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代谢功能障碍相关性脂肪性肝病（MASLD）的药物治疗尚未满足临床需求。肝细胞死亡是这种高发慢性肝病的标志，但细胞死亡的主要类型仍不确定。在这里，我们报告了铁催化的细胞死亡调节模式（ferroptosis）是导致 MASLD 的原因之一。活检证实的 MASLD 患者队列中的无监督聚类显示，一个亚组具有肝脏铁变态反应特征和较低的谷胱甘肽过氧化物酶 4 (GPX4) 水平。同样，在公共转录组学数据集中也发现了一个铁变态反应防御能力降低的亚组。为期四周的胆碱缺乏L-氨基酸定义的高脂饮食（CDAHFD）诱导了小鼠的MASLD和铁变态反应。Gpx4过表达并不影响脂肪性肝炎，相反，CDAHFD可防止肝细胞特异性Gpx4敲除导致的发病。铁突变抑制剂 UAMC-3203 可减轻 CDAHFD 和第二种模型（即高脂高果糖饮食（HFHFD））中的脂肪变性和丙氨酸氨基转移酶。在人类 HepG2 细胞中评估了补充单不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸对铁中毒易感性的影响。富含脂肪的 HepG2 细胞显示铁变态反应防御能力下降，带有两个多不饱和脂肪酸（PUFA）脂尾的磷脂酰甘油增加，铁变态反应敏感性持续。总之，本研究发现肝脏铁变态反应是 MASLD 患者的一个有害因素。意想不到的是，向肝细胞补充非 PUFA 会改变脂质双分子层的组成，从而维持对铁变态反应的敏感性。根据体内模型的研究结果，抑制铁变态反应是治疗 MASLD 的一个很有前景的靶点。本文于2024年8月发表于《cell death &
differentiation》，IF: 13.7。研究技术路线：
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主要研究结果：
1. MASL 和 MASH 患者中的一个亚群显示出肝铁质沉着病的特征基于MASLD存在铁中毒的假设，我们研究了是否能在一组活检证实的MASLD患者和对照组（n = 76）的血清中检测到这种坏死细胞死亡的特征。与对照组相比，MASLD 患者中男性比例更高，HOMA-IR、谷丙转氨酶、谷草转氨酶更高，高密度脂蛋白胆固醇更低。与对照组相比，MASLD 患者的血清总 CK-18 片段和树突酶裂解的 CK-18 均有所增加。15例（28.3%）MASLD患者的总CK-18水平升高，所有这些患者（除一例患者外）的树突酶裂解CK-18水平也都升高。因此，在根据血清 CK-18 显示肝细胞死亡证据的 MASLD 患者中，有一定比例的患者显示出裂解的 CK-18，这可能表明发生了细胞凋亡。由于对照组和MASLD患者的血清MDA（铁变态反应分解产物）相似（图S1B），我们研究了是否能从该组患者（n = 27）的肝活检组织中发现铁变态反应的特征。在一些MASLD患者中，无论是孤立性脂肪变性（MASL）还是伴有或不伴有明显纤维化的MASH（图1A），终末脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口标记（TUNEL）阳性病灶（细胞死亡的一般指标）的数量都有所增加。几名 MASL 和 MASH F0-1 患者的肝细胞之间出现了强烈的 4HNE 阳性聚集，有时与炎症浸润相邻，而对照组患者则没有这种聚集。这些铁蛋白分解产物灶与某些患者肝细胞胞浆中的颗粒状 4HNE 阳性脂褐素不同（图 1B）。接下来，免疫组化（IHC）检测了铁跃迁防御 GPX4 和酰基-CoA 合成酶长链家族成员 4（ACSL4），它们可以通过使 PUFA 酯化进入细胞膜来促进铁跃迁。