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目前眼部血管生成的治疗主要集中在阻断血管内皮生长因子（VEGF）的活性上，但不良副作用和疗效不佳仍是问题。仍然需要确定抗血管生成治疗的新靶点。作者使用内皮细胞、链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病模型、激光诱导的脉络膜新生血管模型和氧气诱导的视网膜病变模型研究tsRNA-1599在眼部血管生成中的作用。进行CCK-8测定、EdU测定、transwell测定和基质凝胶测定，以评估tsRNA-1599在内皮细胞中的作用。进行视网膜消化试验、Isolectin B4（IB4）染色和脉络膜发芽试验，以评估tsRNA-1599在眼部血管生成中的作用。转录组学分析、代谢分析、RNA下拉分析和质谱用于阐明tsRNA-1599介导的血管生成作用的机制。在实验性眼部血管生成模型和内皮细胞中，tsRNA-1599的表达在血管生成应激的反应中上调。沉默tsRNA-1599在体外抑制内皮细胞的血管生成作用，在体内抑制病理性眼部血管生成。从机制上讲，tsRNA-1599对VEGF信号传导几乎没有影响，但可以通过与YBX1相互作用调节HK2基因的表达，导致内皮细胞糖酵解和NAD+/NADH的产生减少，从而影响内皮效应。通过tRNA衍生的小RNA靶向内皮细胞的糖酵解重编程，代表一种可用于眼部新生血管疾病的治疗方法。该研究于2024年6月发表在《Theranostics》，IF 12.4分。技术路线：
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主要研究结果：
1 tsRNA-1599是实验性新生血管形成的潜在调节因子
为鉴定和表征参与实验性新生血管形成的tRNA衍生小RNA（tsRNAs），作者提交四对CNV小鼠和正常小鼠的RPE脉络膜巩膜复合物进行小RNA测序。根据P值<0.05和log2倍数变化≥2，在CNV组和非CNV组之间鉴定出18种差异表达的tsRNA，其中CNV组有15种上调的tsRNA和3种下调的tsRNA。火山图用于显示CNV组和非CNV组之间差异表达的tsRNA（图1A）。然后，使用条形图显示从15到35个核苷酸的tsRNAs的读取长度分布（图1B-C）。由于一种类型的tsRNA可以通过切割成具有相同序列的片段从不同的tRNA中产生，堆叠图显示了CNV组和非CNV组中按位点和长度排序的每种tsRNA的百分比（图1D-E）。显示了不同类型tsRNAs的百分比（图1F）。为验证小RNA测序数据的结果，作者收集RPE脉络膜巩膜复合物，并检测差异表达的tsRNA的表达模式。有趣的是，在CNV组中检测到tsRNA-1599表达的最大上调（图1G）。众所周知，缺氧是眼部新生血管形成的关键驱动因素。HUVEC与CoCl2一起孵育24小时以模拟缺氧条件。缺氧应激导致检测到的tsRNAs显著增加（图1H）。值得注意的是，在缺氧组中检测到tsRNA-1599表达的最大上调。![]()
图1：tsRNA-1599是实验性新生血管形成的潜在调节因子
2 tsRNA-1599在体外和体内实验性新生血管中的表达显著上调
tsRNA-1599是一种i-tRF，起源于成熟tRNA Tyr GTA的3’一半，长度为20个核苷酸。使用qRT-PCR评估tsRNA-1599在核和细胞质部分的表达。研究结果表明，细胞核中tsRNA-1599的表达占主导地位（图2A）。FISH检测还证实，tsRNA-1599主要在HUVEC的细胞核中表达（图2B）。激光诱导CNV是一种重要的实验模型，可以重建wAMD的血管特征。qRT-PCR检测显示，激光光凝后第3天、第5天、第7天和第14天，RPE/脉络膜复合物中tsRNA-1599的表达水平显著上调（图2C）。