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目前缺乏包括主要肾脏区域的大规模多模式图谱。在这里，作者采用了同时高通量单细胞ATAC/RNA测序（SHARE-seq）和空间分辨代谢组学来分析来自不同肾脏解剖区域的54个人类样本。作者生成了446267个细胞的转录组和401875个细胞的染色质可及性谱，并开发一个软件包来分析408218个空间分辨代谢组。作者发现，相同的细胞类型，包括髓袢和主要细胞的细支和粗升支，根据解剖位置显示出不同的转录组学、染色质可及性和代谢组学特征。调查代谢相关基因谱显示，肾单位段之间的代谢特征不重叠，患病近端小管（PT）细胞中的脂质代谢失调。将多模式组学与临床数据相结合，确定PLEKHA1为疾病标志物，其体外敲除增加了PT分化中的基因表达，表明其可能的致病作用。这项研究强调了人类肾脏解剖结构中以前未被充分表征的细胞异质性。该研究于2024年5月发表在《Cell Metabolism》，IF 27.7分。技术路线：
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主要研究结果：
1人肾样本采集和研究概述
肾皮质包括位于肾包膜下的肾脏外部区域。肾髓质被肾皮质包围，由三角形的肾金字塔组成。锥形乳头位于肾金字塔的顶端，伸入输尿管（图1A和1B）。在这里，作者从多个解剖区域获得了成人肾脏样本，包括皮质、髓质、乳头、肾动脉和输尿管（图1B）。为确认样本解剖的准确性，对五个解剖区域的相同组织切片进行了过碘酸希夫（PAS）和三色组织学染色（图1C）。正如预期的那样，肾小球仅在肾皮质中观察到。肾小管跨越多个解剖区域，包括皮质、髓质和乳头，反映肾小管上皮细胞（TEC）的不同亚群。相比之下，肾动脉和输尿管中都可以发现平滑肌，这表明组织弹性很高。为在多模式和单细胞水平上研究这些解剖区域的潜在差异，作者采用SHAR-seq对48个肾脏样本（24个皮质、10个髓质、7个乳头、3个肾动脉和4个输尿管样本）中相同细胞的转录组和染色质可及性谱进行分析（图1D-1G；详见图2），并使用基于IMS的空间分辨代谢组学分析了6个肾脏样本。![]()
图1：人类肾脏的多模态和解剖分层单细胞图谱
2使用 SHARE-seq 进行转录和表观基因组分析
SHARE-seq采用分裂池条形码策略，能够在相同的细胞/细胞核中共同测量snRNA-seq和snATAC-seq读数。在SHARE-seq中，从冷冻组织中提取细胞核，固定，用Tn5转座酶转置，用生物素标记的聚（T）引物逆转录，然后进行三轮基于连接的96孔分裂池条形码（图1B）。初步结果显示，在将原始的SHARE-seq方案应用于人类肾脏时遇到了几个挑战，包括从这些原始样本中分离细胞核的产量低、Tn5转位效率不均匀以及基因检测灵敏度降低。因此，作者优化了这些主要程序中的每一个，包括使用过度活跃的Tn5变体（Mendeley数据）。通过这一优化方案，作者利用其样品复用能力，对每批SHARE-seq进行3-4个样品的分析，以高通量（每批50000个原细胞）完成了15批中48个样品的处理，试剂成本比商业化的10X Genomics多组试剂盒低20倍（两种模式每细胞0.01-0.02美元）。通过将同一样品的细胞组合成每种形态的伪细胞（Mendeley数据），进行伪批量分析以检查质量。计算snATAC-seq伪细胞的基因活性，作为染色质可及性谱的测量值，这些细胞与snRNAseq假细胞共包埋（图1D；Mendeley数据）。与不同解剖区域的样本之间的差异相比，该分析显示相同区域的样本间的差异较低（图1D），这一点通过单独分析snRNA-seq或snATAC-seq伪细胞得到了证实。相关性分析表明，与皮质相比，肾髓质和乳头的转录组相似性更高，肾动脉和输尿管样本之间的相似性也更高。作者发现肾皮质中SLC22A8（编码PT转运蛋白）、髓质和乳头中RNF24（特异于髓袢和远端肾）和肾动脉和输尿管样本中MYH11（平滑肌细胞标志物[SMCs]）的上调，证实了样本质量（图1E）。在样品解复用、双链体去除和质量控制（STAR方法）后，作者通过snRNA-seq测量了总共446267个单细胞转录组，平均每个细胞有3084个独特分子标识符（UMI）和1051个基因（图1F），这与目前对原发性肾组织的商业化检测相当。作者还处理了401875个单细胞开放染色质可及性谱，通过snATAC-seq测量，每个细胞平均有4729个片段和1866个峰（图1G）（Mendeley数据）。降维和无监督的单细胞聚类分析确定了snRNA-seq模块共有29个主要细胞簇，snATAC-seq模块有21个细胞簇（图1F和1G）。3 SHARE-seq多组学分析揭示人体肾脏解剖的异质性
