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激活的成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2）的基因组改变在肝内胆管癌（ICC）中很常见，并对FGFR抑制具有敏感性。然而，反应的深度和持续时间往往是有限的。在这里，我们对患者衍生的模型进行综合转录组学、代谢组学和磷酸蛋白质组学分析，以确定致癌FGFR2信号下游的通路，这些通路促进ICC的生长，并揭示与通路抑制相关的补偿机制。我们发现FGFR2介导的核因子-κB（NF-κB）的激活保持了高度的糖酵解表型。相反，FGFR抑制会阻断葡萄糖摄取和糖酵解，同时引发适应性变化，包括改变燃料来源利用，促进脂肪酸氧化，增加线粒体融合和自噬。因此，联合线粒体靶向能够增强FGFR抑制剂的疗效，间歇性禁食在异种移植物模型中增强了这种效果。因此，我们表明致癌FGFR2信号传导驱动ICC中NF-κB依赖的糖酵解，并且响应FGFR抑制的代谢重编程赋予了新的可靶向脆弱性。该研究于2024年6月发表在《nature communications》，IF 14.7。技术路线：
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主要研究结果：
1 FGFR抑制约束了糖酵解基因在FGFR2-fusion+ICC中的表达
我们利用一系列患者衍生的模型来定义体内和体外对FGFR2-fusion+ICC中FGFR信号传导抑制的转录反应（图1a和表1）。体内研究采用两种患者来源的异种移植物（PDX）模型（MG212和MG69），它们对FGFR抑制敏感，具有抗增殖作用和阻断下游ERK信号传导。体外研究使用一组患者来源的细胞系，包括FGFRi敏感模型（ICC13-7）和两个模型，这两个模型显示了FGFR抑制后EGFR/ERBB信号的适应性反馈激活，但对FGFR+EGFR/ERIB双重抑制敏感（ICC10-6和ICC21）。RNA测序和基因集富集分析（GSEA）显示，FGFRi治疗显著下调两种PDX模型中的糖酵解基因特征（图1b，c）。同样，在体外对ICC13-7细胞系进行24小时FGFRi处理后，糖酵解特征受到强烈抑制（图1d）。在这方面，编码糖酵解第一限速酶的己糖激酶2（HK2）在不同模型中表现出强烈的抑制作用，参与糖酵解的其他基因协同下调，而TCA循环基因没有变化（图1e，f）。在ICC13-7细胞以及部分耐药ICC21和耐药ICC10-6模型中，早在FGFRi处理后4小时，HK2 mRNA就明显减少，其中双重FGFR/ERBB抑制增强了HK2的抑制作用。治疗24小时后，各模型的HK2在蛋白质水平上也显著降低（图1g-i）。因此，一致的体外和体内数据表明，FGFR抑制（±ERBB抑制）能有效抑制FGFR2-fusion +ICC模型中的糖酵解基因表达。![]()
图1：FGFR抑制约束了FGFR2-fusion + ICC中的糖酵解基因表达
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2持续的FGFR2信号维持高活性的葡萄糖代谢