氧诱导视网膜病变模型是一种广泛用于研究视网膜缺血驱动的新生血管（NV）的模型。新生C57BL/6J小鼠从P7到P12暴露于75%的氧气中，然后恢复到常氧状态5天，以触发缺氧诱导的血管增殖。qRT-PCR检测显示，OIR视网膜中tsRNA-1599的表达水平显著上调（图2D）。糖尿病视网膜病变被认为是糖尿病的微血管并发症。连续5天对8周龄的C57BL/6J小鼠施用STZ，以建立糖尿病小鼠模型。在糖尿病诱导后4个月提取视网膜组织。与非糖尿病对照组相比，糖尿病视网膜中tsRNA-1599的表达水平显著上调（图2E）。此外，发现tsRNA-1599的表达水平在HUVEC中上调，以应对高糖应激和氧化应激。为揭示tsRNA-1599与新生血管疾病的临床相关性，作者收集nAMD、DR和年龄相关性白内障（ARC）患者的房水（AH）样本。qRT-PCR检测显示，tsRNA-1599的水平明显高于ARC患者（图2F）。总的来说，这些结果表明，tsRNA-1599的表达在体外和体内的新生血管中显著上调。![]()
图2：tsRNA-1599在体外和体内实验性新生血管形成中的表达显着上调
3 tsRNA-1599在体外调节内皮血管生成作用
为确定tsRNA-1599在体外内皮血管生成作用中的作用，作者将tsRNA-1559模拟物和抑制剂转染到HUVEC或HRVEC中来调节tsRNA-1598的表达水平。qRT-PCR检测显示，转染tsRNA-1599模拟物明显提高tsRNA-1559的表达水平（图3A）。作者首先通过CCK-8检测确定tsRNA-1599在调节内皮细胞活力中的作用。与对照组相比，CoCl2或高糖处理导致内皮细胞存活率降低。转染tsRNA-1599模拟物可以逆转CoCl2或高糖诱导的细胞存活率降低。相比之下，转染tsRNA-1599抑制剂可以进一步降低细胞存活率，在抑制细胞存活率方面显示出与阿柏西普相似的效果（图3B）。作者进一步研究tsRNA-1599在细胞凋亡中的作用。钙黄绿素AM/PI染色显示，在CoCl2或高糖处理后，PI阳性细胞的百分比明显增加。转染tsRNA-1599模拟物导致凋亡减少，如PI阳性细胞数量减少所示。相比之下，转染tsRNA-1599抑制剂会加重细胞凋亡，在增加细胞凋亡方面显示出与阿柏西普相似的效果（图3C）。此外，作者通过检测内皮细胞增殖、迁移和管形成能力，确定tsRNA-1599在内皮血管生成作用中的作用。与对照组相比，转染tsRNA-1599模拟物导致细胞增殖增加，而转染tsRNA-1559抑制剂导致细胞增殖显著减少（图3D）。Transwell检测显示，tsRNA-1599模拟转染组的迁移细胞数量明显多于对照组，而转染tsRNA-1598抑制剂明显降低内皮细胞的迁移能力（图3E）。进行基质凝胶测定以确定tsRNA-1599在管形成中的作用。在tsRNA-1599模拟转染组中检测到管形成能力的明显增加，而转染tsRNA-1559抑制剂导致管形成能力显著降低（图3F）。值得注意的是，tsRNA-1599抑制剂在内皮细胞中显示出与阿柏西普相似的抗血管生成作用。总的来说，上述结果表明，tsRNA-1599已成为体外内皮血管生成作用的关键调节因子。由于tsRNA-1599在体外内皮血管生成作用中的关键作用，作者随后确定tsRNA-1598在体内眼部血管生成中的作用。作者首先使用可以模拟眼部血管生成特征的OIR模型，并研究tsRNA-1599在视网膜血管生成中的作用。与对照组相比， tsRNA-1599 antagomir注射组小鼠的无血管区域和新生血管簇（NVT）区域明显减少（图4A-C），而注射tsRNA-1559 agomir显示出对视网膜血管生成的促血管生成作用。然后使用STZ诱导的糖尿病模型来确定tsRNA-1599在视网膜血管功能障碍中的作用。