该数据集的庞大规模和来自不同肾脏解剖结构的样本包含使作者不仅能对之前描述的人类肾脏的细胞类型/状态进行基准测试，例如表现出以VCAM-1（PT_VCAM1）表达为特征的促纤维化和促炎特征的近曲小管（PT）细胞状态，而且能够识别之前单细胞研究未深入检查的簇，包括髓袢细支（tL）、髓袢粗升支和主细胞（PC）亚簇以及多个成纤维细胞、SMC和尿路上皮细胞群（图1F和1G），它们都表现出不同的基因表达和基因活性特征（图2A和2B）。基因模块评分分析揭示了成纤维细胞和SMC中细胞外基质（ECM）编码基因的上调，通路活性推断表明成纤维细胞与内皮细胞中TGF-b通路活性较高，证实了之前的结果。生物术语富集分析表明SMC具有特异性肌生成活性，巨噬细胞具有炎症反应等免疫功能。作者首先分析每个解剖区域的细胞类型组成（图2C）。正如预期的那样，PT由肾皮质中的主要群体组成（图2C），肾小球细胞、远曲小管（DCT）和连接小管（CNT）主要存在于皮质中（图2D）。值得注意的是，B型嵌入细胞（ICB）主要在皮质中发现（占ICB的90.7%），而A型嵌入细胞在所有皮质、髓质和乳头中都有发现（图2C和2D），这与现有知识一致。髓袢细胞在髓质和乳头区高度丰富，SMC在肾动脉和输尿管中富集，尿路上皮细胞主要在输尿管中发现（图2C和2D）。作者的snRNA-seq聚类将Uro1和Uro2鉴定为两个独立的尿路上皮细胞簇，两者都表达最近一项研究中报告的标记物，包括各种尿斑蛋白和角蛋白基因（Mendeley数据）。作者发现Uro1细胞在输尿管样本中高度富集（图2C和2D），因此代表输尿管尿道上皮，但Uro2细胞在肾髓质和乳头中更为丰富（图2D），表明肾盂的身份。作者确认没有样本特异性细胞簇，所有分析在snRNA-seq和snATACseq聚类之间都有一致的结果（Mendeley数据）。接下来，作者分析了snRNA-seq和snATAC-seq读数均符合质量控制指标的细胞。在细胞身份匹配后，作者的snRNA-seq分析中还鉴定出近80.8%的snATAC-seq细胞（n=324701）。基因表达水平与这些细胞中相应的基因活性显示出很强的相关性。作者的snATAC-seq聚类分析中的细胞注释与snRNA-seq数据中的注释高度一致（图2E）。对324701个细胞进行加权最近邻（WNN）分析，对这两种模式进行综合分析，揭示了与snRNA-seq和snATAC-seq分析中鉴定的细胞聚集模式相同的模式，进一步验证了数据质量（图2F）（Mendeley数据）。WNN分析还使作者能够推测细胞类型特异性转录因子（TF）结合基序（图2G）。例如，HNF4A和HNF4G显示PT细胞特异性的基因表达和基序活性，在ICA和ICB中鉴定出FOXP1表达和基模活性上调，证实了之前在小鼠中的结果（图2G）。总的来说，作者展示了一个人类肾细胞图谱，该图谱能够识别肾脏解剖区域的转录组和表观基因组异质性。![]()
图2：SHARE-seq多组学分析可识别人肾的解剖异质性
4 髓袢细支的多模态表征
值得注意的是，除了上述特征明确的细胞类型外，作者的snRNA-seq和snATAC-seq聚类分析都鉴定出两个新的细胞簇（tL1和tL2）（图1F和1G），这无法与之前发表的关于人类肾脏的研究相联系。这两个簇的差异表达基因（DEGs）的富集分析显示包括肾管发育、肾单位小管上皮细胞分化调节和上皮细胞增殖在内的术语，表明它们是TEC。此外，这些细胞不表达TAL（如UMOD）和PC（如AQP2）的标记基因，与皮质相比，它们在肾髓质和乳头中高度丰富（图2C和2D），表明它们可能是髓袢细支的细胞，髓袢在髓质和乳头形成U形环。由于样本可及性，之前对人类肾脏的单细胞测序研究通常只分析来自肾皮质的样本，这在很大程度上解释了这些细胞在之前研究中的代表性不足。为进一步验证tL细胞的身份，作者利用一项已发表的RNA-seq对显微切割的大鼠肾小管（包括tL片段）分析（GSE56743）。作者发现，在作者的人类snRNA-seq数据中，tL1/2细胞中上调的基因也表现出tL细胞特有的表达模式，包括细降支（DTL）和细升支（ATL）。与最近发表的人类肾脏snRNA-seq数据集的整合也验证tL1/2细胞和DTL/ATL细胞之间的共聚类模式（Mendeley数据）。作者的数据集为探索tL细胞的转录组和表观基因组特征提供一个独特的机会。作者发现水通道蛋白1（AQP1）在PT和DTL中表达，但在ATL中不表达，在tL1中的基因表达高于tL2细胞，表明tL1和tL2细胞分别具有DTL和ATL特性。