新陈代谢改变和基因组不稳定是癌细胞的两个标志。癌细胞会改变其营养吸收和利用，以满足其维持细胞存活的需求。放疗和大多数化疗药物的主要目的是直接或间接导致DNA 损伤，导致细胞死亡。癌细胞必须快速修复受损的 DNA 以确保细胞存活。积累的代谢物，如 2-羟基戊二酸、富马酸盐和琥珀酸盐，抑制DNA 修复并促进基因组不稳定性。然而，人们对促进 DNA 修复的代谢物知之甚少。Warburg 效应是癌症的一个标志，指的是癌细胞倾向于厌氧代谢葡萄糖，而不是有氧代谢葡萄糖。这导致厌氧糖酵解的最终产物乳酸在癌细胞中大量积累。然而，癌症代谢如何影响化疗反应和DNA修复通常仍不完全清楚。因此，揭示可以促进肿瘤存活的新陈代谢驱动的 DNA 修复机制至关重要，因为这些机制可能会突出新的癌症脆弱性。该研究于2024年5月发表于《Nature》，影响因子50.5。
为了研究DNA损伤反应的代谢特征，对接受铂类新辅助化疗（NAC）的患者术后胃癌标本进行了蛋白质组学和非靶向代谢组学分析。乳酸脱氢酶（LDHA）是催化丙酮酸转化为乳酸的糖酵解酶，是耐药性肿瘤中上调最多的蛋白质之一。非靶向代谢组学鉴定了327种代谢物，乳酸是耐药肿瘤中最丰富的代谢物之一。蛋白质组学和代谢组学联合分析表明，厌氧糖酵解途径在耐药肿瘤中被激活。与顺铂敏感的亲本细胞相比，顺铂耐药细胞表现出细胞外酸化率（ECAR）和乳酸产生显著增加。在携带异种移植物的NSG小鼠和来自两例胃癌的患者来源的异种移植物（PDX）的小鼠中，单独使用乳酸对肿瘤生长没有影响。然而，乳酸给药降低了顺铂抑制肿瘤的疗效，并缩短了小鼠的存活时间。乳酸还促进了对放疗电离辐射（IR）的抵抗力。值得注意的是，当肿瘤细胞中的乳酸摄取转运蛋白 MCT1 耗尽时，乳酸不会促进顺铂耐药。
DNA损伤剂诱导双链断裂（DSB），导致组蛋白 H2AX 在 DSB 位点丝氨酸 139 位点（称为γH2AX）磷酸化迅速增加。与对照组相比，乳酸导致 γH2AX水平显着增加。彗星测定显示，在 IR 处理后6 小时，乳酸处理细胞的尾矩明显短于对照细胞的尾矩。两个主要的DSB 修复途径是 同源重组（HR） 和非同源末端连接。为了确定这两种途径中的哪一条可能受乳酸调节，我们使用了HeLa DR-GFP 和 HeLa EJ5-GFP 报告基因测定，发现乳酸显着提高了 HR 修复效率，但仅略微提高了NHEJ 修复效率。这些结果表明，乳酸主要参与HR介导的 DNA 修复。
乳酸使蛋白质的赖氨酸乳酸化。接下来，探讨了乳酸是否通过乳酸化促进对DNA 损伤剂的抵抗。化疗耐药胃癌组织和耐药癌细胞系中乳酸化赖氨酸 （Kla） 的整体水平显着升高。紫外激光微照射诱导亚核体积的DSB，赖氨酸乳酸化蛋白被募集到DSB 位点。为了获得 DNA 修复相关乳酸化的全局视图，使用4D无标记蛋白质组学分析来探索AGS-P和 AGS-R细胞中的赖氨酸乳酸化底物。在1603种蛋白质中鉴定了4028个赖氨酸乳酰化位点。我们发现543个蛋白质上的909个赖氨酸乳酸化位点显著上调。随后，基于STRING数据库分析了上调赖氨酸乳酰化底物中的 DNA 修复相互作用网络。在这些DNA 修复相关蛋白中，NBS1 因其在感应和修复 DNA 损伤中的关键作用而受到强调。至关重要的是，当NBS1 在 AGS-P 细胞中耗尽时，乳酸不会促进顺铂耐药。因此，我们专注于NBS1 乳酸化。
为了进一步确认NBS1的乳酰化。用抗 NBS1 免疫沉淀癌细胞的总细胞提取物，然后使用pan-Kla抗体进行免疫印迹。NBS1 乳酰化在顺铂耐药细胞中增加，乳酸和顺铂给药均诱导NBS乳酸化。液相色谱-质谱（LC-MS/MS）显示 NBS1 的 K338 是乳酰化的。对AGS-P细胞的基因组进行引物编辑，用精氨酸替换NBS1 赖氨酸 338。NBS1蛋白即使在乳酸或顺铂刺激下也不能在AGS-NBS（K388R）细胞中被乳酸化。最后，生成了特异性识别NBS1 K388乳酸化的特异性抗体（抗NBS1-K388la）。向培养基中添加乳酸后 NBS1 K388 乳酸化增加，与亲本细胞相比，顺铂耐药癌细胞的乳酸化也增加。