基于转录组学数据，我们接下来通过对106种代谢物的稳态水平进行靶向液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS），探索FGFR抑制对FGFR2-fusion +ICC13-7模型细胞代谢的功能影响（图2a）。FGFRi处理24小时后对ICC13-7细胞的检查显示，许多代谢物大幅减少，对葡萄糖代谢中间体的影响最为显著（图2b）。此外，使用MetaboAnalyst平台的富集分析确定糖酵解是变化最大的途径（图2c），磷酸己糖、1,6-二磷酸果糖（FBP）、3-磷酸甘油酯（G3P）/磷酸二羟丙酮（DHAP）、3-磷酸甘油酸（3PG）和磷酸烯醇丙酮酸（PEP）显著下降（图2d）。糖酵解中间体提供的己糖胺生物合成途径（HBP）、戊糖磷酸途径（PPP）和三羧酸（TCA）循环代谢物也减少。选定的核苷酸也被耗尽，即dTTP和dATP（图2d），许多氨基酸出现轻微下降。在双重FGFR/ERBB靶向ICC21细胞中观察到类似的情况，对糖酵解中间体的影响最为明显。总的来说，这些结果表明，在FGFR2-fusion +ICC中，FGFR激酶活性是驱动高水平葡萄糖代谢所必需的。糖酵解产物（己糖磷酸，FBP）和相关生物合成途径（HBP，PPP）的显著减少与FGFR抑制导致的HK2表达减少是一致的。与这些变化相一致，生物发光测定（葡萄糖摄取-Glo）表明ICC13-7和ICC21细胞的葡萄糖摄取减少（图2e）。此外，乳酸-Glo测定显示培养基中的乳酸水平降低，表明糖酵解减少（图2f）。我们使用海马代谢分析仪来评估糖酵解和呼吸速率。FGFR抑制显著抑制了糖酵解，如细胞外酸化率（ECAR）的测量所示（图2g）。相比之下，基础耗氧率和最大耗氧率（OCR）均得以维持（图2h）。维持或增强OCR以应对癌基因失活的适应性变化已被描述为维持细胞存活的重要反馈机制。因此，尽管抑制FGFR2融合会强烈抑制葡萄糖代谢，但补偿线粒体功能可以保护细胞活力。随后，我们使用均匀标记的13C6-葡萄糖（U-13C6-葡萄糖）追踪ICC13-7细胞中FGFR抑制对不同途径的葡萄糖通量（图2i，j）。用FGFRi或载体处理细胞24小时，然后在相同的处理条件下标记1小时或24小时。1小时后的分析表明，U-13C6-葡萄糖产生FBP和GlcNAC-1P的利用率明显降低，前者在24小时时也降低（图2k），表明FGFR信号传导对维持糖酵解和HBP活性至关重要。此外，葡萄糖进入TCA循环的通量也降低，伴随着M+2标记的柠檬酸盐/异柠檬酸盐、苹果酸盐和α-KG显著降低（图2k）。在分析的时间点，PPP活力似乎没有变化。因此，FGFRi驱动的这些途径代谢物稳态水平的降低与葡萄糖生产率的降低有关。值得注意的是，癌症依赖性的大规模图谱显示，与其他癌症细胞系相比，FGFR2-fusion+ICC细胞对SLC2A1（编码高亲和力葡萄糖转运蛋白GLUT1）的依赖性显著增强（图2l），与基线时对葡萄糖的特别高的需求一致。总的来说，数据显示FGFR2信号刺激糖酵解基因表达，并重新编程葡萄糖代谢，以支持FGFR2-fusion +ICC的生长。![]()
图2：持续的FGFR2信号维持过度活跃的葡萄糖代谢
3 FGFR2介导的葡萄糖代谢重编程需要NF-κB激活
我们随后探索FGFR2信号传导促进ICC细胞中高水平葡萄糖代谢的机制。首先，与MEK/ERK通路是FGFR2融合的主要效应器一致，用SHP2抑制剂GDC-1971或MEK抑制剂曲美替尼治疗可降低HK2表达，降低HK2的表达，并显著减少葡萄糖摄取和ECAR。接下来，我们重点研究FGFR2-SHP2-MEK下游转录程序的关键介质。通过使用TRRUST数据库询问差异表达的基因，预测FGFR抑制±ERBB抑制后转录因子活性的变化，表明治疗强烈下调了每个模型中的NF-κB靶基因特征（即RELA和NF-κB1靶）（图3a；代表性靶点如图3b所示；RNAseq数据集来自图1和已发表的数据集）。ICC13-7细胞中的萤光素酶报告基因检测证实，FGFRi处理后NF-κB转录活性显著降低（图3c）。随后的蛋白质印迹分析表明，FGFR信号强烈调节NF-κB通路。