此外，作者鉴定出SATB2（特殊的富含AT的序列结合蛋白2）是tL1上调的DEG，SH3GL3（亲内素-A3）是tL2上调的DEE，SLC44A5（胆碱转运蛋白样蛋白5）在这两个簇中都有表达（图2A）。重要的是，这些基因还显示出相应细胞簇特有的基因活性（图2B），与其他细胞类型相比，作者观察到tL细胞启动子或基因内区域的开放染色质可及性更高（图2H；Mendeley数据）。胆碱转运蛋白样蛋白（SLC44家族）对磷脂代谢很重要，作者通过免疫荧光证实了SLC44A5蛋白的表达（图2I）。SLC44A5与UMOD和AQP2在肾髓质切片上的共染色显示，SLC44A5+小管不与肾髓质中的TAL和集合管细胞共定位，进一步证实其tL特性。该分析还表明，SLC44A5转运蛋白主要定位于tL细胞的基底外侧膜（图2I）。5通过IMS分析人体肾脏解剖结构
接下来，作者旨在利用基于IMS的空间分辨代谢组学研究不同人类肾脏解剖区域的独特代谢组学特征。最近的技术进步将其分辨率提高到10毫米像素大小，允许以接近单细胞分辨率进行代谢组学分析（每个“细胞”是指10毫米像素的代谢组）。在这里，作者使用MALDI方法（10 mm像素大小；正离子模式）（STAR方法）生成6个人体肾组织切片的IMS数据，共获得408218个空间分辨代谢组，检测到588个特征，主要包括代谢物和小分子（Mendeley数据）。这6个组织样本是：来自供体#1的一个外皮质、一个髓质、一个乳头（图1H），以及一个内皮质、包括皮质髓质交界处（CMJ）区域的一个髓质，来自供体#2的包括骨盆区域的另一个髓质（供体#1：健康对照；供体#2：急性肾损伤（AKI）），因此覆盖了沿肾皮质毛细血管轴的所有主要解剖结构。对每个IMS MALDI后切片进行PAS染色，以进行组织配准。尽管一些当前的平台（如METASPACE42）支持代谢物注释和基础数据探索，但目前还没有用于高级特征可视化、代谢组学聚类和综合多样本分析的开源软件包。因此，在这项工作中，作者首先开发了一个基于Python的包，作者称之为MALDIpy，它能够以单像素分辨率分析IMS数据（图3A）。与现有的空间组学Python包相比，在分析本研究的数据时，MALDIpy 的处理速度提高了10倍以上，同时消耗的内存更少。MALDIpy可以将簇投射回组织切片上，以便空间分辨的代谢组学簇可以与组织学染色共同配准。当用于分析多个样本时，该软件包对总离子计数和数据集成进行了线性归一化（STAR方法）。此外，作者根据人类代谢物数据库提供每种代谢物的蛋白质关联，以搜索代谢物和可能与代谢物相关的蛋白质之间的联系。使用MALDIpy，作者对408218个空间分辨代谢组进行降维和聚类分析，并确定了12个簇，每个簇都表现出独特的代谢组学特征（图3B和3C）。例如，簇#1显示一种鞘磷脂SM的高丰度（d18:1/16:0）（图3C），以前曾被报道为肾小球标记物。簇#10显示棕榈酰肉碱和油酰肉碱的特异性积累（图3C），这是脂肪酸b氧化的关键中间体，是肾PT细胞的标志。在组织切片上可视化代谢组学簇显示了不同肾脏解剖区域的不同代谢组学特征（图3D）（Mendeley数据）。作者结合两种方法进行聚类注释，方法是（1）手动调查每个聚类的差异特征，并通过文献检索检查细胞身份，或（2）将空间分辨的代谢组学聚类与组织学染色进行共配准。例如，通过与同一切片区域的PAS染色进行比较，作者发现簇#1清楚地表明了位于皮质的肾小球（图1H，左图；图3D，左图），簇#12仅存在于肾盂区域，表明其尿路上皮身份（图3D，右图）（Mendeley数据）。作者假设细胞类型特异性代谢特征也应反映在转录组水平，例如编码与感兴趣代谢物相关的酶的基因的独特表达。如上所述，SM（d18:1/16:0）在肾皮质的肾小球区域显示出特异性积聚（图3E；Mendeley数据）。CERS6（神经酰胺合酶6）可以将棕榈酰（C16:0）-辅酶A（CoA）转化为SM的前体神经酰胺（d18:1/16:0）（图3F）。正如作者的SHARE-seq数据所示，CERS6基因在肾皮质的足细胞中特异性表达（图3G）。除了SM（d18:1/16:0），作者还描述了一种磷脂酸PA（18:1（9Z）/15:0）作为另一种簇#1差异代谢产物，它仅存在于肾小球中，但在肾髓质和乳头中检测不到（图3H；Mendeley数据）。通过MALDipy，作者鉴定出CDP二酰基甘油合酶2（CDS2）是一种负责催化磷脂酸转化为CDP二酰甘油（DAG）的相关酶（图3F）。CDP-DAG是磷脂酰肌醇代谢的关键中间体，对正常肾小球形态和功能至关重要。CDS2在肾小球旁器（JGA）中高度丰富，也在足细胞中表达（图3G），作者通过人类皮质样本的免疫荧光验证其在肾小球中的蛋白质表达，特别是在JGA中的表达（图3J）。CERS6和CDS2的表达模式也得到了人类蛋白图谱（Mendeley数据）的证实。此外，作者鉴定出溶血磷脂酰胆碱LysoPC（22:4（7Z，10Z，13Z，16Z））是肾盂区域积累的簇#12标志物（图3I），相关酶溶血磷脂酶1/2（LYPLA1/2）都在尿路上皮细胞中特异性表达（图3F和3K），进一步验证了其簇的身份。因此，除了作者的SHARE-seq分析揭示的转录组和表观基因组异质性外，作者还进一步强调了人类肾脏解剖结构的代谢组学多样性，并证明MALDIpy可用于亚结构分辨率的IMS数据分析。![]()
