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心房心肌病（ACM）是指任何影响心房的结构、结构、收缩或电生理的复杂变化，并可能产生相关临床表现的疾病。糖尿病、高血压、高龄、心力衰竭可加重ACM。心房肌细胞的兴奋-收缩耦合和电传导需要大量三磷酸腺苷（ATP）的支持。大量研究证实，心房肌细胞线粒体能量生成障碍可导致心房重构，从而促进心律失常的发生，包括房颤。NR4A亚家族属于核受体家族，与NR4A1（也称为NUR77）、NR4A2（NURR1）、NR4A3（NOR1）等一起作为转录因子发挥作用，能够对生长因子、激素等多种刺激做出快速反应。NR4A1和NR4A2在心脏中的研究较为广泛，涵盖了心肌肥厚、心肌纤维化、心肌梗死、心脏线粒体功能和炎症等多个方面，且各研究的结果存在异质性。然而，NR4A3在心脏中的作用尚不清楚。该研究发表在《EBioMedicine》，IF：9.7。技术路线：
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主要研究结果：
1、NR4A3在房颤患者和二型糖尿病（T2DM）模型的心房组织中表达降低
作者对HFD STZ诱导的T2DM小鼠和WT小鼠的心房组织进行了RNA测序分析，发现糖尿病小鼠中NR4A亚家族（NR4A1，NR4A2，NR4A3）的表达显著降低（图1A）。然后作者检测了这三个基因在WT小鼠心房中的RNA水平，发现NR4A1在心房中的表达最高，其次是NR4A3，而NR4A2在心房中的表达最低。随后，作者比较了这三个基因在C57BL/6J小鼠心房和心室组织中的表达水平。NR4A家族在心房中的表达高于在心室中的表达，其中NR4A3表现出最显著的差异（图1B-D）。进一步证实，与SR患者相比，AF患者心房组织中NR4A3蛋白表达显著降低（图1E，F）。因此，本研究旨在探讨NR4A3在糖尿病心房重构中的作用。构建了两种T2DM模型（db/db模型和HFD STZ模型）。由于高脂饮食是包括非酒精性脂肪性肝病和肥胖在内的多种疾病模型的常用建模方法，作者进一步研究了经高脂饮食STZ治疗的T2DM小鼠的肝脏、WAT和胰岛的相关表型变化。接下来，作者通过免疫组化、qPCR和蛋白质印迹实验证实，NR4A3在mRNA和蛋白水平在T2DM模型中均显著降低（图1G-N）。![]()
图1 NR4A3在AF患者和糖尿病小鼠的心房组织中高表达并显著降低
2、NR4A3缺陷加重了HFD-STZ治疗小鼠的心房结构重构
作者构建了NR4A3全基因敲除（NR4A3-KO）小鼠。为了研究NR4A3对糖尿病心房重构的影响，作者将WT小鼠和NR4A3-KO小鼠分别给予正常饮食（ND）和高脂饮食联合链脲佐菌素（HFD STZ）16周。经过16周的HFD喂养和低剂量STZ处理后，NR4A3-KO小鼠的左心房重量/总体重比（LAW/TBW）显著高于WT组（图2A，E）。超声心动图也显示，在HFD
STZ处理下，NR4A3-KO小鼠的左心房面积与WT小鼠相比显著增加（图2B，F）。Masson染色证实，NR4A3缺乏加重了HFD STZ诱导的心房纤维化（图2C，G）。WGA染色显示，NR4A3-KO小鼠在HFD STZ处理下的心房心肌细胞横截面积比WT小鼠大（图2D，H）。然而，NR4A3-KO小鼠和WT小鼠在ND处理下的LAW/TBW、左心房面积、心房纤维化和心房心肌细胞横截面积没有显著差异（图2A-H）。NR4A3的缺失进一步增加了HFD STZ处理的T2DM小鼠心房组织中ANP、COL1A1和COL3A1的表达，表明心房肥大和心房纤维化加重（图2I-M）。总之，HFD STZ治疗导致C57BL/6J小鼠心房肥厚和心房纤维化，而NR4A3缺陷加重了糖尿病诱导的心房重构。![]()
图2 NR4A3缺乏加重T2DM引起的心房重构
3、NR4A3抑制糖尿病引起的心房结构重构