在每个细胞系和PDX模型中，FGFRi治疗（或双重FGFR/ERBB抑制剂治疗）显著降低介导NF-κB激活的κB激酶抑制剂α∕β（IKKαͨβ[phospho-S176/180]）的激活磷酸化水平（图3d、e）。磷酸化IKK的减少很快，在治疗后1小时内观察到，这与NF-κB抑制蛋白IκBα的逐渐积累以及NF-κB诱导激酶（NIK）和NF-κ亚基前体p100的水平降低有关。在PDX模型（MG212和MG69）中，FGFR抑制剂治疗也抑制磷酸化RELA（S536）水平（图3e）。此外，RELA显示出渐进的细胞质滞留和核定位减少，而总蛋白水平没有变化。SHP2抑制（GDC-1971）或MEK抑制（曲美替尼）也降低磷酸化IKK水平。我们还证实曲美替尼抑制NF-κB靶基因表达。基于全球定量质谱的FGFR2-fusion +ICC细胞磷酸蛋白质组学进一步强调FGFR2信号传导与NF-κB通路调控之间的联系。细胞用赋形剂或futibatinib处理4或24小时，然后进行分析。这些研究从3954种蛋白质中检测到19136个磷酸化位点（图3f）。然后，我们使用激酶库数据库预测最有可能磷酸化差异调节的磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸（pS/T）位点的激酶。富集分析证实，FGFRi处理显著降低ERK-RSK-（mTOR）-S6K轴的活性。值得注意的是，对具有不同pS/T水平的蛋白质的通路分析（利用Enrich平台）显示，在FGFRi处理4小时后，NF-κB通路成分的磷酸化显著降低（图3g，h）。其中一些变化涉及预测的ERK或S6K位点，即IKK抑制剂TNIP1/ABIN1（S619；S627）、TNF受体超家族成员21（TNFRSF21[S525]）和NF-κB2（S161），而TNRFS21（S565）和NF/κB2（S222）的磷酸化（非ERK/S6K相关位点）在任何一个时间点都没有变化。此外，FGFR抑制对NF-κB途径受体或配体的mRNA水平没有显著影响（TNFSF15除外，其受体TNFRSF25在ICC细胞中的mRNA表达非常低）。总的来说，这些数据表明NF-κB通路主要由直接的FGFR2-MEK-ERK信号机制调节，而不是控制通路成分的表达。 NF-kB通路可以通过各种机制促进肿瘤发生，包括衰老细胞代谢。在代谢方面，NF-kB具有特定背景的功能，可以对抗或增强细胞对有氧糖酵解的重编程，促使我们进一步研究这一途径。值得注意的是，RELA敲除或用IKKβ抑制剂TPCA-1治疗，下调HK2和LDHA mRNA和蛋白质水平（图3i-l）。此外，敲除RELA或NIK（MAP3K14），或用TPCA-1治疗，降低了ICC13-7和ICC21细胞的葡萄糖摄取和糖酵解（图3m-q）。此外，增殖分析表明，与一组非FGFR驱动的ICC细胞系相比，FGFR2-fusion +ICC细胞对RELA消融或TPCA-1治疗的敏感性增加。因此，FGFR2-MEK介导的NF-kB活化是维持过度活化的葡萄糖代谢和支持FGFR2融合+ICC模型生长所必需的![]()
图3：FGFR2介导的葡萄糖代谢重编程需要NF-κB
4 FGFR信号的抑制导致适应性代谢变化，这维持了FGFR2-fusion+ ICC中的线粒体呼吸