为了量化这两个表位在细胞核和细胞质中的存在情况，我们利用机器学习技术对每位患者的针刺肝活检组织中约 10,000 个肝细胞进行了重建。与对照组相比，MASLD 患者中 GPX4 阳性细胞核的比例有所增加（图 1C）。在不同的组织学组别中，ACSL4 的细胞核或细胞质水平没有发现明显差异（图 1D）。对非血红素亚铁的染色显示，在一些 MASLD 患者中，这种铁变态反应催化剂呈窦状沉积，而在对照组中却没有发现。根据对铁变态相关标记物的评估，无监督聚类确定了三个群组。聚类 "1"（绿色）由既无细胞死亡也无铁变性的 MASLD 患者组成，表现为 TUNEL 阳性和 4HNE 沉积较低，没有亚铁，同时核 GPX4 较高。在 "2 "群组（红色）中，铁突变防御 GPX4 降低，细胞死亡、4HNE 沉积和铁含量最高。群组 "3"（灰色）包括对照组和一些 MASLD 患者，他们的所有标记物水平都很低。ACSL4的表达在各组间没有差异（图1E）。因此，群组 "2 "具有肝铁蛋白沉积症的特征，并有降低高密度脂蛋白胆固醇、提高谷丙转氨酶和总 CK-18 水平的趋势。群组 "2 "包括40-60%的MASL和MASH患者，无论有无明显纤维化。这意味着该群组中高达 50%的 MASLD 患者具有 "铁蛋白沉积特征"。![]()
Figure 1 MASLD 患者肝铁蛋白沉积症的特征
2. 公开的转录组学数据集证实，所有组织学严重程度等级的MASLD患者的铁蛋白防御功能都有所下降为了在更大的患者队列中探索肝活检标本中铁蛋白沉积特征的有效性，我们访问了三个公开的转录组学数据集，研究了 30个铁蛋白沉积相关基因的表达。为便于解释，我们将这些基因分为以下几组： "铁氧化防御"（包括 GPX4、FSP1 和 GCH1）、"GSH"（GPX4 利用谷胱甘肽的产生）、"PUFA"（促进铁氧化的膜中 PUFA 结合增加）和 "铁"（催化铁氧化的亚铁增加）。通过基因组变异分析（GSVA），每名患者都得到了四个基因组的得分，GSVA得分越高，表明该基因组中所有基因的表达量越高。在数据集 GSE130970（n = 78）中，组织学组间的 GSVA 分数没有差异，但通过高斯混合建模，根据这些分数发现了三个潜在亚组。第一个群组（灰色）包括对照组和 MASLD 患者，他们的 PUFA 结合率低，铁蛋白防御能力中等。第三个聚类（绿色）显示的基因表达与更多的 PUFA 结合到膜中但同时也上调了铁蛋白沉积防御功能相匹配，而第二个聚类（红色）包括铁蛋白沉积敏感性 PUFA 结合与铁蛋白沉积防御功能降低的 MASLD 患者（图 2A）。同样，在数据集 GSE135251（n = 206）和 GSE126848（n = 57）中，无监督机器学习发现了一个 "红色 "集群，其中 PUFA 结合基因表达增加，理论上对铁变态反应敏感，同时铁变态反应防御基因表达降低。这个具有铁变态反应易感性特征的亚群与灰色和绿色群组不同，灰色和绿色群组没有铁变态反应易感性或铁变态反应防御基因表达增加（图 2B、C）。因此，341 名 MASLD 患者的三个转录组数据集揭示了一个具有铁变态反应易感性特征的亚群（高达 30% 的患者），再次强调了患者的异质性和患者分层的必要性。![]()
Figure 2 公共转录组学数据集揭示了具有肝铁蛋白血症易感性特征的 MASLD 患者亚群
