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肾细胞癌（RCC）被认为是一种“代谢性疾病”，其特征是晚期RCC患者的糖酵解升高。酪氨酸激酶抑制剂（TKI）疗法是目前晚期 RCC 的重要治疗选择，但部分患者可能会出现耐药性。将TKI与靶向代谢治疗相结合可能为晚期 RCC 患者提供更有效的方法。该研究通过对14例RCC患者单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析发现，糖酵解在RCC的不良预后和耐药性中起着至关重要的作用。TCGA-KIRC和糖酵解基因集分析发现DEPDC1是与KIRC恶性进展和耐药性相关的靶点。后续实验表明，DEPDC1促进了RCC的恶性进展和糖酵解，敲低DEPDC1可以逆转RCC细胞系的TKI耐药性。批量RNA测序（RNA-seq）和非靶向代谢组学测序表明，DEPDC1可能通过 AKT/mTOR/HIF1α通路调节RCC糖酵解，这一发现得到了蛋白质水平分析的支持。来自 98 例 RCC 患者的临床组织样本表明，DEPDC1 与预后不良相关，并预测 RCC 转移。综上，这项多组学分析表明，DEPDC1可以作为TKI联合靶向代谢治疗治疗TKI耐药的晚期RCC患者的新靶点。该研究于2024年七月发表在《Cell Death & Disease》(IF=8.1)上。![]()
技术路线：
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主要研究结果：
1. scRNA-seq发现糖酵解是导致RCC预后不良和耐药性的关键模块为了研究肾细胞癌临床恶性程度与糖酵解的关系，对14例肾细胞癌患者的原发性肿瘤进行了scRNA-seq分析，其中包括3例TKI耐药的穿刺活检样本。质量控制措施包括分析14例患者的87,770个细胞，这些细胞聚类为7种主要细胞类型，涉及33,557个恶性细胞、肾小管细胞、内皮细胞、成纤维细胞、T细胞和NK细胞、B细胞和浆细胞以及髓系细胞。每个患者的细胞组成比例如图1a所示。使用hdWGCNA包中的TestSoftPowers函数，对不同的软阈值进行测试，以找到合适的值，使构建的共表达网络具有无标度网络结构。最终，选择4作为最佳软阈值，使网络的拓扑结构与实际生物学关系最一致。随后，我们通过测量基因表达相似性、计算拓扑重叠矩阵和进行层次聚类分析来探索共表达网络中基因模块之间的关系。使用树状图可视化共表达网络的层次结构（图1b）。此外，相关性分析显示了每个模块与所有其他模块之间的相关性强度（图1c）。通过和谐校正的模块特征基因（hME）确定不同临床阶段的模块特征值，结果显示只有M2模块的hME值随着临床阶段而增加（图1d）。接下来，我们获得每个模块中具有代表性表达模式的基因（模块特征基因），并计算每个基因与模块特征向量的相关性（模块连接性，kME）。我们使用连接图可视化模块内基因之间的关系（图1e）。进一步分析发现，GSEA功能富集了M2模块内的所有基因，表明与糖酵解、mTORC1信号传导、HIF1α靶向和其他途径呈正相关，而与柠檬酸(TCA)循环和呼吸电子传递呈负相关（图1f、g）。这些发现表明，糖酵解在导致RCC预后不良和耐药性方面起着关键作用。![]()
图1. scRNA-seq发现了RCC预后不良和耐药性的关键模块。
2. 糖酵解相关基因DEPDC1与KIRC的恶性进展和耐药性有关我们知道糖酵解在肾细胞癌的不良预后和耐药性中起着至关重要的作用，因此我们进一步研究了肾细胞癌与糖酵解之间的联系。通过对TCGA-KIRC进行差异表达分析，我们鉴定出4687个上调的差异表达基因(DEG)和4207个下调的DEG（图2a）。随后，我们通过将4687个上调的DEG与糖酵解基因集相交，专注于鉴定驱动肾细胞癌进展的糖酵解相关生物标志物。结果，鉴定出44个糖酵解相关基因(GRG)（图2b）。基于临床信息的单变量Cox回归分析显示，DEPDC1基因具有最高风险比（HR=3.023，p<0.001）（图2c）。Timer2.0数据库分析显示，与正常组织相比，DEPDC1在肿瘤组织中的表达水平更高，尤其是在KIRC中（图2d）。此外，高DEPDC1表达与KIRC患者的预后不良有关（图2e），GEPIA2数据库证实了这一发现。使用GDSC数据库的基因组学探索DEPDC1表达与晚期RCC一线治疗的TKI之间的关系，表明低DEPDC1表达组对舒尼替尼和帕唑帕尼的敏感性增强，与高表达组相比，IC50反应较低（图2f、g）。