图3：空间分辨代谢组学突出了人类肾脏的解剖异质性
6肾小管上皮细胞的转录组学和表观基因组特征
接下来，作者的目标是利用SHARE-seq多组学数据和空间分辨代谢组学数据来研究不同的解剖位置是否会导致不同的分子特征，即使对于相同的终末分化的TEC也是如此。在上述SHARE-seq分析中，作者发现相同TEC（tL、PC和TAL）的簇可以根据其区域位置进行分层（图1F和1G）。例如，TAL3细胞主要在皮质中鉴定，TAL2细胞主要来自髓质，TAL1细胞在乳头中最为丰富（图2D和S2A）。最近的snRNA-seq研究也报道TAL20和PC51细胞的区域特异性簇，但仍存在几个问题，包括差异转录组特征是否伴随着染色质可及性或代谢组学的变化，以及是否存在调节元件，如TFs，无论TEC类型如何，它们通常都是差异表达的。首先，作者通过对tL（图4A）、远端肾单位（图4B）和TAL细胞（图4C）的亚聚类分析证实，相同的TEC显示出不同的转录组特征，具体取决于解剖区域。作者确定了两个在髓质中高度丰富的tL亚群（tL-M1/2）和两个对肾乳头更具特异性的亚群（t L-P1/2）（图4A）。将这些细胞映射回整个SHARE-seq数据集表明，tL-M1/2和tL-P1细胞主要代表tL1细胞，tL-P2细胞大多来自tL2簇。这些亚群显示了基因的独特表达，例如tLM1/2和tL-P1中CD200的表达高于tL-P2细胞，乳头状tL中CA8（碳酸酐酶8）的表达高于髓质tL细胞（图4D）。作者发现tL细胞中这些基因的启动子或基因内区域的染色质可及性增加（图4E），表明存在差异表观遗传学特征。远端肾单位细胞的亚群分析显示，一组PC细胞在皮质和髓质中更为丰富（髓质PC，PC-M），另一组在乳头中更为富集（乳头PC，PC-P）（图4B），每一组都显示出独特的DEGs和一致的染色质可及性变化（图4D）。例如，两个IV型胶原编码基因COL4A3和COL4A4在人类基因组中具有头对头构象，作者发现这两个基因在启动子区域的染色质可及性增加，PC-P的基因表达高于PC-M（图4D）。最近的一项snRNA-seq研究报告了PC-P中RALYL（RNA结合Raly样蛋白）的表达较低，作者进一步发现，与PC-M相比，PC-P中该基因的染色质可及性降低（图4E）。使用类似的方法，作者分别定义肾皮质、髓质和乳头中的TAL细胞（TAL-C/M/P）（图4C）。与TAL-M和TAL-P细胞相比，TAL-C细胞表现出更高的PAPPA2表达，同时其启动子区域的染色质可及性增加（图4D、4E），这与之前对大鼠肾脏的研究一致。众所周知，位于不同解剖区域的TAL细胞具有不同的形态和代谢功能，如不同的离子重吸收偏好。因此，作者调查了TAL亚群之间鉴定的DEG中的离子转运蛋白相关基因。作者发现，与TAL-C细胞相比，TAL-M/P中的Ankyrin 2（ANK2）上调（q<0.0001）（图4F），并且髓质和乳头区的基因内染色质可及性也增加。Ankyrin 2对维持各种细胞类型中的血影蛋白-肌动蛋白细胞骨架和许多离子转运蛋白的膜稳定非常重要。作者通过将ANK2与UMOD共染色进行免疫荧光，UMOD是一种众所周知的TAL标记物，不考虑区域位置（Mendeley数据），并验证了ANK2在皮质UMOD+细胞中的低表达，但大多数髓质UMOD+电池共表达ANK2（图4G）。接下来，作者的目标是鉴定与肾脏区域特异性转录组和表观基因组特征相关的潜在转录因子。作者调查了上述tL、PC和TAL细胞亚群中的DEG和差异可及区域列表，并发现RUNX1（Runt相关TF 1）沿皮质毛细血管轴的基因表达增加，而与TEC类型无关（即tL-P比tL-M、PC-P比PC-M、TAL-P比TAL-M比TAL-C的表达更高）（图4D），以及基因内区域染色质可及性的一致变化。为进一步筛选可能塑造不同肾脏区域基因调控网络的TF驱动因素，作者利用一种最近描述的计算方法，该方法同时预测基因与顺式调控元件和TF的关联。TAL-P与TAL-M与TAL-C（图4H）、tL-P与tL-M以及PC-P与PC-M的分析均表明，RUNX1是维持这些TEC在不同解剖区域身份的调节性TF。由于TF与特定的基因组序列（即基序）结合以调节靶基因表达，作者进行snATAC-seq基序推断分析，并进一步验证与髓质或皮质相比，tL、TAL和PC细胞乳头中RUNX1基序活性的增加。总之，作者全面分析了三种TEC（tL、TAL和PC）的转录组和表观基因组图谱，并发现这些细胞根据区域位置显示出不同的特征。计算TF推理分析优先考虑RUNX1作为维持特定区域细胞身份的潜在调节驱动器。![]()