3. 过表达 Gpx4 对 MASH 小鼠模型没有影响为了阐明铁蛋白沉积在 MASLD 中的作用，我们试图在肝铁蛋白沉积的小鼠 MASH 模型中调节这种细胞死亡。胆碱缺乏性 L- 氨基酸定义的高脂饮食（CDAHFD）会在 1 周后诱导 MASH 的组织学特征，4 周后诱导明显的肝纤维化，并伴随 ALT 水平的升高，这已在之前发表过。与标准饮食（SD）相比，CDAHFD 在 4 周和 6 周后肝 MDA 增加。CDAHFD 4 周后肝脏 MDA 的增加在第二个独立实验中得到证实，我们重点研究了这一时间点（图 3A）。CDAHFD 4 周后，TUNEL 阳性病灶（细胞死亡的一般指标）的数量增加；由于没有出现裂解的 caspase-3，这种细胞死亡不是细胞凋亡（图 3B）。IHC 上 4HNE 的分布发生了改变，因为 CDAHFD 时，该表位出现在肝小叶的所有区域，而 SD 时，该表位仍局限于中央周围区域。在整张肝脏切片图像中，对重建肝小叶内每相对距离的 4HNE 阳性区域进行量化，证实了这一点。同样，与 SD 相比，CDAHFD 中区和肝门周围区域的 Gpx4 阳性增加（图 3D）。然而，CDAHFD 4 周后，Gpx4 的肝 mRNA 表达或肝总蛋白水平没有差异，Fsp1 和 Gch1 的肝 mRNA 表达也没有差异（图 3E、F）。鉴于服用 CDAHFD 4 周后肝脏 MDA 增加，我们尝试通过同时表达鼠和人 Gpx4 基因的嵌合小鼠（Gpx4Tg/+）过表达生理性铁变态反应防御 Gpx4 来抑制铁变态反应。Western 印迹证实，喂食 CDAHFD 或 SD 4 周的 Gpx4Tg/+ 动物的肝脏 Gpx4 蛋白条带增加，而其对照同窝动物（Gpx4）则没有增加（图 4A）。肝脏 MDA 在 CDAHFD 中增加，而 Gpx4+/+Tg/+ 则减少了这一生物标志物（图 4B）。Gpx4利用的还原型谷胱甘肽（GSH）在CDAHFD中增加，但不受Gpx4Tg/+的影响（图4C）。此外，过表达 Gpx4 对 CDAHFD 引起的血清 ALT 和 AST、肝肿大或组织学异常没有影响。因此，Gpx4的过表达降低了肝脏MDA水平，但肝损伤或组织学状况并未得到改善。![]()
Figure 3 检测 CDAHFD 中的铁变态反应标记物
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Figure 4 过表达 Gpx4 没有影响，而 CDAHFD 诱导的 MASH 可防止肝细胞 Gpx4 的缺失
4. CDAHFD 可防止条件性肝细胞特异性 Gpx4 缺乏引起的死亡作为一种反向策略，我们通过他莫昔芬诱导的肝细胞特异性 Gpx4 缺乏，探索了在 CDAHFD 诱导的 MASH 中消耗 Gpx4 的效果。肝细胞 Gpx4 的缺失与生命不相容。事实上，Gpx4fl/fl AlbCreERT2Tg/+在SD上表现出临床恶化，在首次注射他莫昔芬后的第7-12天就必须牺牲。这与在注射他莫昔芬前喂食 CDAHFD 4 周的 Gpx4fl/fl AlbCreERT2Tg/+ 小鼠不同，除了一只小鼠外，其他小鼠直到 8 周后实验终止时才出现发病现象。没有使用 Cre 重组酶的对照组（Gpx4fl/fl AlbCreERT2）在使用他莫昔芬后也没有发病（图 4D、E）。在临床恶化期间或饮食 8 周后收集的肝组织证实，Gpx4+/+fl/fl AlbCreERT2Tg/+的肝 Gpx4 mRNA 减少，肝 Gpx4 蛋白带缺失（图 4F）。在 SD 中，肝细胞 Gpx4 的缺失会导致广泛的肝细胞坏死并伴有核褪色，但不包括肝周区和中度炎症浸润。然而，在喂食 CDAHFD 的 Gpx4fl/fl AlbCreERT2Tg/+ 动物肝脏中，肝细胞 Gpx4 的缺失不会导致任何改变（饮食诱导的 MASH 除外）（图 4G）。饲喂 SD 的 Gpx4fl/fl AlbCreERT2Tg/+ 动物的肝脏明显肿大。