接下来，研究了NBS1 K388乳酸化在对DNA损伤治疗反应中的作用。与AGS-P 细胞相比，AGS-NBS1（K388R） 细胞在顺铂或 IR 处理后细胞活力降低和细胞凋亡增加。此外，乳酸不能促进AGS-NBS1（K388R）细胞中的顺铂或IR 抵抗，表明乳酸诱导的顺铂或 IR 抵抗取决于 NBS1 K388 乳酸化。此外，LDHA过表达增加了 AGS-P 细胞对顺铂的耐药性，但对AGS-NBS1 （K388R）细胞的顺铂存活没有额外影响。
进一步研究NBS1乳酸化在DNA损伤反应中的潜在作用。与IR或顺铂处理后的AGS-P细胞相比，AGS-NBS1（K388R）细胞中γH2AX 的水平较低。彗星试验显示，IR 处理后7 h AGS-P 细胞的尾矩明显短于AGS-NBS1（K388R）细胞，尽管 IR 处理后 0.5 h 差异不大。NBS1 负责激活 HR 修复。野生型 NBS1 的过表达显著提高了HR修复效率，而 NBS1（K388R）的过表达对HR修复效率没有明显影响。与 AGS-P 细胞相比，IR处理后 AGS-NBS1 （K388R） 细胞中 BRCA1 和 RAD51 复合物的形成显着减少。
NBS1 与 MRE11 和 RAD50 形成三聚体 MRN 复合物。MRN 复合物在感应 DSB 和激活 DNA 修复途径中起关键作用。研究了NBS1乳酰化是否影响 MRN 复合物的形成。免疫共沉淀测定显示，顺铂处理后，AGS-NBS1（K388R） 细胞中 MRE11-RAD50 和NBS1 之间的相互作用强烈减少。为了研究 NBS1 K388 乳酰化在 HR 修复中发挥重要作用的分子机制，使用了交联质谱（CLMS）鉴定了 NBS1 和 MRE11 之间的几个交联位点，包括位于 NBS1 的MRE11 结合结构域区域和 MRE11 的 NBS1 结合结构域区域的氨基酸残基。然而，在AGS-NBS1 （K388R）细胞中未观察到 NBS1 和 MRE11 之间的这些交联位点。具体来说，NBS1 K388 是这些交联位点之一，表明它位于相互作用界面上。乳酸促进AGS-P 细胞中 MRE11-RAD50 和 NBS1 之间的相互作用，但在AGS-NBS1（K388R）细胞中不促进 MRE11-RAD50 和NBS1 之间的相互作用。当存在乳酰辅酶 A 且 NBS1 被乳酰化时，乳酰化的NBS1 与 MRE11 形成直接相互作用。然而，在没有乳酰辅酶A 的情况下，NBS1 不与 MRE11 相互作用。
TIP60 过表达促进了 MRE11–RAD50 和 NBS1 之间的相互作用（。已知 TIP60 通过乙酰化ATM 来刺激 ATM 激酶活性。敲除ATM 或施用 ATM 抑制剂（KU-55933） 减少了 TIP60 诱导的 NBS1 K388乳酸化以及 MRE11-RAD50 与NBS1 之间的相互作用。此外，AGS-P 细胞和 AGS-NBS1（K388R） 细胞提取物的蔗糖梯度分析表明，大多数MRE11-RAD50 在 AGS-P 细胞中与NBS1 共沉淀，而含有 MRE11-RAD50 和 NBS1 的组分在 AGS-NBS1（K388R） 细胞中几乎完全互斥。
