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m6A是哺乳动物mRNA中最普遍的表观转录修饰。最近的研究表明，m6A参与多种恶性肿瘤的发病机制，包括血液肿瘤。然而，m6A修饰及其调节因子在骨髓增生异常肿瘤（MDS）中的具体作用仍然不清楚。在本研究中，我们展示了在骨髓原始细胞≥5%的MDS患者中，m6A水平和m6A甲基转移酶METTL14的表达升高。此外，m6A水平和METTL14表达随着疾病风险的升高而上调，并与不良临床结果显著相关。敲减METTL14抑制了MDS细胞的增殖和集落形成能力。此外，体内实验表明，METTL14敲减显著减少了肿瘤负担并延长了小鼠的生存期。从机制上讲，METTL14通过形成METTL3-METTL14复合物促进了SETBP1 mRNA的m6A修饰，导致SETBP1 mRNA的稳定性增加，进而激活了PI3K-AKT信号通路。总的来说，本研究阐明了METTL14/m6A/SETBP1/PI3K-AKT信号轴在MDS中的作用，突出了针对METTL3-METTL14复合物介导的m6A修饰作为MDS治疗靶点的治疗潜力。本文于2024年7月发表于“Leukemia”（IF=12.8）上。技术路线：
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结果：
1）m6A和METTL14水平升高预示MDS患者预后不良
我们测量了29名MDS患者和10名健康捐赠者的BM-MNCs的整体m6A水平。结果显示，骨髓原始细胞≥5%的MDS患者的m6A水平显著高于骨髓原始细胞<5%的MDS患者和健康捐赠者（图1A）。此外，根据IPSS-R评分，高风险MDS患者（IPSS-R评分> 3.5）的m6A水平较高，而低风险MDS患者（IPSS-R评分≤ 3.5）与健康捐赠者的m6A水平相比没有明显差异（图1B）。此外，m6A水平较高的患者的总生存期（OS）明显短于m6A水平较低的患者（图1C）。为了确定在MDS中导致m6A修饰失调的关键m6A调节因子，我们分析了基于公开可用的MDS队列基因表达谱（GSE58831）的骨髓CD34+细胞中23个m6A调节因子的表达。结果显示，METTL14和其他六个m6A调节因子的表达水平在按骨髓原始细胞百分比划分的三组（健康捐赠者、骨髓原始细胞<5%的MDS患者和骨髓原始细胞≥5%的MDS患者）之间显著不同（图1D）。进一步的生存分析发现，METTL14、HNRNPC、RBMX、RBM15B、YTHDC2和ZNF217与预后独立相关（图1D，E），其中，METTL14是唯一一个其表达水平不仅与骨髓原始细胞相关，而且与生存独立相关的调节因子（图1F）。然后，我们在自己队列的MDS样本中验证了METTL14的表达。如预期所示，骨髓原始细胞≥5%的MDS患者BM-MNCs中CD34+细胞的METTL14表达高于健康捐赠者（图1G）。一致地，MDS病例中骨髓原始细胞≥5%的BM-MNCs中METTL14 mRNA表达较高，并且随着IPSS-R风险的升高而上调（图1H，I）。相应地，我们在骨髓原始细胞≥5%的MDS患者（图1J）和MDS细胞系MDS-L（图1K）中观察到了METTL14蛋白水平的升高。此外，MDS患者BM-MNCs中较高的METTL14 mRNA水平与较短的生存期独立相关（图1L）和更快的白血病转化速度（图1M）。总的来说，m6A水平和METTL14表达在骨髓原始细胞≥5%的MDS中升高，并与疾病风险和临床结果显著相关。![]()
2）METTL14在体外和体内均促进MDS细胞增殖
接下来，我们探索了METTL14在MDS细胞中的生物学功能。我们首先在MDS-L细胞中敲低了METTL14（图2A），并发现抑制METTL14显著降低了MDS-L细胞中的m6A水平（图2B）。此外，METTL14敲低显著阻碍了MDS-L细胞的生长（图2C）和集落形成（图2D），同时促进了细胞凋亡（图2E）并将细胞周期阻滞在G0/G1期（图2F）。同样，敲低METTL14也抑制了CD34+ MDS细胞的生长和集落形成（图2G，H）。相反，强制表达METTL14野生型（WT），而不是METTL14 R298P（一种催化活性突变的变体），增加了m6A水平（图2I，J）。此外，METTL14 WT的过表达，而不是METTL14 R298P，显著增强了MDS-L细胞的增殖（图2K）和集落形成（图2L）。此外，我们探索了METTL14在体内MDS细胞增殖中的作用。构建了Dox诱导的shMETTL14，并用于在MDS-L细胞中敲低METTL14（图2M），导致Dox诱导后（shMETTL14-ON）体外增殖显著抑制（图2N）。随后，将携带Dox诱导的shMETTL14的MDS-LLuc细胞静脉注射到经过辐射处理的小鼠体内（图2O）。化学发光成像显示，Dox诱导METTL14敲低后，植入的MDS-L细胞显著受到抑制（图2P，Q）。此外，METTL14敲低后，骨髓和外周血中MDS-L细胞的比例也显著降低（图2R，S）。正如预期的那样，MDS-L细胞中METTL14的敲低延长了受体的生存期（图2T）。综上所述，这些发现表明METTL14在体内和体外MDS细胞的生长中都发挥着重要作用。![]()