此外，Gpx4fl/fl AlbCreERT2Tg/+ 的血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）也显著升高（图 4H）。总之，CDAHFD 似乎能防止肝脏 Gpx4 缺失引起的铁变态反应和急性肝损伤。我们试图通过质谱法研究其他铁蛋白防御功能来进一步解释这一观察结果。在 SD 条件下失去肝细胞 Gpx4 后，我们观察到肝脏维生素 E、GSH/GSSG 比率、BH4/BH2 比率以及 NADH/NAD 比率下降，这可能是由于它们在肝脏铁变态反应过程中被氧化所致（图 4I）。在 SD 条件下，肝脏中检测不到抗铁蛋白生成的泛醌和维生素 K，但在 Gpx4 消耗后，FSP1 的 mRNA 表达下降。在 CDAHFD 条件下，Gpx4fl/fl AlbCreERT2Tg/+ 抗铁锈色素防御机制的下降得到恢复（图 4I）。图 S15E 显示了单个代谢物的相对丰度。因此，代谢应激下的 MASH 肝脏显示出可塑性，以维护其他铁蛋白沉积防御功能，从而防止 Gpx4 丢失后的自发性铁蛋白沉积。5. 在两种 MASLD 小鼠模型中，抑制铁蛋白沉积可防止肝细胞损伤和大泡性脂肪变性鉴于合成的亲脂自由基捕获剂在防止过度脂质过氧化方面比 Gpx4 过表达更有效，我们探索了在 CDAHFD 中使用 UAMC-3203 进行药理铁变态反应抑制的可能性。药代动力学研究显示，该化合物在栓剂给药后以及通过渗透性微型泵在肝脏的分布非常好。首先，在喂食 CDAHFD 或 SD（预防性设置）的动物中，每天腹腔注射一次 UAMC-3203 或 0.9% NaCl（载体），连续注射 4 周。CDAHFD 增加了肝脏 MDA、ALT/AST 和肝脏质量，而 UAMC-3203 降低了这些指标。然而，每天静注 UAMC-3203 并不影响 MASH 的组织学异常。鉴于 UAMC-3203 在小鼠体内的半衰期不理想（T1/2 = 3-4 小时），在治疗环境中，通过渗透性微型泵给喂食 CDAHFD 或 SD 的小鼠注射 UAMC-3203 或载体，持续 4 周（图 5A）。与预防性治疗类似，与药物相比，UAMC-3203 可降低 CDAHFD 动物体内增加的 MDA 和 ALT/AST（图 5B，C）。尽管 UAMC-3203 对 CDAHFD 的肝脏肿大没有影响，但治疗性 UAMC-3203 能减轻脂肪变性，但不能减轻肝小叶炎症、气球或纤维化（图 5D-G）。虽然CDAHFD诱导的MASH具有高疾病活动性和纤维化，让人联想到人类的MASH，但这种饮食的小鼠缺乏代谢综合征的大多数特征。因此，我们在第二种模型--高脂高果糖饮食（HFHFD）模型--中探索了抑制铁蛋白沉积的方法，该模型会导致肥胖和糖耐量降低的 MASH。我们在喂食 HFHFD 20-24 周的小鼠体内检测到较高水平的铁氧化分解产物 MDA，但未检测到 4HNE。在喂食 HFHFD 或 SD 24 周的小鼠中，通过顺序渗透微型泵给药 UAMC-3203 或药物治疗 4 周（图 6A）。与药物相比，UAMC-3203 可诱导 HFHFD 小鼠体重减轻（约 20%），但在 SD 小鼠中没有诱导体重减轻，并且可减轻性腺脂肪组织质量。在对治疗前糖耐量和体重下降进行调整后，UAMC-3203 治疗组的治疗后糖耐量得到改善（图 6B）。在方差分析中，抑制铁蛋白沉积可减轻高脂血症组的谷丙转氨酶和总胆固醇，但不能减轻谷草转氨酶（AST），这与对体重的影响无关（图 6C）。组织学检查显示，使用 UAMC-3203 治疗的高脂血症患者脂肪变性明显减轻，但小叶炎症、气球或纤维化并未减轻（图 6D-F）。抑制铁蛋白沉积也会影响血糖、高密度脂蛋白胆固醇和游离脂肪酸，但不会影响低密度脂蛋白胆固醇或甘油三酯（图 S18A-I）。总之，铁蛋白沉积靶向作用可防止 HFHFD 诱导的肝损伤和脂肪变性，而不依赖于其对总体重的影响。![]()