此外，UALCAN数据库显示，高DEPDC1表达与KIRC患者的淋巴结转移、高肿瘤分级和晚期癌症分期相关（图2h-k）。为了探究糖酵解相关基因DEPDC1与肾细胞癌糖酵解之间的联系，我们根据DEPDC1表达水平将图1a中的所有恶性细胞和TCGA-KIRC中的患者分为高组和低组。GSEA显示DEPDC1高表达与糖酵解呈正相关，与氧化磷酸化呈负相关（图2l，m）。最后，我们根据DEPDC1的平均表达评估了TCGA患者的体细胞改变（高组，n=160；低组，n=160）。先前对肾细胞癌研究的基因变化如图2n所示。BAP1、MUC16和MTOR在DEPDC1高组和低组中表现出差异（图2n）。这些结果表明，糖酵解相关基因DEPDC1可以作为KIRC患者预后不良和病情进展迅速的预后标志物，可能影响耐药性并增强RCC的糖酵解。![]()
图2糖酵解相关基因DEPDC1与KIRC的恶性进展和耐药性有关。
3. DEPDC1增强RCC细胞的增殖、迁移、侵袭和皮下肿瘤形成能力为探讨DEPDC1对RCC恶性生物学行为的影响，我们以HK-2为对照组，qRT-PCR和Westernblot检测发现，DEPDC1在RCC细胞中普遍表达较高，尤其在OS-RC-2和786-O细胞中表达较高，而A498和ACHN细胞中DEPDC1表达水平较低（图3a、b）。构建DEPDC1敲低细胞（OS-RC-2和786-O）和DEPDC1过表达细胞（A498和ACHN），qRT-PCR和Westernblot检测DEPDC1的表达效果（图3c、d）。通过CCK-8细胞增殖实验、Transwell迁移和侵袭实验检测DEPDC1表达对RCC细胞增殖和侵袭的影响。结果显示，DEPDC1敲低组RCC细胞增殖、迁移和侵袭能力显著降低（图3e、f），而DEPDC1过表达组RCC细胞增殖、迁移和侵袭能力显著升高（图3g-l）。随后我们利用A498细胞（Vector和OE-DEPDC1）构建裸鼠皮下肿瘤模型，探讨过表达DEPDC1对体内RCC细胞生长的影响。结果显示，与Vector组相比，OE-DEPDC1组皮下肿瘤较大，生长速度较快。两组裸鼠体重无明显变化。IHC染色显示OE-DEPDC1组肿瘤细胞核中DEPDC1的表达高于Vector组（图3m-q）。综上所述，这些结果表明DEPDC1促进RCC细胞的增殖、迁移、侵袭和皮下肿瘤形成能力。
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图3. DEPDC1促进RCC的恶性进展。
4. DEPDC1与RCC的耐药性相关并增强糖酵解为了研究敲低DEPDC1是否可能逆转RCC对舒尼替尼的耐药性，我们利用CCK8检测法建立了舒尼替尼耐药的786-O细胞(786-O-R)（图4a）。Westernblot分析显示，与其他RCC细胞和HK-2细胞相比，786-O-R细胞中的DEPDC1蛋白水平升高（图4b）。qRT-PCR和Westernblot证实了786-O-R细胞中的DEPDC1敲低（图4c）。随后的CCK8检测表明，与si-NC组相比，DEPDC1敲低抑制了786-O-R细胞的增殖（图4d）。Transwell试验进一步显示，与si-NC组相比，敲低DEPDC1（si-DEPDC1#1和siDEPDC1#2）的786-O-R细胞的迁移和侵袭能力降低（图4e、f）。使用qRT-PCR和蛋白质印迹法验证了OS-RC-2、786-O和786-O-R细胞中稳定的DEPDC1敲低（图4g、h）。此外，我们还检查了细胞培养上清液中的代谢物含量。在DEPDC1敲低或过表达的RCC细胞中测量了葡萄糖消耗、丙酮酸生成和乳酸生成，结果显示DEPDC1敲低后糖酵解活性降低，而DEPDC1过表达后糖酵解活性增加（图4i-n）。这些发现共同表明DEPDC1在RCCTKI耐药性和促进糖酵解中发挥了作用。![]()
图4. DEPDC1与耐药性相关，并增强RCC中的糖酵解。
