本研究检测了线粒体自噬受体FUNDC1在四氯化碳（CCL4）诱导的肝损伤中的作用。CCL4处理诱导线粒体ROS过量产生和线粒体自噬过度激活。作者发现FUNDC1是引发铁死亡的罪魁祸首，而不是线粒体自噬激活的罪魁祸首，这为研究线粒体自噬之外的FUNDC1功能提供了新的见解。
FUNDC1通过其96-133个氨基酸结构域直接与谷胱甘肽过氧化物酶（GPx4）相互作用，促进GPx4从细胞质募集到线粒体。GPx4是一种硒酶，用于中和脂质氢过氧化物和铁凋亡。
GPx4通过线粒体蛋白输入系统-外膜转位酶/内膜转位酶（TOM/TIM）复合物进入线粒体，GPx4的降解主要通过线粒体自噬和ROS诱导的线粒体损伤，导致肝细胞铁死亡。该文章于2024年1月发表在《Journal of advanced research》。IF：11.4。
为了了解肝纤维化损伤可能的生物学过程和细胞信号通路，作者分析了GEO数据库（GSE55747）的数据。火山图显示在CCL4诱导的小鼠肝纤维化中FUNDC1和Pink1上调，GPx4下调（图1a）。对最高度调控的基因进行分层聚类，发现肝纤维化组和对照组之间存在“自噬”、“铁死亡”、“线粒体自噬”和“氧化磷酸化”等不同的表现模式（图1b）。GSEA结果显示，包括线粒体功能、氧化磷酸化和金属离子稳态在内的多生物过程可能在CCL4诱导的肝纤维化中发挥重要的调节作用（图1c）。同样，这些涉及铁死亡、线粒体组装和功能的术语在量化分子途径后也显示出显著差异（图1d）。此外，GSVA评分的部分相关结果表明，铁死亡与线粒体、线粒体复合体以及线粒体自噬密切相关（图1e）。这些分析强烈促进铁死亡，线粒体或线粒体自噬可能参与肝纤维化的进展。
为了研究FUNDC1在肝纤维化中的可能作用，作者测定了人肝组织和血清中FUNDC1的水平。作者的结果显示，肝纤维化患者肝组织中FUNDC1水平明显升高（图2a），与火山图分析（图1a）一致。接下来，腹腔注射CCL4建立小鼠肝纤维化模型。作者的结果表明，CCL4攻击小鼠肝组织中FUNDC1水平升高（图2b）。这些发现支持FUNDC1在人类和啮齿动物肝纤维化模型的肝组织和血清中的作用。
为了确定FUNDC1在肝纤维化中的可能作用，用CCL4或等体积的玉米油刺激FUNDC1-/-和WT小鼠。CCL4攻击显著上调FUNDC1水平，而FUNDC1-/-小鼠的肝组织中FUNDC1水平消失（图2c）。在WT小鼠中，CCL4攻击降低了存活率，FUNDC1消融明显减弱了这种影响，而FUNDC1基因敲除本身几乎没有影响（图2）。同时，CCL4刺激明显增加了WT小鼠的肝体重比，但消融FUNDC1会抵消这一影响，而FUNDC1缺乏本身几乎没有影响（图2e）。此外，CCL4攻击明显上调促炎标志物的水平，包括肿瘤坏死因子-α （TNF-α）、白细胞介素-6 （IL-6），这些标志物通过删除FUNDC1而得到缓解，而FUNDC1敲除本身几乎没有明显的影响（图2f、2g）。血清样本分析显示，CCL4处理小鼠的肝细胞损伤标志物ALT和AST水平显著升高。其作用被FUNDC1敲除而FUNDC1消融本身几乎没有影响（图2h）。为了评估FUNDC1基因敲除对CCL4诱导的肝纤维化的影响，作者检测了肝组织中包括α-平滑肌肌动蛋白（a-SMA）、胶原蛋白1和基质金属蛋白酶2 （MMP2）在内的纤维化标志物的mRNA水平。作者的数据显示，CCL4刺激上调了纤维化标志物，而FUNDC1消融对其影响是无效的，而FUNDC1消融本身的影响很小（图2i）。此外，与玉米油处理的小鼠相比，CCL4刺激小鼠的肝脏颜色更深，轮廓更差，纹理更细，对CCL4刺激的FUNDC1-/-小鼠的影响不太明显（图2j）。使用天狼星红和马松三色染色的组织学染色显示，CCL4刺激小鼠的组织结构广泛破坏，胶原沉积异常。FUNDC1消融术本身对肝脏形态学影响不大，但可以改善CCL4诱导的不良形态学改变（图2j-l）。这些结果表明，CCL4可引起肝损伤，这一作用可通过删除FUNDC1来恢复。这些结果支持FUNDC1在肝纤维化和肝损伤的发生和发展中的重要作用。考虑到使用细胞色素P450酶将CCL4还原为反应性中间体是CCL4毒性的先决条件，作者测定了细胞色素P450酶活性。作者的数据显示，CCL4攻击后细胞色素P450活性明显下降，FUNDC1基因敲除可以避免这种影响，而FUNDC1消融本身的影响很小。
