐角测试、网格行走测试和去胶测试。随着星形胶质细胞 GABARAPL1 的过表达，小鼠的总步数增加，脚错步率下降，而当星形胶质细胞 GAA 被进一步抑制时，这一现象被阻断（图 5F）。MCAO/R后，KI-GA转基因小鼠在粘胶去除试验中的接触时间和去除时间减少，而KI-GA+KD-GAA转基因小鼠的接触时间和去除时间增加（图5G）。拐弯测试中右转的次数在 KI-GA 转基因小鼠中减少，而在 GAA 抑制后增加（图 5H）。此外，我们推测星形胶质细胞 GABARAPL1 过表达诱导的神经行为恢复可能与神经元突触再生有关。使用高尔基染色法分析半影区的神经元突触结构，发现 KI-GA 转基因小鼠的树突棘数量和突触分支数量增加，但在 MCAO/R 后 14 天 GAA 敲除后则减少（图 5I）。

图5. 恢复星形胶质细胞的糖吞噬功能可改善缺血性中风后的再灌注损伤

5. 糖噬恢复可减轻脑再灌注时星形胶质细胞的氧化损伤和DNA损伤

星形胶质细胞中的葡萄糖水平随着 GABARAPL1 的过表达而增加，在 OGD/R 处理后 GAA 下调时进一步降低（图 6A）。然后，对培养的星形胶质细胞进行了中心碳代谢的代谢组学分析，包括糖酵解、PPP 和 TCA 循环。经 OGD/R 处理后，培养的 Ve-GA 星形胶质细胞中 PPP 的代谢物水平升高，但糖酵解或 TCA 循环中的代谢物水平并未升高，而培养的 Ve-GA+sh-GAA 星形胶质细胞中的代谢物水平进一步降低（图 6B）。此外发现 13C 标记的葡萄糖进入 PPP 的比例高于进入糖酵解或 TCA 循环的比例（图 6C）。13C 标记的代谢物，包括核酮糖-5-磷酸、6-磷酸葡萄糖酸内酯、核糖-5-磷酸、6-磷酸葡萄糖酸和木酮糖-5-磷酸在 PPP 中的水平随着 GABARAPL1 的过表达而增加，当 GAA 在 GOGD/R 处理后被进一步敲除时，其水平进一步降低（图 6C）。

经 OGD/R 处理后，培养的 Ve-GA 星形胶质细胞中 G6P 增加，而培养的 Ve-GA+sh-GAA 星形胶质细胞中 G6P 减少（图 6D）。随着 GABARAPL1 的过表达，NADPH 和 GSH 的水平升高，有助于对抗培养的星形胶质细胞中的氧化应激损伤，当 GAA 被进一步阻断时，这种损伤被阻断（图 6E-G）。此外，PPP 是产生核糖-5-磷酸等分子以修复 DNA 损伤的重要途径。OGD/R 处理后，培养的 Ve-GA 星形胶质细胞中由核糖-5-磷酸衍生的 PRPP 水平升高，而培养的 Ve-GA+sh-GAA 星形胶质细胞中 PRPP 水平降低（图 6H）。使用彗星试验检测 DNA 损伤，观察到培养的 Ve-GA 星形胶质细胞在 OGD/R 处理后 DNA 损伤减轻，而培养的 Ve-GA+sh-GAA 星形胶质细胞在 OGD/R 处理后 DNA 损伤进一步加重（图 6I）。相应地，培养的 Ve-GA 星形胶质细胞的损伤（通过 LDH 释放反映）随着 GABARAPL1 的过表达而减少，并随着 GAA 的敲除在 OGD/R 处理后进一步增加（图 6J）。

图6.糖噬恢复可减轻脑再灌注时星形胶质细胞的氧化损伤和DNA损伤

6.在脑再灌注过程中，通过星形胶质细胞与神经元之间 GSH 和氨基葡萄糖的相互作用，恢复星形胶质细胞的糖吞噬功能可加速邻近神经元的恢复

使用星形胶质细胞-神经元共培养系统（图 7A），发现在 OGD/R 处理后，与 Ve-GA 星形胶质细胞共培养的神经元存活率增加，而与 Ve-GA+sh-GAA 星形胶质细胞共培养的神经元存活率降低（图 7B）。检测到三种代谢终产物，包括 GSH、PRPP 和葡萄糖胺，它们的含量随着 I/R 期间星形胶质细胞糖吞噬功能的恢复而增加。正如之前的研究报告所述，星形胶质细胞和神经元之间会发生多种代谢相互作用，但哪种相互作用对星形胶质细胞糖吞噬功能恢复介导的对周围神经元的保护产生主要影响仍不确定。首先关注星形胶质细胞与神经元之间的 GSH 相互作用，其中星形胶质细胞可通过星形胶质细胞膜 γ-GT [32]向周围神经元提供 GSH。随后检测共培养培养基和共培养神经元中的 GSH 水平，观察到 OGD/R 处理后，GSH 水平随星形胶质细胞 GABARAPL1 的过表达而升高，随星形胶质细胞 GAA 的敲除而进一步降低（图 7C 和 D）。在 OGD/R 后与 Ve-GA 星形胶质细胞共培养时，神经元 NADPH 水平升高，ROS 水平降低，而与 Ve-GA+sh-GAA 星形胶质细胞共培养时，这些效应被进一步阻断（图 7E 和 F）。接着，检测神经元的 PRPP 水平，发现它并没有随着星形胶质细胞 GABARAPL1 的过表达或 GAA 后的敲除而发生变化（图 7G），这表明星形胶质细胞来源的 PRPP 无法转运到周围的神经元中。除了 GSH 和 PRPP 外，星形胶质细胞 GABARAPL1 过表达后，共培养培养基中的葡萄糖胺水平也会增加，但星形胶质细胞 GAA 敲除后，GOGD/R 处理后的葡萄糖胺水平会进一步降低（图 7H）。与 Ve-GA 星形胶质细胞共培养后，神经元葡萄糖胺水平也增，而与 Ve-GA+sh-GAA 星形胶质细胞共培养后，神经元葡萄糖胺水平降低了（图 7I）。然后，采用免疫细胞化学分析神经元突触结构。与 Ve-GA 星形胶质细胞共培养后，神经元突触分支数量增加，而与 Ve-GA+sh-GAA 星形胶质细胞共培养后，神经元突触分支数量减少（图 7J）。