图4：tL、PC和TAL细胞具有不同的特征，具体取决于区域位置
7皮质和髓质粗升支细胞中不同的代谢组学特征
除了不同肾脏区域TEC中不同的转录组和表观基因组特征外，作者还询问区域位置是否也可能决定代谢组学特征。在这里，作者在IMS实验中使用的样本的连续组织切片上用免疫荧光法分别对TAL和PC细胞的两个标志物UMOD和AQP2进行共染色（图4I和图4J的第一行），以研究TAL和PC细胞是否存在区域依赖性代谢组学变化。作者发现，在作者的空间分辨代谢组学分析中，几乎所有AQP2+细胞都被注释为簇#5（棕色），而不管区域位置如何（图4J的前两行；用箭头标记），这表明不同解剖区域的PC细胞具有相对相似的代谢组学特征。另一方面，尽管大多数UMOD+TAL细胞在肾皮质中与代谢组学簇#5共定位，但在髓质中，它们主要由簇#7（蓝色）识别（图4J；用三角形标记）。作者在本研究中分析的所有6个样本（孟德尔数据）上证实了这一发现。例如，在覆盖CMJ区域的髓质组织上，第7簇代谢组在髓质比皮质区域更丰富。作者计算了簇#5和#7的差异特征，并鉴定出C45H78NO7PNa，一种磷脂酰乙醇胺PE（P-18:0/22:6），作为簇#5的特异性标记，以及作为簇#7标记的磷脂酰胆碱PC C42H80 NO8PNa（20:2/14:0）（图4K）。皮质样本中的TAL细胞表现出显著丰度的C45H78NO7PNa，而髓质TAL细胞则表现出显著更高丰度的C42H80NO8PNa（图4J的最后三行）。另一方面，AQP2+PC细胞始终表达C45H78NO7PNa，而与区域位置无关。尽管这两种代谢物很少被研究，但作者寻找了与这两类分子相关的潜在酶，这表明C45H78NO7PNa和磷脂酶D2（PLD2，优先利用磷脂酰乙醇胺）之间存在关联，C42H80NO8PNa和鞘磷脂合酶2（SGMS2，介导磷脂酰胆碱向神经酰胺的可逆转化）之间也存在关联。在作者的SHARE-seq数据中调查PLD2和SGMS2的表达表明，这两个基因在TAL-C中的表达均高于TAL-M细胞，在TAL-M中的表达高于TAL-P细胞，但PC-M和PC-P细胞之间的表达水平没有差异（图S4O），这进一步强化了基因与这两种代谢物之间的关联。总之，作者将作者的空间分辨代谢组学分析与TAL细胞的免疫染色相结合，表明皮质和髓质TAL细胞具有不同的代谢组学特征。8肾单位片段之间独特的代谢相关基因谱
作者假设每种肾细胞类型的独特转录组学、表观基因组学和代谢组学特征，包括位于上述不同解剖区域的TEC，应该与细胞中不同的代谢事件有关。为了使用作者的SHARE-seq数据以无偏见的方式调查所有潜在的代谢事件，作者利用最近一项研究中描述的方法，其中只保留与代谢过程相关的基因子集进行单细胞分析。基于446267个单细胞转录组，作者处理了总共2111个基因（基因列表改编自Reactome56数据库；可在Mendeley数据中获得），并通过保留88113个细胞和检测到的150多个基因进行第二步质量控制。作者将446267个细胞分析得到的注释投影到88113个细胞上（图5A；Mendeley数据）。有趣的是，作者能够用2111个代谢基因的这一子集对所有主要的肾细胞类型进行分层（图5A），除了极少数例外，包括DCT细胞与TAL细胞的相似性高于整个转录组水平（Mendeley数据）。每种肾细胞类型都呈现出不同的代谢相关基因特征，例如PT细胞中脂质代谢相关基因ACSM2A（一种酰基辅酶a合成酶）的独特表达，免疫细胞中CHST11（一种碳水化合物磺基转移酶）的表达高于其他细胞类型。对每种细胞类型的代谢相关DEG进行富集分析，确定这些细胞中独特且不重叠的代谢术语（图5B）。例如，除了FAO的高活性外，PT细胞还显示出参与糖异生的基因表达增加，如编码ALDOB的醛缩酶和编码磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的PCK1/2。tL细胞显示出与谷氨酰胺代谢和糖酵解相关的基因表达更高，支持最近一篇综述中总结的先前结果。糖酵解也是PC细胞的一个丰富术语，尽管有一组不同的基因，如PGK1（磷酸甘油酸激酶1）。