胰蛋白酶消化试验显示，注射tsRNA-1599 antagomir可以改善糖尿病小鼠的毛细血管变性，如无细胞毛细血管数量减少所示（图4D-E），而tsRNA-1559过表达可以增加无细胞毛细血管的数量。值得注意的是，tsRNA-1599 antagomir在眼部血管生成方面表现出与阿柏西普相当的抗血管生成作用。 CNV模型还用于确定tsRNA-1599在激光损伤后第14天在眼部血管生成中的作用。qRT-PCR检测显示，注射tsRNA-1599 agomir显著增加脉络膜/RPE组织中tsRNA-1559的水平，而tsRNA-1598 antagomir降低tsRNA-1597的水平。CNV病变的定量分析显示，注射tsRNA-1599 antagomir可使CNV病变面积减少约50%，显示出与阿柏西普相似的抗血管生成作用。相比之下，注射tsRNA-1599 agomir导致CNV病变增加约60%。脉络膜发芽的离体模型是研究脉络膜新生血管的重要模型。作者使用脉络膜发芽模型来研究tsRNA-1599在血管生成中的作用。在脉络膜/RPE接种后的第4天、第5天和第6天检测到迁移细胞占据的血管生成区域。与对照组相比，转染tsRNA-1599 antagomir沉默tsRNA-1598后，脉络膜外植体的发芽面积减少，但转染tsRNA-1559 agomir后发芽面积增加。此外，tsRNA-1599 antagomir在抑制脉络膜发芽方面与阿柏西普具有相似的抗血管生成作用。这些结果共同表明，tsRNA-1599沉默在实验性血管生成中起着抗血管生成作用。![]()
图3：tsRNA-1599在体外调节内皮血管生成作用
4 tsRNA-1599沉默在实验性血管生成中起着抗血管生成作用
由于tsRNA-1599在体外内皮血管生成作用中的关键作用，作者随后确定tsRNA-1598在体内眼部血管生成中的作用。作者首先使用可以模拟眼部血管生成特征的OIR模型，并研究tsRNA-1599在视网膜血管生成中的作用。与对照组相比，tsRNA-1599 antagomir注射组小鼠的无血管区域和新生血管簇（NVT）区域明显减少（图4A-C），而tsRNA-1559 agomir注射显示出对视网膜血管生成的促血管生成作用。然后使用STZ诱导的糖尿病模型来确定tsRNA-1599在视网膜血管功能障碍中的作用。胰蛋白酶消化试验显示，注射tsRNA-1599 antagomir可以改善糖尿病小鼠的毛细血管变性，如无细胞毛细血管数量减少所示（图4D-E），而tsRNA-1559过表达可以增加无细胞毛细血管的数量。值得注意的是，tsRNA-1599 antagomir在眼部血管生成方面表现出与阿柏西普相当的抗血管生成作用。 CNV模型还用于确定tsRNA-1599在激光损伤后第14天在眼部血管生成中的作用。qRT-PCR检测显示，注射tsRNA-1599 agomir显著增加脉络膜/RPE组织中tsRNA-1559的水平，而tsRNA-1598 antagomir降低tsRNA-1597的水平。CNV病变的定量分析显示，注射tsRNA-1599 antagomir可使CNV病变面积减少约50%，显示出与阿柏西普相似的抗血管生成作用。相比之下，注射tsRNA-1599 agomir导致CNV病变增加约60%。脉络膜发芽的离体模型是研究脉络膜新生血管的重要模型。作者使用脉络膜发芽模型来研究tsRNA-1599在血管生成中的作用。在脉络膜/RPE接种后的第4天、第5天和第6天检测到迁移细胞占据的血管生成区域。与对照组相比，转染tsRNA-1599 antagomir沉默tsRNA-1598后，脉络膜外植体的发芽面积减少，但转染tsRNA-1559 agomir后发芽面积增加。此外，tsRNA-1599 antagomir在抑制脉络膜发芽方面与阿柏西普具有相似的抗血管生成作用。这些结果共同表明，tsRNA-1599沉默在实验性血管生成中起着抗血管生成作用。![]()
