小细胞肺癌（SCLC）是一种高度侵袭性的恶性肿瘤，以快速生长和早期转移为特征，易发生耐药性和复发。了解小细胞肺癌的肿瘤内空间异质性对于改善患者预后和临床相关亚型至关重要。在这项研究中，使用GeoMx数字空间分析技术对25名小细胞肺癌患者进行亚组织分辨率的全转录组空间分析。该分析揭示了肿瘤内多区域异质性，其特征是在空间定位的组织学区域内具有不同的分子特征、生物功能、免疫特征和分子亚型。还建立不同转录物定义的肿瘤内表型之间的联系及其对患者生存和治疗反应的影响。最后，基于肿瘤内异质性水平的普遍性，确定一种称为ITHtyper的基因特征，该特征使患者能够从大量RNA-seq谱中进行风险分层。ITHtyper的预后价值在独立的多中心患者队列中得到严格验证。本研究介绍了一种初步的以肿瘤为中心、区域靶向的空间转录组资源，该资源揭示小细胞肺癌中以前未被探索的肿瘤内空间异质性。这些发现有望改善肿瘤的重新分类，并促进小细胞肺癌患者个性化治疗的发展。该研究于2024年8月发表在《Advanced Science》，IF 14.3分。
为全面探索小细胞肺癌在空间转录组范围内的肿瘤内异质性，作者使用DSP技术，该技术在原位覆盖了18000多个蛋白质编码转录本（全转录组图谱，WTA）。作者使用荧光偶联抗体（PanCK和CD45）描绘肿瘤免疫区室（图1A）。从25名小细胞肺癌患者中收集79个肿瘤特异性感兴趣区域（ROI）。由于作者严格的选择标准，根据每个TMA核心上成对H&E切片的病理观察，每位患者的ROI数量从2到9不等，中位数为3（图1B）。
单个肿瘤内任意两个ROI之间的空间物理距离（SPD）从257μm到3168μm不等，中位数为1843μm（图1C）。ROI基因条形码的高通量测序导致每个ROI的中位数为6280000个对齐读取，四分位数范围为4080000到10320000。对单个ROI中标准化基因表达的密度分布的分析显示，其同质性良好，与患者、性别或肿瘤位置无关，确保数据的可靠性和稳健性。作者在所有后续分析中纳入了来自WTA小组的18676个基因，以增加纳入所有可能与ITH相关的基因的可能性。每个ROI的对数转换格式的平均基因表达分布范围为2至4.755，形成了一个正常模式（图1D）。
为在空间背景下研究肿瘤内转录多样性，使用t-SNE算法将79个ROI的基因表达谱投影到二维空间上进行可视化（图2A）。从通过降维获得的顶部特征向量中提取前200个可变基因，并基于这些基因在79个ROI中进行无监督的分层聚类，生成三个不同的聚类（C1-C3），以表示独特的转录物定义的表型（图2B）。然后，作者使用DEPTH方法根据基因表达谱量化这些肿瘤ROI的ITH，并观察到C1簇的ITH水平高于其他两组（C2和C3）。在这里，作者将其表示为高ITH（h-ITH）。相比之下，C3和C2集群表现出相对较低的ITH水平，作者分别称之为低ITH（l-ITH）和中ITH（m-ITH）（图2B，C）。同时，三个ITH表型组之间的SPD没有统计学上的显著差异（Kruskal-Wallis，p=0.83），SPD和C-核心之间也没有观察到显著的相关性（Spearman R=-0.041，p=0.65）。对这些ITH定义组的病理特征的进一步检查揭示了肿瘤间质模式的不同分布和癌症细胞形态的变化。h-ITH肿瘤表现出高纯度，有散发性基质细胞和浸润性淋巴细胞，癌症细胞表现出更典型的裸核形态，细胞质含量有限（图2D）。相反，m-ITH和l-ITH组显示纤维化间质增加，肿瘤床内淋巴细胞浸润更明显，而癌症细胞显示细胞核增大，细胞质含量增加（图2D）。这些结果表明，在分子水平上存在空间定义的肿瘤内异质性，这可能与小细胞肺癌的病理特征有关。
为进一步探索驱动这些不同表型的潜在机制，作者对各组之间的差异基因表达进行成对分析（h-ITH与其他组、m-ITH与另一组和l-ITH与其它组），以确定与ITH表型相关的基因特征。作者分别确定高ITH、m-ITH和l-ITH表型的109个DEG（80个上调和29个下调）、157个DEG和68个DEG。使用基于这些DEG集的共表达网络分析，作者为每种ITH亚型构建了关键的生物网络（图2F），生成由多条边连接的关键调控基因（326条边连接101个基因）（图2F）。其中，h-ITH表型与上皮间质转化（EMT）、血管生成和对DNA损伤反应的敏感性等途径有关，而m-ITH和l-ITH组主要富含WNT和β-连环蛋白信号传导以及雌激素反应（图2F）。GO富集分析表明，h-ITH表型与细胞命运和分化有关，m-ITH表型在免疫相关的生物过程中富集，l-ITH表型在细胞反应和器官形成显示出富集（图2G）。