构建AAV9-cTNT-NR4A3和对照AAV9-cTNT-Ctrl病毒，分别经尾静脉注射db/m小鼠或8周龄db/db小鼠16周，以进一步明确NR4A3对糖尿病诱导的心房重构的影响。作者发现，与ctrl db/m小鼠相比，在db/m小鼠中过表达NR4A3并未对LAW/TBW比值、左心房面积、心房纤维化和心房心肌细胞横截面积产生任何显著改变（图3A-H）。相反，与携带AAV9-Ctrl的db/db小鼠相比，NR4A3在db/db小鼠中的上调显著降低了LAW/TBW比值，左心房面积，心房纤维化，心房心肌细胞的横截面积（图3A-H）。同时，蛋白质印迹分析验证了ANP，COL1A1和COL3A1的蛋白水平。在db/m小鼠中，过表达NR4A3对ANP、COL1A1、COL3A1无明显影响。然而，在db/db小鼠中，过表达NR4A3导致ANP、COL1A1和COL3A1的表达显著降低（图3I-M）。因此，作者的研究结果证实过表达NR4A3可以减轻db/db小鼠的心房纤维化和心肌细胞肥大。![]()
图3 心脏特异性过表达NR4A3可减轻糖尿病诱导的心房重构
4、心房NR4A3表达水平与糖尿病诱发房颤的易感性成反比
作者进一步评估了NR4A3对糖尿病小鼠电重构的影响。分离db/m和db/db小鼠的成年心房肌细胞，注射AAV9-NR4A3或AAV9-Ctrl，测定动作电位（Aps）。作者发现，与db/m小鼠相比，db/db小鼠的动作电位时程（APD）显著延长。值得注意的是，NR4A3在db/db小鼠中的过表达表现出缩短APD的趋势，尽管它没有达到统计学显著性（图4A，B）。在db/db小鼠中，NR4A3过表达后的APD没有显著的统计学差异，这表明NR4A3对离子通道的调节作用尚不清楚。在心内刺激实验中，NR4A3缺陷加重了高脂链霉链诱导小鼠的房颤诱发率（图4C，E），而房颤持续时间没有显著变化（图4C，F）。相反，db/db AAV9-NR4A3小鼠的房颤诱发率与db/db AAV9-Ctrl小鼠相比显著降低（图4D，G），而房颤持续时间没有显著变化(图4D，H)。NR4A3表达上调可降低糖尿病所致房颤的易感性。![]()
图4 心房NR4A3表达水平与糖尿病诱发的房颤的易感性成反比
5、NR4A3可减轻糖尿病引起的心房线粒体能量代谢障碍
为了阐明NR4A3参与调节糖尿病心房重构的具体机制，作者对注射AAV9-cTNT-Ctrl或AAV9-cTNT-NR4A3的db/db小鼠的心房样本进行了RNA测序分析。GO与KEGG功能富集分析表明，NR4A3调控的基因主要富集于各种类型的心肌病和代谢相关通路。值得注意的是，在富集的基因中，代谢通路的丰度最高，并且每个心肌病通路都包含了不同数量的代谢相关基因（图5A）。因此，作者假设能量代谢途径可能构成一个合理的机制。随后，作者对注射AAV9-cTNT-NR4A3或AAV9-cTNT-Ctrl的db/db小鼠的心房组织进行了非靶向代谢组学分析。通过KEGG功能富集分析，作者发现NR4A3调控的代谢物质在碳代谢、氧化代谢、柠檬酸循环、丙酮酸代谢等通路中富集（图5B）。基于RNA测序和代谢组学分析，作者假设NR4A3通过调节心房组织的能量代谢在糖尿病引起的心房重构中发挥作用。因此，作者检测了心房线粒体的形态和功能。TEM结果显示，与db/m小鼠相比，db/db小鼠心房组织单位面积线粒体面积减少，线粒体数量增加，尽管这一趋势没有达到统计学显著性（图5C，E和F）。同样，过表达NR4A3后，无论是在db/db小鼠还是db/m小鼠中，都没有观察到线粒体面积和数量的显著差异（图5C，E和F）。透射电镜结果显示，db/db小鼠的线粒体损伤最严重，表现为明显的线粒体空泡化。有趣的是，过表达NR4A3的db/db小鼠的线粒体空泡化程度部分减轻（图5C，G）。注射AAV9-NR4A3或AAV9-Ctrl的db/m或db/db小鼠的心房中Tunel染色证实，维持NR4A3的表达水平可以抑制db/db小鼠的凋亡（图5D，H）。随后，作者分析了注射AAV9-NR4A3或对照病毒后，从db/m或db/db小鼠分离的线粒体的呼吸。通过seahorse XF分析测量线粒体OCR，结果表明，在有复杂I底物，丙酮酸/苹果酸的组中，OCR没有显著变化（图5I，J）。