图4：tsRNA-1599沉默在实验性血管生成中起抗血管生成作用
5 tsRNA-1599递送在体内没有明显的视网膜毒性
上述结果表明，tsRNA-1599是眼部新生血管形成的关键调节因子。接下来，作者确定tsRNA-1599表达的改变是否对视网膜中现有的血管、RGC和感光细胞产生不利影响。在注射后第7天，与PBS组相比，注射tsRNA-1599 agomir和antagomir没有破坏现有的血管（图5A-B）。作者通过给成年小鼠注射tsRNA-1599agomir和antagomir14天和28天来扩展这些发现。结果表明，长期注射tsRNA-1599agomir和antagomir对现有的成熟血管没有明显的不利影响。随后，作者进行免疫荧光染色，以确定tsRNA-1599递送对RGC存活和光感受器退化的影响，方法是注射tsRNA-1599 agomir和antagomir 7天、14天和28天。与PBS组相比，改变的tsRNA-1599水平对RGC存活和感光细胞退化没有明显的不利影响，如NeuN阳性RGC和视紫红质阳性感光细胞的荧光强度不变所示（图5C）。此外，还进行RBPMS染色以检测RGC存活率。结果表明，玻璃体内注射tsRNA-1599 agomir和antagomir对RGC存活率没有明显的不利影响（图5D）。TUNEL检测进一步证实，改变的tsRNA-1599水平不会导致视网膜组织中可检测到的凋亡（图5E）。总之，这些结果表明，注射tsRNA-1599 agomir和antagomir对预先存在的血管、RGC和光感受器没有明显的有害影响。![]()
图5：tsRNA1599的递送在体内没有明显的视网膜毒性
6 tsRNA-1599是VEGF信号传导的间接调节因子
先前的研究表明，VEGF是病理血管生成的关键驱动因素，抗VEGF药物是抗血管生成治疗的主要策略。因此，作者评估tsRNA-1599递送后VEGF信号传导是否受到影响。在VEGF存在的情况下处理HUVEC，然后转染tsRNA-1599模拟物和抑制剂。Western blot分析表明，转染tsRNA-1599模拟物和抑制剂对Y1175的VEGFR2磷酸化没有影响，并且确实改变了Akt、ERK和p38在VEGF刺激下的磷酸化水平（图6）。此外，作者还比较tsRNA-1599拮抗剂组和阿柏西普加tsRNA-1598拮抗剂组之间的效果，以研究tsRNA-1559的促血管生成特性在CNV、OIR和DR模型中是否真正独立于VEGF。发现tsRNA-1599 antagomir与阿柏西普的组合对体内眼部新生血管没有显示出相加作用。VEGF和tsRNA-1599之间对视网膜血管发育缺乏相加作用，这可能反映了tsRNA-1559和VEGF在内皮细胞中仍然存在共同的下游细胞事件，这些事件受到限制或严格调控。这些结果表明，转染tsRNA-1599 agomir和antagomir对VEGF诱导的VEGFR下游信号传导磷酸化事件没有影响，表明tsRNA-1559似乎是内皮细胞中VEGF信号传导的间接调节因子。![]()
图6：tsRNA-1599是内皮细胞中VEGF信号传导的间接调节因子
7 tsRNA-1599调节内皮细胞糖酵解平衡