3）鉴定METTL14的潜在下游靶点
m6A-seq数据分析揭示了MDS-L细胞中m6A修饰的共识序列为GGACU（图3A）。MDS-L细胞中的m6A修饰主要位于编码序列（CDS）区域，其次是终止密码子位点、起始密码子位点、5’-UTR区域和3’-UTR区域（图3B）。在对照组MDS-L细胞中，共检测到24689个m6A峰，而在METTL14敲减的MDS-L细胞中观察到了23668个m6A峰（图3C）。值得注意的是，METTL14敲减的MDS-L细胞在3’-UTR区域的m6A峰密度低于对照组MDS-L细胞（图3D）。我们鉴定了412个mRNA转录本，其m6A修饰显著减少（图3E），以及413个mRNA转录本，在METTL14敲减后m6A修饰明显增加。同时，METTL14敲减导致331个mRNA转录本下调和406个mRNA转录本上调（图3E）。考虑到METTL14的m6A甲基化活性，我们假设减少的m6A修饰可能是METTL14敲减直接导致的，而m6A水平的上调可能是间接效应，因此我们的研究重点放在了METTL14敲减后的m6A-hypo基因。减少m6A水平或差异表达的基因分别以热图展示（图3F）。通过对m6A-seq和RNA-seq数据进行综合分析，我们发现160个m6A低甲基化mRNA转录本的表达同时下调，而1个m6A低甲基化mRNA转录本的表达上调（图3E）。为了进一步缩小METTL14在MDS中的靶基因范围（图3G），我们从161个m6A低甲基化和差异表达的基因中筛选出前20个m6A下调基因作为潜在的候选基因。随后，利用GSE58831的表达数据，检查了这些潜在靶基因与METTL14之间的相关性。结果显示，SETBP1和ZNF157的表达与METTL14之间存在显著关系（图3H）。最后，我们进行了基因表达和生存分析，发现根据GSE58831队列，SETBP1的表达具有临床意义，而ZNF157的表达则没有（图3I，J。具体来说，SETBP1在原始细胞≥5%的MDS中高表达，且SETBP1的高表达与不良预后相关。随后，我们使用IGV确认并可视化了METTL14敲低导致SETBP1转录本中m6A修饰的减少（图3K）。因此，我们确定SETBP1是MDS中METTL14的一个潜在关键靶标。![]()
4）METTL14通过METTL3-METTL14复合物介导的m6A修饰来稳定SETBP1 mRNA
我们发现METTL14敲减显著降低了MDS-L细胞中SETBP1 mRNA和蛋白的表达（图4A，B）。相反，METTL14 WT的强制表达，而非METTL14 R298P，导致SETBP1的mRNA和蛋白水平增加（图4C，D）。这些发现表明METTL14正向调节SETBP1的表达。进一步地，我们发现METTL14敲减后，SETBP1 mRNA的m6A修饰显著减少（图4E）。相反，METTL14 WT的强制表达，而不是METTL14 R298P，增强了MDS-L细胞中SETBP1 mRNA的m6A丰富度（图4F）。这些结果表明METTL14在SETBP1 mRNA的m6A修饰中扮演了正向调节角色。此外，SETBP1 mRNA在MDS-L细胞中通过抗METTL14抗体显著富集（图4G），这表明METTL14蛋白与MDS-L细胞中的SETBP1 mRNA结合。为了进一步探索METTL14是否影响SETBP1 mRNA的稳定性，进行了RNA稳定性分析。结果显示，METTL14敲减显著降低了SETBP1 mRNA的半衰期（图4H），这表明METTL14增强了SETBP1 mRNA的稳定性。为了确定METTL14是否依赖于m6A修饰来调节SETBP1 mRNA的稳定性，进行了双荧光素酶分析。结果显示，SETBP1-3’UTR-WT报告基因的荧光素酶活性在METTL14敲减后降低，而在SETBP1-3’UTR-WT报告基因的m6A基序位点进行突变则消除了这种效果（图4I），这表明了一种依赖于m6A的调节。综上所述，我们的数据表明METTL14通过增加SETBP1转录本的m6A修饰来促进SETBP1 mRNA的稳定性。文献指出，METTL14通过与METTL3形成异二聚体复合物来调节m6A修饰的沉积。因此，我们接下来研究了METTL3-METL14复合物在调节SETBP1 mRNA的m6A修饰中的作用。在METTL3敲低的细胞中，观察到SETBP1 mRNA的m6A修饰显著减少（图4J），随之SETBP1 mRNA和蛋白质水平也降低（图4K，L）。这些发现表明，METTL3参与了MDS细胞中SETBP1 mRNA的m6A修饰。此外，METTL14的过表达促进了METTL3-METTL14复合物的形成，这一点由FLAG标记的METTL14拉下的额外METTL3蛋白所证明（图4M），而METTL3的mRNA和蛋白质水平没有改变（图4N）。据报道，小分子STM2457能特异性抑制METTL3-METTL14复合物的催化活性。