重要的是，所有这些代谢基因也表现出统计学上显着的细胞类型特异性基因活性，如作者的snATACseq数据所示（图5C）。调查不同解剖区域的代谢评分表明，肾皮质中FAO和糖异生的活性较高，但肾乳头中糖酵解和谷氨酰胺代谢的使用增加（图5D）。在细胞类型水平上，作者鉴定出FAO和糖异生得分最高的PT细胞（图5E和5F）。另一方面，tL和PC细胞在肾髓质和乳头中高度丰富，它们都表现出较低的糖异生评分，但糖酵解和谷氨酰胺代谢的活性相对较高（图5G和5H），这解释了不同解剖区域的评分差异。用相同的基因列表重新分析显微切割的大鼠肾小管的RNA-seq数据也验证PT特异性FAO和糖异生基因的表达，并表明收集管是糖酵解和谷氨酰胺代谢活性最高的片段（Mendeley数据）。接下来，作者询问了在髓质/乳头丰富的tL和PC细胞中形成这种独特代谢基因特征的生理条件是什么。在皮质毛细血管轴上，氧压和渗透压存在显著梯度，导致渗透性细胞应激增加。因此，作者通过平均与渗透性细胞胁迫相关的基因表达来定义渗透性应激评分，并验证tL和PC细胞是得分最高的两种TEC类型（图5I）。髓质和乳头的渗透应激评分高于皮质（图5J）。对所有肾细胞类型的评分进行调查表明，尿路上皮细胞也表现出高活性的渗透应激。由于作者发现tL和PC细胞位于不同的解剖区域时具有不同的转录组和表观基因组特征（图4），作者想知道区域特异性特征和渗透性细胞应激之间是否存在相关性。作者根据上述亚聚类分析计算渗透胁迫评分，并证实PC-P的渗透胁迫评分高于皮质和PC-M，乳头状tL（tL-P1/2）的渗透胁迫得分高于髓质tL（t-M1/2）细胞（图5K）。由于tL和PC细胞之间代谢基因谱的高度相似性，作者接下来寻找在这两种细胞类型中普遍表达的代谢基因。作者发现SCCPDH（假定的糖精脱氢酶）在tL和PC细胞中特异性表达，在其他TEC中表达较低（图5L）。作者进行免疫染色，证实在肾髓质和乳头中，SCCPDH+细胞内颗粒主要位于AQP2+PC细胞（图5M）和SLC44A5+tL细胞（图5N）中，但在UMOD+TAL细胞等其他TEC中检测不到。总体而言，作者确定了肾单位片段中独特的代谢基因谱。作者的数据确定了tL和PC细胞中参与渗透性细胞应激的基因的高表达，并表明渗透性细胞胁迫可能与这些细胞中的区域特异性转录程序有关。![]()
图5：肾单位片段之间独特的代谢相关谱
9近端小管细胞中脂质代谢的多模态表征
脂质代谢在PT细胞中高度活跃，在肾损伤期间可能失调，这与不良的疾病结果有关。尽管脂质代谢在PT-细胞中的重要性已得到越来越多的研究，但目前尚不清楚PT细胞利用哪种特定的脂质物种，以及脂质代谢中涉及的转录组变异是否与表观基因组变化有关。在作者的空间分辨代谢组学数据中，作者发现一组PT代谢组（簇#10），其中长链酰基肉碱（LCAC）的丰度较高，包括棕榈酰肉碱和油酰肉碱（图3B、3C、6A和6B）。LCAC作为载体将相应的长链酰基辅酶A从细胞质运输到线粒体外膜，由肉碱棕榈酰基转移酶I（CPT1）催化，因此被认为是FAO的指标。作者在该数据集中检测到23种LCAC，作者发现它们中的大多数在PT簇中表现出特异性积累（图6C），如亚麻酰肉碱和十四酰肉碱。计算所有LCAC物种的平均丰度（即酰基肉碱评分）证实，LCAC积累是PT簇的独特特征（图6D）。在23个LCAC物种中，有18个特征显示PT集群的丰度明显高于其他集群（图6C）。18种LCAC物种的碳长度为19至25，可分为三类，饱和、不饱和和羟基化LCAC（图6E）。作者确定棕榈酰肉碱（23-C）和油酰肉碱（25-C，含一个双键）分别是最丰富的饱和和不饱和LCAC物种，羟基化LCAC的富集度相对较低（图6E）。在作者的SHARE-seq数据集中，作者鉴定了健康和患病状态下的PT细胞（PT_dediff和PT_VCAM1）（图1F）。这些细胞簇已被先前的研究所表征，并显示PT_VCAM1细胞中健康PT标记基因如LRP2的表达降低，损伤标记基因如VCAM-1的表达增加（图2A）。与最近的一项研究一致，联合多组学分析（STAR方法）的计算TF推断将PPARA和HNF4A确定为健康的PT促进TF，TCF12和NFAT5确定为驱动PT_VCAM1细胞状态的TF。在作者对2111个代谢基因子集的单细胞分析中，PT、PT_dediff和PT_VCAM1仍然可以在降维空间上清楚地分层（图5A），表明不同的代谢相关基因谱。作者通过2111个代谢基因的轨迹推断分析验证健康和患病PT细胞之间独特的代谢基因谱，并确定从PT到PT_VCAM1细胞的轨迹，PT_Dediff细胞位于两者之间（图6F）。