认为铁死亡参与肝纤维化和肝细胞损伤。作者分析了人肝组织中GPx4和溶质载体家族7成员11 （SLC7A11）的水平，并注意到肝纤维化患者中GPx4和SLC7A11的下调（图3a-d）。为了研究铁下沉是否参与了FUNDC1消融对CCL4诱导的肝细胞损伤的保护，作者检测了肝组织中血清和肝组织中的谷胱甘肽（GSH）和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）、丙二醛（MDA）、油红O染色、铁以及铁下沉蛋白标记物GPx4和SLC7A11。作者的研究结果表明，CCL4刺激引起了明显的脂质过氧化和脂质沉积，GSH/GSSG比值、MDA和油红O染色证明了这一点，这些都是铁死亡的特征（图3e-f, 3i-j）。FUNDC1缺失减轻了CCL4引起的脂质过氧化和脂质沉积，但本身没有任何影响（图3e-f, 3i-j）。接下来，肝脏非血红素铁水平升高，而血清Fe2+水平在CCL4处理下降低，表明肝脏中游离铁超载，这是铁死亡的重要诱发因素（图3g-h）。FUNDC1缺失减轻了CCL4诱导的铁过载，尽管FUNDC1-/-和WT小鼠在没有CCL4刺激的情况下铁含量几乎没有差异（图3g-h）。GPx4和SLC7A11是两种重要的抗脂质过氧化的铁死亡生物标志物，它们的水平被CCL4下调，这表明铁死亡在CCL4诱导的肝损伤中起作用（图3k-1）。消融FUNDC1可上调GPx4和SLC7A11的水平，但对自身影响不大（图3k-1）。透射电镜（TEM）检查发现，CCL4处理的肝组织表现出明显的线粒体损伤，包括线粒体明显收缩或膨胀，线粒体嵴和线粒体膜完整性的丧失（铁死亡的标志），其影响因FUNDC1缺失而减弱（图3m）。为了了解CCL4对线粒体的影响，在体外（0.1% v/v持续12小时）对E47细胞（一种CYP2E1稳定过表达的HepG2细胞系，参与CCL4毒性的P450酶CYP2E1的生化和毒理学评估的重要模型）进行CCL4刺激后，分别使用荧光染料MitoTracker和TMRM检测线粒体形态和线粒体膜电位（MMP）。CCL4处理引起小鼠肝脏中ROS升高，这可以通过上调蛋白羰基水平来证明，而删除FUNDC1可以减轻这种影响（图1c）。MitoTracker和TMRM染色显示，CCL4引起线粒体分离和MMP崩溃，使用FUNDC1 siRNA （siFUNDC1）敲低FUNDC1 （FUNDC1 KD）可以逆转这种作用，而siFUNDC1本身没有任何影响。在E47细胞中使用MitoSOX对mtROS进行评估发现，CCL4促进了mtROS的产生，这一作用被FUNDC1缺失所抑制。此外，对脂质过氧化敏感的荧光团C11-BODIPY染色检测表明，CCL4攻击诱发了E47细胞的脂质过氧化，而FUNDC1消融消除了这种作用。不出所料，FUNDC1过表达加重了肝细胞损伤，伴严重铁凋亡（GPx4和SLC7A11下调）、脂质过氧化（GSH/GSSG比值、MDA生成和C11-BODIPY染色）、MTT细胞存活和线粒体损伤（MitoTracker和TMRM染色）。
为了进一步阐明FUNDC1缺乏对CCL4诱导的肝损伤的有益作用是否与铁凋亡有关，作者在E47细胞中使用铁凋亡诱导剂Erastin （10 μM, 24小时）。如图4a-d所示，Erastin通过下调SLC7A11和GPx4来开启铁死亡。通过MDA、GSH/GSSG和C11-BODIPY染色评估脂质过氧化。作者的数据显示，在E47细胞中，Erastin消除了FUNDC1敲低对CCL4诱导的MDA生成、C11-BODIPY荧光和GSH/GSSG比值的变化提供了保护。此外，MTT细胞存活结果显示，Erastin消除了FUNDC1敲低诱导的对CCL4的保护作用，而Erastin本身的作用很小。此外，MitoTracker和TMRM染色发现，Erastin逆转了FUNDC1敲低引起的对CCL4诱导的线粒体畸形和功能障碍的保护作用。综上所述，这些结果支持了FUNDC缺乏对CCL4诱导的肝细胞铁死亡的保护作用。