用STM2457处理的MDS-L细胞中，SETBP1转录本的m6A修饰减少（图4O），随后SETBP1 mRNA和蛋白质水平降低（图4P，Q）。此外，我们继续研究了STM2457对MDS细胞生长的影响。STM2457处理导致MDS-L细胞活力呈浓度依赖性抑制，半数抑制浓度（IC50）为6.87 μM（图4R）。我们还评估了STM2457在体内对MDS的治疗效果。结果表明，STM2457显著抑制了MDS-L细胞的植入（图4S-U）并延长了受体小鼠的生存期（图4V）。总之，我们的数据支持METTL3-METTL14异二聚体对于SETBP1 mRNA的m6A修饰至关重要，强调了其作为MDS治疗潜在靶点的前景。![]()
5）SETBP1在原始细胞≥5%的MDS中表达升高，促进MDS细胞增殖
与GSE58831队列一致，我们中心的数据显示，与健康捐赠者相比，骨髓原始细胞≥5%的MDS患者中SETBP1 mRNA升高（图5A），并且与疾病风险平行（图5B）。此外，我们的队列研究表明，SETBP1高表达的MDS患者比SETBP1低表达的患者生存期更短，白血病转化速度更快（图5C，D）。为了进一步探索SETBP1在MDS中的生物学功能，我们首先在MDS-L细胞中敲减了SETBP1（图5E），并发现敲减SETBP1显著抑制了细胞生长（图5F）和集落形成（图5G），但增加了细胞凋亡（图5H），并将细胞周期阻滞在G0/G1期（图5I）。相反，SETBP1的过表达（图5J）明显促进了MDS-L细胞的细胞增殖（图5K）和集落形成（图5L）。为了确定METTL14是否通过SETBP1促进MDS细胞增殖，我们在METTL14敲减的MDS-L细胞中恢复了SETBP1的表达（图5M）。SETBP1的外源表达部分逆转了METTL14缺乏对MDS-L细胞生长（图5N）和集落形成能力（图5O）的抑制效应。此外，恢复SETBP1表达也部分挽救了由METTL14缺乏引起的细胞凋亡（图5P）和细胞周期阻滞（图5Q）。总的来说，这些数据提供了证据，表明SETBP1在骨髓原始细胞≥5%和高风险类别的MDS中升高，并促进了MDS细胞增殖，这有助于METTL14在MDS中的功能。![]()
6）METTL14-m6A-SETBP1调节MDS中PI3K-AKT信号通路
通过对METTL14敲低后m6A-seq和RNA-seq数据指示的m6A低甲基化和差异表达基因进行KEGG分析，我们确定PI3K-AKT通路是MDS中METTL14的潜在信号通路（图6A）。我们发现SETBP1抑制下调了PI3K-AKT通路（图6B），而SETBP1过表达则激活了MDS-L细胞中的PI3K-AKT信号通路（图6C）。此外，在MDS-L细胞中敲低METTL14不仅降低了SETBP1的表达，还抑制了PI3K-AKT信号通路（图6D）。相比之下，过表达METTL14野生型（WT），而不是METTL14 R298P，可促进SETBP1表达和PI3K-AKT信号通路的激活（图6E）。更重要的是，我们发现通过恢复SETBP1表达可以挽救METTL14抑制对PI3K-AKT信号通路的下调作用（图6F）。综上所述，METTL14-m6A-SETBP1轴通过激活PI3K-AKT信号通路促进了MDS细胞的增殖（图6G）。![]()
结论：
本研究表明METTL14在MDS的发展中具有重要的致癌功能。METTL14通过形成METTL3-METTL14复合物，增强m6A对SETBP1 mRNA的修饰，从而提高SETBP1 mRNA的稳定性，激活PI3K-AKT信号通路，最终促进MDS细胞增殖。靶向METTL3-METTL14复合物介导的m6A修饰可能为MDS提供一种有希望的治疗方法。参考文献：
Jiang L, Zhang Y, Qian J, Zhou X, Ma L, Zhu S, Wang L, Wang W, Yang W, Luo
Y, Lang W, Xu G, Ren Y, Mei C, Ye L, Zhang Q, Liu X, Jin J, Sun J, Tong H. The
m6A methyltransferase METTL14 promotes cell proliferation via SETBP1-mediated
activation of PI3K-AKT signaling pathway in myelodysplastic neoplasms.
Leukemia. 2024 Jul 25. doi: 10.1038/s41375-024-02350-3.![]()
常规分子实验：RNA测序，m6A测序，m6A和m5C点印迹法，Western
blot，q-PCR，MeRIP-qPCR，RIP-qPCR，双荧光素酶报告基因实验，RNA稳定性测定，免疫共沉淀技术
细胞实验：CCK8，流式
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课题设计与申报|分子生物学实验|细胞功能|机制调控|多组学检测分析