接下来，我们考虑了FGFR2-MEK-NF-κB信号传导引起的代谢状态改变是否可以用于治疗。类似于可以抵消致癌信号通路关闭的反馈信号转导过程，适应性代谢转变可以在癌基因驱动的代谢重编程丧失时维持细胞活力。在这方面，我们发现FGFR2+ICC细胞中FGFR抑制会损害进入TCA循环的葡萄糖通量，而线粒体耗氧量没有变化，这表明其他线粒体燃料可能会弥补葡萄糖代谢的减少。为进一步表征FGFR2-fusion +ICC中FGFR抑制后线粒体燃料使用的变化，我们进行安捷伦海马XF Mito fuel Flex测试，该测试通过评估特定代谢抑制剂对线粒体呼吸的影响来测量不同燃料的氧化速率（图4a）。通过阻断不同线粒体燃料（丙酮酸、谷氨酰胺和脂肪酸）所需的特定途径，该测定提供了细胞氧化每种线粒体燃料的依赖性和能力的衡量标准。该测试的结果表明，ICC细胞中FGFR的抑制导致对脂肪酸利用的依赖性增加（图4b）。在这方面，与葡萄糖代谢的明显减少相反，FGFR抑制后，脂肪酸氧化（FAO）速率要么增加（ICC21），要么不变（ICC13-7）（图4c）。值得注意的是，在转录水平上，编码脂肪酸合成中关键限速酶的基因被下调（图4d），而FAO基因被上调（图4e）。 FAO来自细胞内储存（脂滴）的脂肪分解以及细胞吸收的脂肪酸和脂蛋白。我们通过评估脂滴分解的变化进一步研究脂质利用。BODIPY染色和共聚焦显微镜定量显示，FGFRi处理导致24至48小时内脂滴数量逐渐显著减少，液滴大小也逐渐减小（图4f）。与这些反映脂解增加的变化一致，我们发现FGFRi处理提高了脂肪酶活性（图4g）。脂解是由PNPLA2（脂肪甘油三酯脂肪酶[ATGL]，限速酶）、LIPE（激素敏感连接酶[HSL]）和MGLL（单酰基甘油脂肪酶）介导的。我们预测，在FGFR抑制的早期和晚期时间点（4小时和24小时）检查磷酸蛋白质组将提供有关FGFR2/ERK活性附近的急性信号变化以及反映细胞状态变化的适应性信号变化的信息。该分析显示，FGFRi处理24小时后，PNPLA2（Ser-404）和LIPE（Ser-855和Ser-895）的磷酸化增加（图4h）。据报道，能量感应激酶 AMPK 磷酸化小鼠 PNPLA2 旁系同源物的保守位点 Ser-406 可刺激脂肪分解。与PNPLA2（Ser-404）一样，LIPE（Ser-855）是预测的AMPK位点。值得注意的是，PNPLA2（Ser-404）和LIPE（Ser-855）磷酸化延迟，治疗4小时后没有变化，此外，非AMPK位点、PNPLA2和LIPE的磷酸化在两个时间点都没有显著变化（图4i）。总的来说，这些数据表明，适应性过程导致代谢开关刺激脂肪分解，以应对FGFR抑制。为监测外源脂肪酸的利用，我们在FGFR2+ICC细胞±FGFRi处理中进行U-13C16-棕榈酸酯追踪。ICC13-7细胞在脂质耗竭培养基中用DMSO或infigratinib处理24小时，然后换用13C-棕榈酸酯标记培养基再处理8小时（用DMSO或FGFRi）。然后收获细胞进行代谢组学研究。FGFR抑制不影响棕榈酸衍生TCA循环代谢物的产生。这些数据表明，内源性脂质而非外源性脂质可能是FGFRi处理后脂肪酸供应FAO的主要来源，尽管其他脂肪脂质来源也可能参与其中。此外，脂肪酸摄取因子的表达，包括转运蛋白（FATPs）、结合蛋白（FABPs）和受体，不受FGFRi处理的影响或略有降低，转运蛋白SLC27A3和CPT1B适度上调（均以非常低的水平表达[CPM<1]），ACS1（乙酰辅酶a合成酶1，有助于线粒体摄取）的表达也略有增加。作为另一种适应性变化，我们观察到线粒体形态的改变，这与FGFR抑制后线粒体呼吸功能效率的提高相一致。特别是，Mitotracker染色表明，FGFR抑制剂治疗导致向更融合（或管状）的线粒体网络过渡（图4j，k）。这与线粒体裂变介质p-DRP1在丝氨酸-616处的激活磷酸化减少有关（图4l），而融合调节因子MFN1、MNF2和OPA1的蛋白质水平没有显著变化。