选择性自噬包括有丝自噬最近被认为以ROS依赖的方式与铁死亡相互作用。考虑到FUNDC1作为线粒体自噬受体的性质，作者在CCL4处理的小鼠和E47细胞中监测线粒体自噬。Western blot分析显示，肝组织CCL4激发后，线粒体自噬/自噬标志物包括FUNDC1、BNIP3和Parkin上调，TIM23下调（图2c），透射电镜下观察到更多的线粒体自噬体，表明线粒体自噬过度激活。不足为奇的是，FUNDC1缺失部分抑制了CCL4诱导的线粒体自噬的增加，而其本身几乎没有明显的影响（图5a-e）。为了评估参与CCL4暴露反应的主要自噬成分，在体外使用siRNA转染分别敲低FUNDC1、Parkin和BNIP3。Western blot和Mito-Keima荧光结果显示，与FUNDC1或BNIP3敲低相比，Parkin的敲低在更大程度上减轻了CCL4诱导的TIM23下调和Mitto-lc3ii、Mitto-p62以及Mito-Keima指数（Mito-Keima荧光强度561 nm与457 nm之比）的上调，这表明Pink1/Parkin在介导肝纤维化中有丝分裂的作用比FUNDC1或BNIP3更突出。为了探索GPx4下调的可能因素，在CCL4挑战和/或FUNDC1过表达的情况下，在溶酶体抑制剂氯喹（20 μM持续24小时）或蛋白酶体抑制剂MG132 （10 μM持续6小时）存在或不存在的情况下，重新检测GPx4水平。作者的研究结果表明，FUNDC1过表达加剧了CCL4诱导的GPx4降解，通过抑制溶酶体而不是蛋白酶体来减轻（恢复到接近控制水平）。为了进一步研究线粒体自噬在铁凋亡中的作用，作者在E47细胞中添加靶向Pink1/Parkin-和BNIP3-介导的线粒体自噬的线粒体自噬抑制剂oroxylin A （OA, 150 μM, 48小时）。作者的数据显示，oroxylin A抑制了CCL4处理的E47细胞中FUNDC1-OE的线粒体自噬，这可以通过下调Parkin和BNIP3以及上调TIM23来证明，而FUNDC1发生了细微的变化。有趣的是，oroxylin A逆转了FUNDC1-OE诱导的E47细胞中CCL4诱发的GPx4丧失的恶化（与SLC7A11的部分衰减相比）。Parkin敲低对线粒体自噬和铁噬相关蛋白（包括TIM23、SLC7A11和GPx4）的影响与oroxylin A处理的结果一致，尽管BNIP3敲低对TIM23和GPx4水平的影响最小。Oroxylin A也消除了FUNDC1-OE诱导的CCL4诱导的MDA生成和C11-BODIPY荧光的恶化，以及E47细胞中GSH-GSSG的下降。MTT细胞存活实验进一步支持了这一点，表明有丝自噬在CCL4诱发的细胞损伤中起着有害作用。MitoTracker和TMRM染色显示，Oroxylin A抵消了FUNDC1下调对CCL4诱导的线粒体畸变和MMP塌陷的有益作用。总之，这些发现表明Oroxylin A消除了FUNDC1过表达引起的对CCL4诱导的铁死亡的加重作用，表明有丝自噬在铁死亡中具有强制性调节作用。
鉴于作者的上述结果表明，在患有FUNDC1 OE的E47细胞中，GPx4在Oroxylin A诱导的作用中比SLC7A11有明显的应答，作者推测FUNDC1可能会影响GPx4。因此，将GPx4抑制剂RAS-选择性致死小分子3 （RSL3, 1 uM, 24小时）添加到FUNDC1敲低的CCL4处理的-E47细胞中。Western blot数据证实RSL3对GPx4的抑制作用（图4a-d）。然后，脂质含量检测显示，RSL3消除了FUNDC1敲低诱导的MDA生成和C11-BODIPY荧光抑制以及GSH消耗（图4e-f, h-i）。RSL3本身不影响脂质沉积和过氧化（图4e-f, h-i）。MTT实验表明，RSL3消除了在CCL4攻击下FUNDC1缺陷引起的细胞存活反应（图4）。MitoTracker和TMRM荧光结果显示，RSL3预处理消除了FUNDC1缺陷，对CCL4诱导的线粒体损伤（如线粒体分离和MMP崩溃）有有益的作用。此外，FUNDC1-/-小鼠腹腔注射RSL3 （2.5 mg/kg，每天1次，连续10天）。RSL3下调GPx4和SLC7A11的表达（对GPx4表达的影响更为明显）。肝重比和天狼星红染色（图4j- 1）、血清ALT和AST水平显示的肝损伤（图4m）、中性粒细胞浸润染色显示的肝脏炎症（图4n）均显示RSL3对FUNDC1消融对肝纤维化的保护作用无效。这些结果表明，GPx4的抑制消除了FUNDC1缺乏对CCL4诱导的细胞损伤的有益反应。