与野生型细胞相比，AGS-NBS1 （K388R） 细胞顺铂处理后染色质组分中 MRE11、RAD50和 NBS1 的富集显著降低。IR 处理后，AGS-NBS1（K388R） 细胞中 MRE11、RAD50 和 NBS1 病灶阳性细胞的比例均显著降低。我们还监测了 MRE11 和RAD50 响应 AGS-P 和 AGS-NBS1 （K388R） 细胞中激光诱导的 DNA 损伤的定位动力学。在 AGS-NBS1 （K388R） 细胞中，eGFP-MRE11和 eGFP-RAD50 募集到 DSB 位点的时间延迟。此外，NBS1（K388R） 被募集到 DSB 位点的速度比野生型 NBS1 慢得多。此外，乳酸加速了野生型NBS1 向 DSB 位点的募集，但对NBS1（K388R）没有这种影响。总体而言，这些数据表明 NBS1 乳酰化促进MRN 复合物的形成和 HR 蛋白向 DSB 位点的募集。
基于上述发现，我们推测抑制乳酸代谢会破坏 DNA 修复。LDHA 主要催化丙酮酸还原为乳酸。MCT1负责将乳酸从肿瘤微环境运输到肿瘤细胞中。我们观察到，在顺铂耐药细胞中，LDHA 和 NBS1 K388 乳酰化的量增加，但MCT1 的量没有增加。CRISPR 介导的 LDHA 敲除减少了乳酸的产生和NBS1 K388 乳酸化。草酸钠和斯替戊醇是不同的 LDHA 抑制剂。草酸钠和斯替戊醇均显著降低乳酸产生和 NBS1 K388 乳酸化。彗星试验显示，LDHA 敲除导致AGS-P 细胞中的 DNA 修复缺陷，但在 AGS-NBS1（K388R） 细胞中则没有。这些发现表明LDHA 抑制抑制 NBS1 K388 乳酸化并破坏 DNA 修复。
Stiripentol 是LDHA抑制剂。stiripentol 和顺铂的组合在PDO4 和 PDO5 中具有高度协同作用。在携带MGC803-R 异种移植物或化疗耐药胃癌 PDX （PDX-R） 的 NSG 小鼠中，Stiripentol和顺铂或 IR 联合治疗也引起了显着的肿瘤消退。Stiripentol和顺铂或 IR 联合治疗耐受性良好。此外，Stiripentol和顺铂或 IR 联合使用延长了携带PDX-R 的 NSG 小鼠的生存期。
我们进一步研究了 LDHA 和 NBS1 K388 乳酰化的临床相关性。根据基因表达谱交互式分析（GEPIA） 数据库，LDHA 表达在胰腺癌、胃癌、肺癌和卵巢癌中显著上调。接下来，收集了94 份通过 NAC 前胃癌患者活检获得的肿瘤标本。所有入组患者均接受铂类NAC，并根据他们对后续 NAC 的反应分为 NAC 耐药和 NAC 敏感类别。IHC 显示，在 NAC 耐药肿瘤中，LDHA 和 NBS1 K388 乳酰化的量增加。LDHA 与 NBS1 K388 乳酰化呈正相关。NBS1 K388 乳酸化和LDHA 水平高的患者总生存率远低于 NBS1 K388 乳酸化和 LDHA 水平低的患者。在 94 名入组患者中，有 55 名个体提供了成对的治疗前和治疗后肿瘤组织。在NAC 敏感或 NAC 耐药肿瘤患者中，NAC后 LDHA 和 NBS1 K388 乳酰化水平升高。总之，这些结果表明 LDHA 表达和NBS1 K388 乳酰化与临床对 NAC 的耐药性相关。
Chen H, Li Y, Li H, Chen X, Fu H, Mao D, Chen W, Lan L, Wang C, Hu K, Li J, Zhu C, Evans I, Cheung E, Lu D, He Y, Behrens A, Yin D, Zhang C. NBS1 lactylation is required for efficient DNA repair and chemotherapy resistance. Nature. 2024 Jul;631(8021):663-669.