鉴于ITH亚型中观察到的独特分子特征，特别是与免疫相关的特征，作者专注于表征免疫细胞的空间组成。作者使用CIBERSORT算法对基因表达数据进行反卷积分析，以在ROI水平量化浸润的免疫细胞。在量化的22种细胞类型中，四种免疫细胞群（CD8+T细胞、血浆B细胞、CD4+幼稚T细胞和静息髓系树突状细胞）在ITH组之间存在差异（图3A）。与其他两种表型相比，具有mITH表型的ROI中CD8+T细胞明显更丰富（p<0.05，图3B）。另外两种广泛使用的方法，TIMER和MCP计数器进一步证实了这一观察结果（p<0.05，图3C）。这些计算推断的结果随后使用靶向T细胞表面抗原CD8的常规免疫组织化学（IHC）进行验证，其中作者观察到，与其他ITH表型相比，mITH表型的ROI中CD8+T细胞的浸润更高（Kruskal-Wallis，p=0.008）（图3D）。
由于T细胞主要通过MHC-I分子在与各种共调节细胞（如树突细胞和B细胞）的动态相互作用中发挥作用，作者进一步研究参与抗原呈递和表面免疫调节检查点的基因。通过平均每个ITH组中这些基因的表达，作者观察到与每个ITH组别相关的不同表达模式。与m-ITH表型相比，h-ITH或l-ITH表型显示MHC I相关抗原呈递分子的表达较低（p<0.05，图3E）。同样，当比较ITH表型之间的共刺激分子和共抑制分子时，m-ITH表型显示出比其他ITH表型更高的共刺激和免疫检查点分子表达（p<0.05，图3E）。这些结果表明，肿瘤隔室产生了亚组织学定义的微环境，具有独特的ITH特征，这可能是由动态改变的分子途径引起的，其局部免疫原性增加，涉及m-ITH组中CD8 T细胞的激活。
为更深入地了解患者层面的肿瘤内异质性，作者汇总了所有患者个体ROI的预先确定的ITH亚型（低、中或高ITH）。在将这些ROI映射回患者后，作者将25名小细胞肺癌患者分为两个不同的TME组：高复杂亚TME（HCs TME）和低复杂亚TME（LCs TME）（图4A）。通过使用C核量化给定肿瘤内任意两个ROI之间转录特征的相似性，作者观察到与HCs TME肿瘤相比，LCs TME瘤中转录定义的瘤内一致性水平显著更高（Kruskal-Wallis，p<0.001）（图4B）。此外，这两组患者的生存结果和治疗反应存在显著差异。与HC TME肿瘤相比，LC TME肿瘤的总体生存率（OS）（log-rank检验，p=0.046）和无病生存率（DFS）（log-rank检验，p=0.024；图4C）明显更好。值得注意的是，LCs TME肿瘤没有死亡或肿瘤复发，突出了这种ITH分类的临床价值（图4C），而检查两种TME亚表型的临床病理特征对患者分层的价值有限。这些发现表明，小细胞肺癌中肿瘤内TME的空间异质性会影响患者的预后，并为小细胞肺癌患者分层的改善提供了定量估计。
为探索肿瘤空间异质性模式与先前由RNA-seq定义的SCLC分子亚型（SCLC-A、SCLC-N、SCLC-P和SCLC-Y）之间的相关性，作者提取了Rudin等人先前描述的四种关键转录调节因子（ASCL1、NEUROD1、YAP1和POU2F3）的空间表达，以评估25名患者79个ROI中的SCLC基因亚型。作者的分析显示，SCLC-A是最常见的亚型（n=39，49.4%），其次是SCLC-n（n=25，31.6%）和SCLC-P（n=15，19.0%）（图5A）。作者观察到患者水平的一致性很高，同一患者的59.5%的肿瘤ROI属于相同的分子亚型。然而，9名患者具有混合的ROI分子亚型，无法分配到单一的分子亚型（图5B）。如Zhang等人之前所述，根据50个NE相关基因对神经内分泌（NE）亚型进行类似的分析。与上述亚型定义的比例一致，根据每个ROI计算的NE评分，23个ROI被归类为低NE亚型（29.1%），56个ROI被分类为高NE亚型，证实了上述发现（图5C）。在比较患者层面 ROIs 的 NE 亚型时，作者观察到基于 ROI 的 NE 亚型的分类在 19 例中与患者水平的分配相匹配，但在 6 例中发生不一致（图5D）。