最后，我们观察到自噬/溶酶体转录程序对FGFR抑制（或双重FGFR/EGFR抑制）的显著富集（图4m），这让人想起在癌症细胞中观察到的作为对KRAS-MEK抑制的保护性反应的自噬/溶酶体活性的适应性上调。为支持FGFR抑制对自噬调节的功能作用，我们观察到LC3-GFP mCherry报告分析检测到的自噬通量增加，与LC3染色增加和LC3B-II协同升高以及免疫印迹评估的p62水平降低有关（图4n-p）。总之，我们的数据表明，在FGFR2-fusion +ICC细胞中，细胞代谢的一系列适应性变化是对FGFR信号传导抑制的反应，燃料源利用和线粒体动力学的改变有助于在没有葡萄糖摄取的情况下维持氧化磷酸化（OXPHOS）。![]()
图4：FGFR 抑制导致适应性代谢变化，维持 FGFR2-fusion+ICC中的线粒体呼吸
5靶向适应性代谢通路可提高FGFR2-fusion+ ICC细胞中FGFR抑制剂治疗的有效性
根据FGFR2-fusion +ICC细胞中FGFR抑制后观察到的代谢可塑性，我们接下来探索靶向新出现的代谢脆弱性以提高治疗效果的潜力。为此，我们测试了FGFR和线粒体氧化代谢联合抑制的效果。我们首先测试了ONC212，它是ClpP蛋白酶的激动剂，对线粒体蛋白质量控制至关重要，目前正处于临床开发阶段。ONC212增强ICC13-7和ICC21细胞中FGFRi的功效（图5a）。由于葡萄糖缺乏已被证明使癌细胞对OXPHOS抑制敏感，特别是在葡萄糖利用受损的情况下，我们还检测了葡萄糖减少条件对这些反应的影响（11 mM葡萄糖对1 mM葡萄糖）。我们发现ONC212和FGFRi之间的协同作用在低葡萄糖培养基中增强（图5a）。与ClpP激活一致，ONC212治疗导致ClpX伴侣蛋白水平急剧下降，线粒体耗氧率降低。我们测试了线粒体代谢的其他抑制剂的协同作用。我们发现，与线粒体呼吸链复合物I抑制剂IACS-01075944联合治疗也能增强FGFR抑制剂的疗效。此外，基于观察到FGFR抑制剂治疗后FGFR2+ICC细胞对脂肪酸氧化（FAO）的代谢依赖性增加（图4b），我们还探讨了通过CPT1A抑制剂依托莫西治疗抑制FAO的协同作用。在测试的FGFR2-fusion +ICC模型（ICC13-7和ICC21）中，与单独使用FGFR抑制剂相比，联合治疗增强了细胞生长停滞。氯喹是一种阻断自噬的溶酶体酸化抑制剂，与氯喹联合使用时也出现了类似的协同作用。因此，靶向细胞代谢的适应性变化可以增强FGFR2-fusion +ICC细胞中FGFRi的活性，葡萄糖剥夺可以增强这种作用。![]()
图5：靶向适应性代谢通路和葡萄糖限制可提高FGFR2-fusion+ICC中FGFR抑制剂治疗的有效性
6 FGFR抑制剂对FGFR2-fusion+ ICC异种移植物的治疗效果通过线粒体靶向和禁食得到增强
与患者一样，在许多FGFR2-fusion +ICC的异种移植物模型中，FGFR抑制会导致适度萎缩或疾病稳定，而不是深度退化，为研究联合治疗提供了机会。因此，我们接下来研究FGFR2驱动的代谢和ICC异种移植物中的相关脆弱性。我们发现，基于氟-18氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（18F-FDG PET/CT），FGFR抑制剂治疗（每千克1毫克培米加替尼）显著降低ICC13-7肿瘤的葡萄糖摄取，这与体外FGFR依赖性葡萄糖摄取一致（图5b）。在用培美加替尼或载体治疗7天后，我们还对这种异种移植物模型进行基于质谱的代谢组学研究。数据显示，细胞碳代谢产生的代谢物大幅减少，糖酵解富集强烈（图5c）。显著的变化包括6-PG、PEP、GlcNA-1-P和FBP的下降（图5d）。