Figure 5 治疗性铁蛋白沉积抑制可减轻 CDAHFD 的肝细胞损伤和脂肪变性
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Figure 6 治疗性铁蛋白沉积抑制可减轻高氟高胆固醇血症患者的脂肪变性和代谢综合征特征
6. 在 HepG2 细胞中补充 SFA/MUFA 可促进 PG-PUFA2 水平的升高，与补充 PUFA 相似，这可能是铁中毒易感性持续存在的原因我们试图解释 MASH 中铁细胞凋亡倾向增加的原因。众所周知，补充单不饱和脂肪酸（MUFA）可降低铁蛋白沉积敏感性，而多不饱和脂肪酸（PUFA）则会促进这种细胞死亡。因此，我们研究了暴露在 MASH 环境（高葡萄糖、胰岛素、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β和转化生长因子-β）中的肝细胞对不同种类脂肪酸（即油酸（OA 18:1，MUFA）和棕榈酸（PA 16:0，SFA）、花生四烯酸（AA 20:4，ω-6 PUFA）或二十二碳六烯酸（DHA 22:6，ω-3 PUFA）。将细胞暴露在含有 OA/PA 的 MASH 环境中 48 小时后，HepG2 细胞中的细胞内脂滴积聚会增加，但 AA 或 DHA 不会增加（图 7A，B）。AA 和 DHA 都对 GPX4 抑制剂 ML162 诱导的铁突变敏感（图 7C）。出乎意料的是，添加了 OA/PA 的 HepG2 细胞对铁中毒的敏感性并没有降低，相反，细胞死亡敏感性（图 7C）和脂质 ROS 都略有增加（图 7D）。
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Figure 7 在 HepG2 中补充油酸和棕榈酸会增加PG-PUFA2，从而导致对铁变态反应的敏感性
结论：
总之，我们利用机器学习在 MASLD 患者亚群（20-50% 的受试者）中观察到了肝脏铁蛋白沉积的特征。在体内抑制铁蛋白沉积显示，这种细胞死亡是肝细胞损伤和脂肪变性的驱动因素，而 MASLD 肝脏采用了多余的铁蛋白沉积防御机制。考虑到对患者进行分层的潜在需要，抑制铁蛋白沉积对 MASLD 的治疗潜力值得进一步研究。参考文献：
Peleman, C., Hellemans, S., Veeckmans, G. et al.
Ferroptosis is a targetable detrimental factor in metabolic
dysfunction-associated steatotic liver disease. Cell Death Differ (2024).
https://doi.org/10.1038/s41418-024-01348-9.![]()
生信分析：无监督聚类， mRNA 测序分析
组学实验：MASLD组织学分析，维生素E的靶向代谢组学研究，非靶向脂质组学研究
常规分子实验：酶联免疫吸附法，免疫组织化学
细胞实验：人肝活检 IHC 定量，实时定量 PCR，Western 印迹分析
动物模型及病理分析：小鼠血清肝脏测试和脂质参数量化，基于肝细胞的人肝活检 IHC 定量，小鼠 IHC 的纵向量化
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谢谢！
课题设计与申报|分子生物学实验|细胞功能|机制调控|多组学检测分析