为研究tsRNA-1599在内皮血管生成作用中的潜在机制，使用转染了tsRNA-1559抑制剂或阴性对照抑制剂24小时的HUVEC进行转录组学分析。与NC组相比，tsRNA-1599抑制剂转染组共鉴定出309个差异表达基因（Log2FC≥±1；P值≤0.05），包括149个上调基因和160个下调基因。进行基因集富集分析（GSEA）以寻找tsRNA-1599在内皮细胞中的潜在功能。tsRNA-1599沉默导致HUVEC中参与糖酵解和MYC_target信号传导的信号通路显著下调，戊糖磷酸途径明显上调。为了进一步确定tsRNA-1599表达变化后内皮代谢的变化，作者测量了细胞外酸化率（ECAR），一种糖酵解指标（图7A）。与NC抑制剂组相比，转染tsRNA-1599抑制剂导致ECAR显著降低，这表明抑制tsRNA-1559会降低糖酵解能力（图7B）。鉴于HUVEC中观察到的糖酵解通量减少，进行了一项实验，以确定转染tsRNA-1599抑制剂后葡萄糖摄取是否发生变化。转染tsRNA-1599抑制剂导致葡萄糖摄取减少，如转染tsRNA-1559抑制剂的HUVEC培养基中最高葡萄糖浓度所示（图7C）。NAD+/NADH氧化还原对是细胞能量代谢的调节因子，包括糖酵解和线粒体氧化磷酸化。转染tsRNA-1599抑制剂导致NAD+/NADH比值降低（图7D）。因此，转染tsRNA-1599抑制剂后，观察到丙酮酸在细胞内的积累显著增加（图7E）。添加tsRNA-1599 agomir导致脉络膜发芽面积显著增加。添加2-DG（2-脱氧葡萄糖，一种强效的糖酵解抑制剂）消除了tsRNA-1599 agomir对脉络膜发芽的促血管生成作用，表明糖酵解在眼部血管生成中起着重要作用（图7F）。总的来说，上述数据表明，施用tsRNA-1599抑制剂会导致丙酮酸积累和NAD+再生减少。![]()
图7：tsRNA-1599调节内皮细胞中的糖酵解平衡
8 tsRNA-1599通过与YBX1相互作用调节内皮血管生成作用
由于tsRNA-1599主要在HUVEC的细胞核中表达，作者推测tsRNA-1598在转录水平上发挥作用。为探索tsRNA-1599介导的内皮血管生成作用的潜在机制，通过HUVEC中的RNA下拉分析鉴定了tsRNA-1559的内源性结合蛋白。银染显示结合蛋白。与对照组相比，tsRNA-1599模拟转染组在~50 kDa处检测到更强的条带（图8A）。作者进一步通过质谱分析了结合蛋白。作者发现排名第一的Y-box结合蛋白1（YBX1）与血管新生和糖酵解密切相关。作为一种DNA和RNA结合蛋白，YBX1可能参与转录和转录后基因调控。通过使用抗YBX1抗体的蛋白质印迹验证了相互作用（图8B）。作者通过RIP-qPCR分析进一步验证tsRNA-1599和YBX1之间的相互作用，发现tsRNA-1598在YBX1的免疫沉淀物中高度富集，但在IgG中没有（图8C）。为验证tsRNA-1599和YBX1在体内的相互作用，使用抗YBX1抗体对RPE脉络膜巩膜复合物进行下拉和蛋白质印迹分析。结果显示，与Scr tsRNA组相比，YBX1在tsRNA-1599组中富集，表明tsRNA-1559可以在体内与YBX1蛋白结合（图8D）。此外，免疫染色和FISH检测验证了tsRNA-1599和YBX1蛋白在细胞核中的共定位（图8E）。随后，使用qRT-PCR检测和蛋白质印迹来检测tsRNA-1599是否调节YBX1的表达水平。tsRNA-1599不改变YBX1 mRNA的水平，但影响YBX1蛋白的水平。tsRNA-1599抑制剂转染之后YBX1蛋白表达水平显著下调。相比之下，tsRNA-1599过表达后，YBX1蛋白表达水平上调（图8F-G）。总的来说，这些数据表明tsRNA-1599通过与YBX1相互作用来调节内皮血管生成作用。![]()
图8：tsRNA-1599通过与YBX1相互作用来调节内皮血管生成作用
9 tsRNA-1599通过靶向HK2调节内皮细胞糖酵解代谢