作者发现，与PT细胞相比，PT_Dediff和PT_VCAM1中涉及FAO的基因，包括β氧化、ω氧化和FAO活性的调节，显著下调（图6G，左图）。基因模块评分分析还发现PT_VCAM1中的FAO活性最低，PT_Dediff细胞显示出中等FAO评分（图6H）。此外，在作者的snATAC-seq分析中，这些与粮农组织相关的基因在PT_VCAM1细胞中都表现出显著降低的基因活性（图6G，左图），表明染色质可及性存在差异（Mendeley数据）。例如，催化脂肪酸ω氧化的CYP4A11在PT→PT_VCAM1假时间上表现出基因表达降低，启动子区域的染色质可及性降低（图6I）。肿瘤坏死因子α（TNF-a）治疗可以通过激活核因子-kB（NF-kB）信号传导诱导PT细胞中VCAM-1的上调。与此一致，在作者的SHARE-seq分析中，与PT细胞相比，PT_VCAM1细胞显示出TNF-a/NF-kB信号复合物相关基因的表达增加，NF-kB通路活性增加（Mendeley数据）。因此，为验证VCAM-1上调的PT细胞中FAO受损的情况，作者用TNF-a治疗hTERT肾PT上皮细胞（RPTEC）。这显著增加NF-kB亚基基因NFKB1和RELB以及损伤标志物基因VCAM-1和HAVCR1的表达（图6J）。TNF-a治疗后，作者发现FAO基因如CPT1A、ACOX1和SLC27A2的表达显著降低（图6J）。作者使用Seahorse代谢测定法测量了实时耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），结果显示，在基线条件下，OCR 显着降低，但 ECAR 没有降低（图 6K），支持降低 FAO 活性。持续抑制FAO会导致PT细胞中脂质积累增加。在上述富集分析中，作者观察到与PT相比，PT_dediff和PT_VCAM1细胞中与脂质积累相关的生物学术语，包括脂质运输、脂滴定位和醚脂质生物合成，被激活，相关基因也表现出显著增加的染色质可及性，如基因活性所示（图6G，右图；Mendeley数据）。以类似的方式，作者定义了脂质积累评分，该评分在健康PT细胞中保持较低水平，但在PT_dediff和PT_VCAM1簇中升高（图6L）。作者发现FAAH2（编码脂质水解酶）和ABCC1/3（编码脂质ATP结合盒转运蛋白）的表达增加是假时间的函数，同时启动子染色质可及性增加（图6M和S6J）。接下来，作者询问基因表达的增加是否是脂质沉积增加的结果。作者最近将原发性人类RPTEC上的BSA共轭脂肪酸暴露描述为脂质积累的体外模型。因此，作者用BSA油酸/棕榈酸脂肪酸处理RPTEC，导致细胞内脂质显著增加，油红O（ORO）染色标记（图6N）。作者发现，在处理任一脂肪酸物种后，FAAH2和ABCC3的表达显著增加（图6O），在BSA油酸盐暴露后，ABCC1的表达增加（图S6L）。因此，细胞内脂质积累足以诱导其上调。总之，作者用空间分辨代谢组学鉴定了PT细胞中酰基肉碱物种的富集。代谢基因谱的转录组学和表观基因组分析显示，在患病的PT细胞状态下，脂质代谢失调，包括FAO减少和脂质积累增加。![]()
图6：健康和疾病中近端小管脂质代谢的调查
10临床数据整合发现新的致病候选基因
接下来，作者的目标是通过整合入组供体的临床数据，特别是血清肌酐和血尿素氮（BUN）水平等疾病指标，证明作者的SHARE-seq数据在转化应用中的使用。对具有明确分类（即健康对照、急性肾损伤或慢性肾病[CKD]）的供体进行分析。作者首先证实肾脏疾病与众所周知的疾病标志物表达之间的相关性。通过分析每个样本的PT细胞亚群，作者观察到与对照组相比，AKI或CKD供体中PT损伤标志物基因（HAVCR1、VCAM-1和TNIK）的表达显著增加，HNF4A等分化标志物的表达降低（图7A、7B）。与FAO相关的基因在CKD样本中的表达降低，支持作者之前的观点，即疾病中脂质代谢失调。作者发现HAVCR1和VCAM-1的表达水平与患者肌酐浓度呈正相关（图7C和7D），尽管与BUN水平没有显著相关性。胶原基因的表达随着供体年龄的增长而增加（图7E）。此外，AKI和CKD样本与ECM编码基因表达增加有关（图7F），作者发现CKD样本中成纤维细胞的比例增加，这与现有知识一致。接下来，作者的目标是鉴定对患病PT细胞的细胞状态转变可能重要的候选基因。通过交叉以下基因：（1）与对照样本相比，AKI/CKD上调；（2）与PT细胞相比，PT_VCAM1上调；（3）高肌酐水平（R 1.3 mg/dL）患者的表达明显高于低肌酐样本；（4）在线性回归模型中，作为肌酐水平的函数，表达明显增加（图7G），作者确定了13个符合所有标准的候选基因。在已发表的研究中，Liprin-b1（PPFIBP1）和PLEKHA169是两个与肾脏没有先前联系的基因（图7H）。