这些发现支持FGFR2融合在ICC肿瘤代谢重编程中的重要作用。为探索这种FGFRi驱动的葡萄糖代谢损伤是否可以利用，我们在ICC13-7异种移植物中测试FGFRi和ONC212线粒体靶向的联合疗效。间歇性禁食已被证明是一种临床适用的策略，可以降低葡萄糖的可用性，以加强OXPHOS抑制剂治疗。因此，基于这些观察和我们的体外数据显示，在血糖降低的条件下，FGFRi与ONC212联合治疗的效率有所提高，我们对接受常规饮食或间歇性禁食方案的小鼠进行治疗（图5e）。该方案降低了循环葡萄糖水平，但没有导致明显的体重减轻（图5f，g）。在这两种饮食中，单药FGFR抑制（每天每公斤吡加替尼1毫克）都能阻断肿瘤生长，但不会导致消退，其中ONC212单药治疗的效果很小（图5h，i）。相比之下，ONC212增强了FGFRi的效率，导致肿瘤消退，与常规饮食条件相比，间歇性禁食的效果更为明显（图5h，i）。一致地，联合治疗与间歇性禁食相结合时，可显著降低肿瘤细胞增殖（Ki67染色），超过单一药物（图5j，k），并在标准饮食条件下优于联合治疗。切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3染色评估细胞死亡在组间没有显示出显著差异，尽管有一种趋势表明禁食联合用药后细胞死亡增加。我们将这些研究扩展到第二个异种移植物模型，使用患者来源的ICC21细胞。在间歇性禁食的情况下，我们发现，虽然培米加替尼减缓了生长，ONC212没有效果，但联合用药增强了肿瘤生长停滞。因此，我们观察线粒体靶向和FGFR抑制联合在由两个独立的患者衍生的FGFR2-fusion +ICC模型生成的异种移植物中的疗效。最后，我们观察到，在间歇性禁食方案下，通过FGFRi和复合物I抑制剂IACS-010759的联合治疗，ICC13-7异种移植物的肿瘤收缩也得到类似的增强。因此，FGFR2抑制可有效减弱体内葡萄糖代谢，使FGFR2+ICC异种移植物对葡萄糖可用性和OXPHOS活性的双重降低敏感。结论：
总之，我们已经确定FGFR2融合是ICC中有氧糖酵解的有力驱动因素，并揭示NF-κB是这一过程的关键介质。抑制FGFR会导致葡萄糖代谢受损，限制ICC细胞的适应性，并在体外和体内产生可靶向的代谢脆弱性。这些数据支持进一步探索代谢干预，包括药理学和饮食策略，以提高FGFR抑制剂的疗效，并可能改善ICC患者的预后。参考文献：
Zhen Y, Liu K, Shi L, Shah S, Xu Q, Ellis H, Balasooriya ER, Kreuzer J,
Morris R, Baldwin AS, Juric D, Haas W, Bardeesy N. FGFR inhibition blocks
NF-ĸB-dependent glucose metabolism and confers metabolic vulnerabilities in
cholangiocarcinoma. Nat Commun. 2024 May 7;15(1):3805. doi:
10.1038/s41467-024-47514-y. PMID: 38714664; PMCID: PMC11076599.![]()
组学实验：靶向代谢组学，磷酸蛋白组学
常规分子实验：RT-qPCR，WB，免疫荧光，RNA测序，ELISA，免疫组化
细胞实验：细胞培养，海马试验，自噬通量测定
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课题设计与申报|分子生物学实验|细胞功能|机制调控|多组学检测分析