然而，有复杂II底物，琥珀酸，在db/db组中，OCR显著降低，而过表达NR4A3导致OCR显著改善（图5K，L）。这些发现表明，NR4A3影响db/db小鼠心房线粒体的呼吸，特异性靶向线粒体复合体II。接下来，作者从db/m和db/db小鼠的心房组织中提取线粒体，过表达NR4A3或对照病毒。然而，过表达NR4A3后，只有复合物II的活性显著增加，而复合物I和复合物III的活性没有明显变化。这些结果表明，与线粒体OCR结果一致（图5I-l），NR4A3过表达可以缓解在db/db小鼠中观察到的复杂II功能的下降。此外，作者用过表达或敲低NR4A3的慢病毒转染HL-1心肌细胞，在RNA和蛋白水平验证转染效率。随后，作者测定了携带shNR4A3的慢病毒或ctrl病毒转染HL-1细胞，并在低糖（ctrl组，5.5mmol/l）或高糖（glu组，30mmol/l）显示，NR4A3敲低加剧了暴露于高糖的细胞中的线粒体OCR功能障碍（图5M-P）。![]()
图5 上调NR4A3可改善糖尿病诱导的线粒体能量代谢障碍
6、NR4A3抑制糖尿病诱导的线粒体氧化应激
二氢乙锭（DHE）染色显示，过表达NR4A3对db/m小鼠的活性氧（ROS）生成无明显影响。相反，与db/m小鼠相比，db/db小鼠的ROS产生显著增加。然而，NR4A3的上调减轻了db/db小鼠中ROS的程度（图6A，B）。随后，作者评估了氧化应激调节的关键酶SOD2的蛋白水平。结果表明，在db/db小鼠中SOD2水平显著增加。有趣的是，NR4A3在db/db小鼠中的高表达减弱了SOD2蛋白水平，如图6C和D所示。JC-1法检测线粒体膜电位；db/db小鼠的膜电位损伤程度明显高于db/m小鼠。然而，在db/db小鼠中过表达NR4A3可以改善损伤程度（图6E，F）。此外，体外实验表明，过表达NR4A3恢复了暴露于高糖的HL-1细胞的线粒体膜电位损伤（图6G，H）。在HFD和STZ处理方案下，NR4A3-KO小鼠的膜电位损伤比WT小鼠更明显，如图S10A所示。使用MitoSOX红色线粒体超氧化物指示剂评估线粒体氧化应激，使用Mitotracker
Green标记线粒体。心房NR4A3的上调减轻了db/db小鼠的线粒体氧化应激（图6I，J）。同样，上调NR4A3后，高糖处理的HL-1细胞中的线粒体氧化应激减轻（图6K，L）。![]()
图6 糖尿病心房线粒体中NR4A3的表达与氧化应激损伤成反比
7、NR4A3通过调控SDHA的转录调控影响线粒体能量代谢
对通过RNA测序和代谢组学分析确定的代谢通路相关基因的蛋白水平进行的后续研究表明，丙酮酸代谢通路的关键酶丙酮酸脱氢酶E1亚基α1（PDHA1）的蛋白水平保持无显著变化（图7C）。然而，与db/m小鼠相比，db/db小鼠心房组织中PDHA1的磷酸化水平显著升高，NR4A3过表达减轻了这一磷酸化水平（图7C）。进一步的研究表明，负责促进PDHA1磷酸化的丙酮酸脱氢酶激酶4（PDK4）没有发生显著变化（图7C）。相反，与db/m小鼠相比，负责去磷酸化PDHA1的丙酮酸脱氢酶磷酸酶催化亚单位1（PDP1）在db/db小鼠中减少。上调NR4A3导致PDP1表达增加（图7C，D）。蛋白水平确认还表明，维持NR4A3抑制了db/db小鼠心房组织中琥珀酸脱氢酶复合体黄素蛋白亚单位A（SDHA）和细胞色素c氧化酶亚单位5a（COX5a）的减少（图7C，E和F）。考虑到NR4A3作为转录因子的作用，作者使用新生小鼠心肌细胞(nmcm)进行了Cut&Tag分析，以确定Pdp1，SDHA和Cox5a启动子区域中潜在的NR4A3反应元件。对PCR扩增的Cut&Tag产物进行琼脂糖凝胶电泳，发现在Ppd1启动子区域内没有可识别的片段。相反，表明Cox5a启动子区域的片段较大且存在异质性条带。值得注意的是，SDHA启动子区域在预期范围内显示出明显的条带（图7G）。因此，作者假设NR4A3与SDHA启动子区域结合。为了验证这一假设，作者采用双荧光素酶报告基因实验来鉴定人SDHA启动子区域的特异性NR4A3反应元件。