为进一步确定星形胶质细胞衍生的 GSH 和葡萄糖胺对神经元的不同影响，敲除 Ve-GA 星形胶质细胞中的γ-GT，以有条件地抑制星形胶质细胞与神经元 GSH 的相互作用（图 S7）。我们观察到，Ve-GA 星形胶质细胞中γ-GT 基因敲除后，神经元活力部分降低，但与 OGD 处理的星形胶质细胞相比，神经元活力仍有所提高（图 7K）。此外，当进一步敲除星形胶质细胞中的γ-GT时，周围神经元中星形胶质细胞 GABARAPL1 过表达诱导的抗氧化作用被阻断（图 7L-N）。然而，当进一步敲除星形胶质细胞 γ-GT 时，星形胶质细胞 GABARAPL1 过表达诱导的神经元突触再生不受影响（图 7O）。基于以上证据，在脑再灌注后星形胶质细胞糖吞噬恢复过程中，星形胶质细胞衍生的 GSH 主要增强神经元的抗氧化能力，星形胶质细胞衍生的葡萄糖胺主要促进神经元突触再生。

图7.在脑再灌注过程中，通过星形胶质细胞与神经元之间GSH 和氨基葡萄糖的相互作用，恢复星形胶质细胞的糖吞噬功能可加速邻近神经元的恢复

7. 低热量饮食可增强星形胶质细胞的糖吞噬功能，并对缺血性中风后的再灌注损伤具有神经保护作用

于是作者推测，脑再灌注急性期的能量补给应从低水平开始，逐渐转变为正常状态，这可能会改善缺血性脑卒中患者的预后。为了验证这一假设，将再灌注培养基改为低葡萄糖（2.5 mM），观察到低葡萄糖处理后培养的星形胶质细胞中与糖吞噬相关的空泡数量增加，而这种效应在GAA 敲除后被阻断（图 8A）。此外，在低糖处理的培养星形胶质细胞中，溶酶体中的糖原水平增加，而在GAA 敲除后，OGD/R 处理进一步降低溶酶体中的糖原水平（图8B）。低糖处理减轻对培养的星形胶质细胞的损伤，而GAA 敲除则进一步加剧损伤（图 8C）。此外，当再灌注培养基变为低糖时，共培养神经元的存活率提高，而这一效应在GAGD/R 处理后被 GAA 敲除后被阻断（图8D）。

接下来，在第一周给小鼠喂食低热量饮食，并在MCAO/R 后的第二周改为正常饮食（图 8E）。低热量饮食增加MCAO/R后星形胶质细胞糖吞噬相关空泡的数量，而抑制星形胶质细胞GAA 后空泡数量进一步减少（图 8F）。此外，低热量饮食会增加溶酶体中的糖原水平，而在MCAO/R 后抑制星形胶质细胞 GAA 会降低溶酶体中的糖原水平（图8G）。低热量饮食处理的小鼠梗死体积减小，在MCAO/R 后三天，星形胶质细胞 GAA 被敲除后，梗死体积进一步增大（图8H）。低热量饮食处理小鼠的神经行为变化，如网格行走试验、去除粘合剂试验和拐角试验等，均有所缓解，而这些影响在MCAO/R后被星形胶质细胞GAA敲除后被进一步阻断（图8I-K）。此外，低热量饮食处理的小鼠的树突棘数量和突触分支比正常饮食的小鼠增加，并且在MCAO/R后14天抑制星形胶质细胞GAA后进一步减少（图8L）。

图8. 低热量饮食可增强星形胶质细胞的糖吞噬功能，并对缺血性中风后的再灌注损伤具有神经保护作用

结论

综上所述，本研究揭示了星形胶质细胞在I/R期间的糖吞噬功能障碍，而恢复糖吞噬功能是治疗缺血性脑卒中再灌注损伤的新靶点。此外，还提出了一个以脑糖吞噬为导向的反馈环，这加深了我们对脑糖吞噬的理解，并建立了自噬、代谢和表观遗传学之间的直接联系。

参考文献

Guo H, Li Y, Wang S, Yang Y, Xu T, Zhao J, Wang J, Zuo W, Wang P, Zhao G, Wang H, Hou W, Dong H, Cai Y. Dysfunction of astrocytic glycophagy exacerbates reperfusion injury in ischemic stroke. Redox Biol. 2024 Aug;74:103234. doi: 10.1016/j.redox.2024.103234. Epub 2024 Jun 7. PMID: 38861834; PMCID: PMC11215420.

组学实验：代谢组学分析

常规分子实验：免疫印迹，RT-qPCR，电子显微镜分析，代谢物分析，总细胞中的糖原水平，溶酶体中的糖原水平，酶活性分析，免疫沉淀，O-GlcNAcylation 分析，彗星试验，RNA-seq，

细胞实验：细胞培养，磁激活细胞分拣（MACS），三苯基氯化四氮唑（TTC）染色，高尔基染色，提取核蛋白质和细胞质蛋白质，细胞存活分析，慢病毒感染

动物模型及病理分析：小鼠 I/R 模型构建，神经行为分析，

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