5. DEPDC1通过AKT/mTOR/HIF1α通路调控RCC糖酵解DEPDC1是一种糖酵解相关基因，已被证明能促进口腔鳞状细胞癌(OSCC)的进展，预测RCC的进展和预后，并可作为肝细胞癌(HCC)预后风险的预测因子。然而，DEPDC1增强肿瘤糖酵解的具体分子机制尚未完全阐明。为了研究DEPDC1调节RCC糖酵解的分子机制，我们在786-O细胞(sh-NC和sh-DEPDC1组)中进行了转录分析。火山图显示的DEG如图5a所示。后续的GSEA结果表明，这些DEG主要参与调节葡萄糖代谢过程、丙酮酸代谢过程和缺氧反应等过程（图5b）。结果发现，高表达DEPDC1组糖酵解、缺氧、PI3K/AKT/mTOR通路以及丙酮酸转运受到正向调控，而氧化磷酸化和TCA循环通路受到负向调控（图5c、d）。进一步分析了DEPDC1敲低对参与糖酵解调控基因的影响。图5e中的热图显示了与糖酵解和TCA循环相关基因的相对表达量。敲低DEPDC1导致ALDOA、LDHA、LDHB、PFKFB2、PFKM和PGAM1基因下调，这些基因与糖酵解有关，而IDH2、OGDH和SDHA基因上调，这些基因与TCA循环有关（图5f）。GEPIA2数据库分析结果显示，与正常组织相比，KIRC中糖酵解关键酶（ALDOA、ENO1、GLUT1、GLUT3、HK-2、LDHA、PDK1和PKM）的表达显著增加。此外，这些酶与DEPDC1表现出很强的相关性。为了研究VHL突变引起的敲低效应是否也增加了ccRCC的TKI耐药性，并且786-O-R细胞中糖酵解代谢物的差异更为显著。具体而言，图5h中糖酵解代谢物和TCA循环代谢物的改变具有统计学意义。根据转录组测序的结果，我们通过蛋白质印迹分析研究了DEPDC1如何调控RCC糖酵解。结果显示，敲低DEPDC1导致p-AKT、p-mTOR、HIF1α、HK2、PKM2和LDHA的蛋白表达显著降低，而过表达DEPDC1则导致这些蛋白的表达显著增加（图5i）。总之，DEPDC1通过AKT/mTOR/HIF1α通路作为RCC糖酵解的正调节剂。![]()
图5. RNA-seq和非靶向代谢组学研究显示，DEPDC1正向调节RCC中的糖酵解。
6. DEPDC1与不良预后相关并可预测RCC转移为了进一步探索DEPDC1在RCC进展中的意义，我们进行了一项涉及两个队列（TMA30，n=28；TMA2021，n=70）的研究。使用H评分对TMA2021队列进行定量分析显示，与癌旁组织相比，肿瘤组织中的DEPDC1表达更高（图6a、b）。随后，我们根据临床数据对合并队列（TMA30+TMA2021）进行分层，并观察到转移（图6c）、晚期肿瘤分期（图6d）和高Fuhrman分级（图6e）患者的H评分更高。对TMA30队列进行5年OS的ROC分析确定了DEPDC1H评分的最佳截止值为182.5，AUC为0.8353（图6f）。使用K-M生存图进一步分析表明，高DEPDC1表达组患者的OS和PFS均较短（图6g、h）。多变量Cox列线图分析证实DEPDC1表达是RCC患者OS和PFS的独立风险因素（图6i）。总之，我们的研究结果表明DEPDC1与不良预后密切相关，可以作为RCC转移的有价值预测因子。![]()
图6. DEPDC1 预测我们临床队列中RCC的不良预后和转移。
结论：
利用scRNA-seq揭示了糖酵解在RCC的不良预后和TKI抵抗中起着重要作用。此外，多组学分析发现DEPDC1可以通过AKT/mTOR/HIFα通路促进RCC糖酵解和TKI抵抗。临床结果表明，DEPDC1高表达与RCC患者的不良预后和转移预测相关。总体而言，我们的研究提出了一种新的糖代谢治疗靶点，用于治疗晚期TKI耐药RCC患者。参考文献：
Di SC, Chen WJ, Yang W, Zhang XM, Dong KQ, Tian YJ, Sun
Y, Qian C, Chen JX, Liu ZC, Gong ZX, Chu J, Zhou W, Pan XW, Cui XG. DEPDC1 as a
metabolic target regulates glycolysis in renal cell carcinoma through
AKT/mTOR/HIF1α pathway. Cell Death Dis. 2024 Jul 27;15(7):533. doi:
10.1038/s41419-024-06913-1. PMID: 39068164; PMCID: PMC11283501.![]()
生信分析：scRNA-seq、RNA-seq及分析
常规分子实验：qRT-PCR，免疫组织化学（IHC)
细胞实验：细胞培养、CCK8、Transwell
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谢谢！
课题设计与申报|分子生物学实验|细胞功能|机制调控|多组学检测分析