首先，将完整的人SDHA和Cox5a启动子区质粒与人pcDNA3.1-NR4A3质粒一起转染入HEK293细胞。双荧光素酶报告基因检测显示，仅SDHA组相对发光（RLU）显著增加，Cox5a组无显著变化（图7H）。这再次证实了NR4A3与SDHA启动子区域的结合特异性。利用转录因子结合谱数据库jaspar（https://jaspar.genereg.net），作者确定了NR4A1与SDHA启动子的一个预测结合区域和NR4A2与SDHA启动子的三个预测结合区域。考虑到NR4A家族DBD的高度保守性，作者整合了预测位点，构建了250 bp大小的SDHA截短启动子区。具体结构示意图见图7I和图S13B。使用截短结构的双荧光素酶报告实验结果表明R3区域的RLU显著增加，证实NR4A3与SDHA启动子的结合位点在R3区域内，一个预测序列（AAAGTCAC）也位于该区域（图7I）。因此，作者构建了用于双荧光素酶报告的鉴定序列和突变序列的质粒。结果证实鉴定序列的RLU显著增加，而突变序列的RLU没有显著差异（图7J）。因此，鉴定的序列代表了NR4A3对SDHA启动子的特异性反应元件。在HL-1细胞中，作者再次证实NR4A3确实调节SDHA的转录。这表明SDHA的mRNA水平与NR4A3表达的波动呈直接相关，相应的升高和降低（图7K，L）。随后，免疫荧光分析发现，在HFD和STZ处理下，NR4A3−/−小鼠的SDHA表达水平相比WT小鼠显著降低（图7M，N）。综上所述，NR4A3调控SDHA的转录表达，从而影响线粒体稳态。![]()
图7 NR4A3直接结合SDHA启动子并调控其转录
8、SDHA过表达可减轻糖尿病NR4A3-KO小鼠心房重构
鉴于SDHA在NR4A3介导的糖尿病诱导的ACM调节中的关键作用，NR4A3-KO小鼠在8周时接受过表达SDHA的AAV9载体或对照注射，随后接受ND或HFD STZ治疗16周。SDHA的过表达效率如图所示。S13D作者的研究结果表明，在NR4A3缺陷诱导的糖尿病小鼠中，SDHA的上调抑制了LAW/TBW、左心房大小、心房纤维化、心房心肌细胞横截面积的重塑，以及对起搏诱导的AF的易感性（图8A-K）。TEM表明，过表达SDHA并未显著改变糖尿病NR4A3-KO小鼠线粒体的大小和数量（图8L-N）。然而，它显著减轻了线粒体损伤（图8L，O），同时显著改善了ATP生成（图8P）。![]()
图8 SDHA过表达可减轻糖尿病NR4A3-/-小鼠的心房重构
结论：
综上所述，该研究首次证实了糖尿病心房中NR4A3的降低直接导致SDHA的转录下调。这种下调显著影响线粒体ATP的生成，使氧化应激升级，最终导致心房肥厚、纤维化和电重构。值得注意的是，升高SDHA水平可减轻NR4A3缺乏引起的心房重构。综上所述，这些发现揭示了NR4A3在糖尿病诱导的ACM中的关键作用，为心房肌病提供了新的潜在治疗靶点。![]()
参考文献：
Peng H, Yuan J, Wang Z, Mo B, Wang Y, Wang
Y, Wang Q. NR4A3 prevents diabetes induced atrial cardiomyopathy by maintaining
mitochondrial energy metabolism and reducing oxidative stress. EBioMedicine.
2024 Aug 3;106:105268. doi: 10.1016/j.ebiom.2024.105268.
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组学实验：组织学分析，代谢组学分析
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细胞实验：细胞的培养和处理
动物模型及病理分析：构建糖尿病小鼠模型
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课题设计与申报|分子生物学实验|细胞功能|机制调控|多组学检测分析