进一步的分析检查了肿瘤内亚TME异质性定义的SCLC亚型与这两种患者水平的分子亚型之间的一致性和不一致性。在高TME异质性（HCs TME）和低TME异构性（LCs TME”）患者组之间，分子亚型（转录亚型和NE亚型）的分布没有显著差异（Fisher精确检验，p>0.05；图5E，F），这表明肿瘤衍生的异质性估计可能独立于之前的转录和基于NE的亚型。此外，与具有单一转录亚型的患者相比（5年生存率：小细胞肺癌66.7%，小细胞肺癌75%），具有不同转录亚型患者内混合的患者DFS率更低（5年存活率：37.5%）。相比之下，与纯NEhigh患者（5年生存率：NElow为75%，NEhigh为42.9%）相比，具有不同NE分子亚型或NElow的患者内混合的患者显示出更好的DFS率（5年存活率：83.3%）（图5G）。这些结果表明，经典的小细胞肺癌分子亚型可能无法充分预测临床结果，相反，在空间背景下检查患者体内分子亚型的多样性可能会为患者分层提供更多的临床相关性。
为研究ITH区域特异性基因表达推断肿瘤源性TME表型的潜力，作者使用了基于DSP数据选择特征的深度自动编码器框架，可以有效地区分HC TME和LCsTME。根据其显著性值鉴定了10个基因（NKX1-2、TLE2、TPBG、GPR31、SRSF6、DAZ4、PD-L1、LYZ、PCP4和ZIC1），然后用于基于XGBoost算法开发用于亚TME异质性亚型的机器学习模型（称为ITHtyper）（图6A）。ITHtyper对70%的患者进行培训，并对剩余的30%进行内部验证评估。ITHtyper使用0.45的阈值将SCLC ROI有效地分为高ITHtype（ITHtyperhi）和低ITHtyperlo（ITHtype rlo）表型，分别对应于HCs TME和LCs TME。对训练集和测试集的生存分析表明，ITHtyperlo表型与OS和DFS的改善有关（对数秩检验，OS的p=0.035和0.027，DFS的p=0.018和0.052）（图6B，C）。值得注意的是，ITHtyperlo表型未显示死亡或肿瘤复发（图6D，E）。为进一步验证ITHtyper在散装RNA-seq谱中的适用性，作者将其应用于来自多中心SCLC患者队列的121个散装组织RNA-seq图谱。结果显示，与ITHtyperhi表型患者（n=83）相比，ITHtyperlo表型患者（n=38）的生存结果明显更好（log-rank检验，p=0.032；图6F），突出其预测预后分层的潜力。此外，当应用于免疫治疗队列时，ITHtyper对免疫治疗反应的预测能力（AUC=0.846）优于PD1（AUC=0.769）和PD-L1（AUC=0.808）（图6G）。值得注意的是，所有对免疫疗法达到完全反应的患者属于ITHtyperlo表型组，这意味着其作为预测ICI反应的生物标志物具有更广泛的潜力（图6H）。
总之，本研究提供了小细胞肺癌的空间多区域转录组景观，揭示了独特的空间转录组特征，其特征是不同的分子特征、潜在的生物过程、免疫表型和分子亚型多样性。这些特征与患者预后显著相关，并揭示了肿瘤内的异质性。这项以空间亚区域为重点的研究为研究致瘤性ITH提供了宝贵的资源，并阐明了其潜在机制和与TIME的相互作用。利用机器学习根据ITH评分对肿瘤进行分类是在空间分辨框架中理解SCLC的第一步，有可能为改善临床转化环境中的患者分层铺平道路。
Zhang Z, Sun X, Liu Y, Zhang Y, Yang Z, Dong J, Wang N, Ying J, Zhou M, Yang L. Spatial Transcriptome-Wide Profiling of Small Cell Lung Cancer Reveals Intra-Tumoral Molecular and Subtype Heterogeneity. Adv Sci (Weinh). 2024 Aug;11(31):e2402716. doi: 10.1002/advs.202402716. Epub 2024 Jun 19. PMID: 38896789; PMCID: PMC11336901.
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