通过免疫荧光染色，作者证实PPFIBP1的表达主要在肾皮质的PT中鉴定，在表达VCAM-1的PT细胞中其表达增加（Mendeley数据）。重新分析现有的微阵列数据集发现，与对照组相比，CKD患者（包括糖尿病肾病、局灶节段性肾小球硬化和狼疮肾炎）的PPFIBP1和PLEKHA1上调（Mendeley数据）。最近发表的单细胞研究调查进一步证实肾损伤小鼠模型和人类常染色体显性多囊肾病和糖尿病肾病（Mendeley数据）中PT细胞中PPFIBP1和PLEKHA1的上调。通过类似的方法，作者能够鉴定出在其他细胞类型如TAL和DCT中特异性表达的疾病相关候选基因（Mendeley的数据），进一步证明该单细胞人类肾脏图谱在转化研究中的应用。为进一步研究PPFIBP1和PLEKHA1在肾脏疾病进展中的潜在作用，作者对原代人RPTEC进行体外基因小干扰RNA（siRNA）敲低（图7I；Mendeley数据），并通过批量RNAseq分析细胞。与非靶向对照（siNT）相比，PPFIBP1和PLEKHA1 siRNA（siPPFIBP1/siPLEKHA1）处理分别降低PPFIPP1和PLEKHA1表达的88.0%和91.4%，证实基因敲除的成功。siPPFIBP1治疗导致448个基因显著上调，457个基因显著下调，siPLEKHA1治疗导致更广泛的基因失调（2062个上调基因和2022个下调基因）。siPPFIBP1对PLEKHA1的表达没有显著影响，但siPLEKHA1可以诱导PPFIPP1表达降低26.0%（图7J和7K）。siPPFIBP1处理后对DEGs的富集分析表明，脂质代谢过程（如PPARA、ACAT2、SPTLC2[丝氨酸棕榈酰基转移酶长链碱基亚基2]）和ECM组织中的基因表达增加，与凋亡信号传导和应激激活信号通路负调控相关的基因表达减少（图7J），表明PPFIPP1在脂质代谢和应激反应中的作用。另一方面，siPLEKHA1治疗导致与细胞增殖（如MKI67）、细胞周期调节和细胞分裂相关基因下调，而分化的PT标志物如HNF4A和SLC6A8以及参与缺氧反应的基因上调（图7K），表明在PT细胞中PLEKHA1敲除后具有促分化作用。接下来，作者研究TNF-a刺激损伤状态细胞中PPFIBP1/PLEKHA1敲除对siNT/siPPFIBP1/siPLEKHA1处理细胞的影响。作者发现，与siNT对照组相比，PLEKHA1敲除后HAVCR1和VCAM-1的表达显著降低（Mendeley数据），进一步支持PLEKHA1的致病作用，尽管CPT1A和ACOX1等FAO基因的表达没有显著变化。PPFIBP1敲低上调VCAM1和适度增加SPTLC2表达。尽管对HAVCR1、CPT1A和ACOX1的表达没有显著影响。因此，临床数据整合使作者能够鉴定与肾脏疾病相关的候选基因，作者的RNA-seq和体外分析表明，PLEKHA1可能是一个可能的治疗靶点，因为它的敲除可以增加PT分化中的基因表达，降低HAVCR1和VCAM-1的表达。![]()
图7：临床数据整合确定疾病进展中的靶基因
结论：
该研究将多模式组学与临床数据相结合，确定PLEKHA1为肾脏疾病标志物，其体外敲除增加了PT分化中的基因表达，表明其可能的致病作用。这项研究强调了人类肾脏解剖结构中以前未被充分表征的细胞异质性。参考文献：
Li H, Li D, Ledru N, Xuanyuan Q, Wu H, Asthana A, Byers LN, Tullius SG,
Orlando G, Waikar SS, Humphreys BD. Transcriptomic, epigenomic, and spatial
metabolomic cell profiling redefines regional human kidney anatomy. Cell Metab.
2024 May 7;36(5):1105-1125.e10. doi: 10.1016/j.cmet.2024.02.015. Epub 2024 Mar
20. PMID: 38513647; PMCID: PMC11081846.![]()
组学实验：代谢组测序
常规分子实验：SHARE-seq，snATAC-seq，snRNA-seq，免疫荧光，PAS染色，
Oil Red O染色，qPCR，基因敲低，RNA-seq
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谢谢！
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