为了了解FUNDC1如何干扰铁死亡，使用免疫沉淀（IP）后的质谱法检测了FUNDC1可能的相互作用伙伴。在E47细胞中，带Flag标签的FUNDC1 （FUNDC1-Flag）在抗Flag抗体免疫沉淀前表达。LC-MS分析使用带有FUNDC1-Flag的特异性Co-IP回收GPx4和几种铁死亡蛋白（图5a）。结合GPx4对线粒体自噬抑制剂Oroxylin A的反应变化， FUNDC1可能通过与GPx4相互作用在铁凋亡中发挥调节作用。PRISM工具分析显示，FUNDC1和GPx4具有共同的直接结合结构基序。PRISM预测结果显示，FUNDC1和GPx4可能形成蛋白相互作用界面（图5b）。为了确认和进一步探索FUNDC1与GPx4之间的特异性相互作用，作者构建了FUNDC1的截断突变体，缺失2-47氨基酸片段（Delta-2-47 aa）、69-74氨基酸片段（Delta-69-74 aa）或96-133氨基酸片段（Delta-96-133 aa）（图5c）。在E47细胞中，用带有his标记的GPx4质粒转染带有flag标记的FUNDC1质粒的WT和截断变体。Co-IP分析显示，除了delta -96 - 133aa突变外，FUNDC1的WT和截断变体都与GPx4相互作用，这表明FUNDC1的96-133aa结构域在与GPx4的直接相互作用中起着必要的作用（图5d）。为了探究在FUNDC1完整或缺失的情况下，CCL4激发是否会影响GPx4的线粒体定位，采用免疫荧光染色法测定GPx4与线粒体的共定位。图中显示，CCL4促进GPx4与线粒体外膜蛋白TOM20的共定位，由于FUNDC1缺失而使其失效（图5e, 5i），表明CCL4促进GPx4的线粒体定位，可能是在线粒体膜蛋白FUNDC1的帮助下。为了了解FUNDC1在线粒体自噬和GPx4募集中的作用，作者检测了GPx4对FUNDC1与LC3B基序结合亲和力的影响（FUNDC1通过与LC3B相互作用调节线粒体自噬）。这一发现表明GPx4被FUNDC1募集可能会减少FUNDC1介导的线粒体自噬。
GPx4被FUNDC1募集到线粒体后发生了什么？据报道，FUNDC1与某些细胞可塑性蛋白相互作用，通过TOM/TIM复合物促进其线粒体易位，并利用线粒体基质内的降解系统进一步降解，从而揭示了FUNDC1的新功能类别。考虑到GPx4在CCL4挑战下下调，作者探索了FUNDC1是否通过TOM/TIM复合物降解导致GPx4线粒体易位。在E47细胞中，使用siRNA敲除TOM/TIM复合体的主要成员TOM20、TOM22和TOM70。用免疫荧光法检测了TOM20-、TOM22-或TOM70基因敲低对GPx4与线粒体基质蛋白热休克蛋白60 （HSP60）共定位的影响。作者的数据表明，TOM20-、TOM22-或TOM70的敲低分别阻碍了GPx4-HSP60的共定位（图6a-f）。对TOM20-，TOM22-或TOM70敲低或不敲低的E47细胞的线粒体进行Western blot分析显示，在CCL4损伤下，这三种蛋白质中的任何一种缺乏都会导致线粒体中GPx4含量的损失（图6g, h），但DMSO处理不会导致GPx4含量的损失。同时，细胞核内GPx4含量未受影响。这些发现表明，GPx4可能在CCL4攻击后通过FUNDC1募集到线粒体表面，通过TOM/TIM复合物进入线粒体，其中未受抑制的线粒体自噬（主要是Pink1/ parkin介导的）可能导致GPx4在CCL4攻击时降解（图6i）。
总之，作者目前的研究结果提供了新的见解，即FUNDC1对CCL4引起的肝纤维化具有有害作用。机械上，FUNDC1直接与GPx4结合并将GPx4招募到线粒体，通过TOM/TIM复合体促进GPx4线粒体进入，通过无抑制的线粒体自噬进行降解（图6i）。为此，特异性靶向FUNDC1、FUNDC1-GPx4轴或线粒体自噬应被视为治疗肝铁死亡和肝纤维化的一种有前景的策略。
Bi, Y., Liu, S., Qin, X., Abudureyimu, M., Wang, L., Zou, R., Ajoolabady, A., Zhang, W., Peng, H., Ren, J., & Zhang, Y. （2024）. FUNDC1 interacts with GPx4 to govern hepatic ferroptosis and fibrotic injury through a mitophagy-dependent manner. Journal of advanced research, 55, 45–60. https：//doi.org/10.1016/j.jare.2023.02.012