由于tsRNA-1599是内皮糖酵解代谢的关键调节因子，因此作者从RNA测序结果中选择了四个糖酵解相关基因来验证它们的表达模式。qRT-PCR检测和蛋白质印迹显示，转染tsRNA-1599模拟物后，己糖激酶2（HK2）基因的表达显著上调，而沉默tsRNA-1598后，HK2的表达下调。然而，PFKFB3、ENO2和PKM2的表达水平没有改变（图9A-B）。作者选择HK2基因进行进一步研究，因为它在新生血管疾病的发生和进展中起着关键作用。随后，作者设计了三种不同的HK2 siRNA来降低其表达。EdU检测显示，转染tsRNA-1599模拟物导致细胞增殖增加。相比之下，转染HK2-siRNA逆转了tsRNA-1599过表达诱导的增殖增加。Transwell检测显示，与对照组相比，tsRNA-1599过表达增加了迁移细胞的数量，HK2敲除减少tsRNA-1598过表达引起的迁移增加。基质凝胶试验表明，当tsRNA-1599过表达时，管形成能力增强，HK2的下调中断了tsRNA-1598过表达诱导的管形成增加。总的来说，这些发现表明tsRNA-1599通过调节HK2来调节内皮血管生成过程。作者进一步研究tsRNA-1599是否通过YBX1调节HK2基因表达。利用开放存取数据库JASPAR，作者预测了YBX1和HK2之间的潜在结合位点，揭示了两个位点符合90%相对谱得分阈值的标准（图9C）。ChIP-qPCR检测显示，只有位点2可能成为结合位点（图9D）。为验证YBX1对HK2表达的影响，作者进行YBX1敲除实验，观察到HK2在mRNA和蛋白质水平上的下调（图9E-H）。为探索tsRNA-1599、YBX1和HK2之间的潜在调控关系，作者同时进行了YBX1敲除和tsRNA-1559过表达实验。结果表明，tsRNA-1599的过表达可以促进HK2的表达，而YBX1的敲除可以部分挽救这种对HK2表达的促进作用（图9I-J）。总的来说，这些结果表明，tsRNA-1599通过YBX1调节HK2基因的表达，从而影响内皮细胞的糖酵解代谢。![]()
图9：tsRNA-1599通过与YBX1相互作用调节HK2表达
结论：
tsRNA-1599被证明是眼部血管生成中的促血管生成因子。这一发现对抗血管生成治疗的进展具有重大意义。具体来说，作者发现一种新的病理血管生成调节因子，它似乎间接影响VEGF信号传导。尽管作者揭示tsRNA-1599的作用是内皮特异性的，但tsRNA-1559也可能在神经干细胞、室管膜细胞和光感受器等非血管性视网膜细胞中发挥重要作用。此外，tsRNA-1599通过与YBX1相互作用在眼部血管生成中发挥调节作用。作为一种DNA和RNA结合蛋白，YBX1可能参与转录和转录后基因调控。它可以参与调节许多基因的表达，并带来超越代谢重编程的广泛影响。未来，其操作安全应受到关注。此外，tsRNA-1599在神经营养作用中的作用仍有待进一步研究。参考文献：
Han XY, Kong LJ, Li D, Tong M, Li XM, Zhao C, Jiang Q, Yan B. Targeting
endothelial glycolytic reprogramming by tsRNA-1599 for ocular anti-angiogenesis
therapy. Theranostics. 2024 Jun 1;14(9):3509-3525. doi: 10.7150/thno.96946.
PMID: 38948065; PMCID: PMC11209708.![]()
组学实验：转录组学分析，代谢组学分析
常规分子实验：小RNA测序，qRT-PCR，RNA下拉，质谱，免疫荧光
细胞实验：CCK-8测定，EdU测定，transwell测定，IB4染色
动物模型及病理分析：新生血管（CNV）模型，氧诱导视网膜病变模型，链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病视网膜病变，基质凝胶测定，脉络膜发芽试验
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谢谢！
课题设计与申报|分子生物学实验|细胞功能|机制调控|多组学检测分析
