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原发性肝癌（Hepatocellular
Carcinoma, HCC），全球癌症相关死亡率排名第三，发病率高、早期诊断困难、预后差。血管发生和重塑是HCC发展的重要特征，促进中晚期HCC转移，导致预后不良。然而，控制HCC新生血管形成的分子机制仍未完全阐明。TSPAN4是迁移体标志物，来自Tetraspanins（TM4SF）家族，该家族蛋白可以与自身和/或细胞表面分子结合的能力，形成富含Tetraspanin的微结构域（TEM）。TEM通过调节信号转导、粘附、迁移、增殖和分化，影响癌细胞迁移、侵袭、血管生成和上皮间质转化（EMT），从而促进肿瘤的发展。最近的研究强调了迁移体在创造有利于血管生成和增强血管形成的环境中的影响。鉴于血管生成在肿瘤转移中的重要作用，这些发现表明迁移体可能在肿瘤进展中起着重要作用。作者通过生物信息学筛选到TM4SF家族另一个成员——CD151，CD151与高侵袭性癌症细胞有关，其过度表达与各种癌症的预后不良相关。该研究揭示了CD151通过迁移体对癌细胞血管转移的显著影响，为进一步理解迁移体功能与肝癌血管转移提供了重要的见解，以及为迁移体这一新领域的研究提供了策略。该研究于2024年6月发表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF=11.4。技术路线：
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研究结果：
1.CD151影响肝细胞癌中迁移体的形成，并可作为其标志物
鉴于TSPAN4的潜在作用，研究者在LIHC（TCGA）、GSE1898（GEO）、LIRI（ICGC）和DepMap（HCC细胞系）数据集中探索了tetraspanin家族基因的mRNA表达数据，其中“CD151和TSPAN4”之间（相关系数|r|＞0.4），表明它们在癌症中的相关性增强（图1a和b）。已知CD151促进癌症细胞迁移和侵袭中的作用。数据集中CD151的差异表达和存活分析证实了其在肿瘤样本中的表达升高，与不良预后相应相关（图1c和d）。TSPAN4和CD151 mRNA在不同肿瘤中均高表达（图2a），CD151在各种组织中始终超过TSPAN4（图2b）。免疫荧光结果显示在HCCLM3细胞中，CD151-RFP与WGA Alexa 488染色重叠，证实了CD151在迁移体中的共定位（图2c）。为研究CD151与迁移体之间的关系，研究者通过RNA干扰技术对HCC细胞株HCCLM3和MHCC97H中的CD151进行敲降。qPCR和Western blot结果验证了敲降效率（图2d-g）。WGA Alexa 488染色显示，CD151敲除细胞中迁移体显著减少（图2h）。综上，在癌细胞中CD151的表达对迁移体的产生至关重要，CD151可以作为该细胞器的标记物。![]()
图1 肝癌中Tetraspanins家族蛋白相关性分析
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图2 CD151的表达影响迁移体的发生
2.CD151的表达可能通过迁移体影响癌症细胞的侵袭性
CD151对迁移体动力学的精确影响及其对肝癌细胞侵袭性的影响尚不清楚。研究者使用五种不同的细胞系（HCCLM3、MHCC97H、HepG2、Hep3B和Huh7），通过划痕试验评估了它们的迁移能力。结果显示，HCCLM3和MHCC97H迁移和侵袭能力最强（图3a和b）。此外，HCCLM3和MHCC97H中CD151和迁移体标记物（TSPAN4、TSPAN7、EOGT和整合素α5）呈现高表达（图3c）。这一观察结果使研究者假设，具有高度侵袭性的癌症细胞可能表达更丰富的迁移体。为了验证这一假设，首先构建了CD151表达降低的稳定细胞系（HCCLM3-CD151sh和MHCC97H-CD151sh），qRT-PCR验证敲降效率（图3d）。随后的划痕试验表明，与各自的对照组相比，HCCLM3-CD151sh和MHCC97H-CD151sh细胞的迁移率、侵袭能力显著降低（图3e和f）。共聚焦和电镜观察进一步证实了HCCLM3-CD151sh和MHCC97H-CD151sh细胞中迁移体发生的显著下降，与侵袭性的整体下降相一致（图3g）。因此，这些发现支持“CD151表达显著影响迁移体生成和癌细胞侵袭性”的假设。![]()
图3 CD151与癌细胞迁移和侵袭能力的相关性
3.迁移体作为定位信号，影响和调节癌症细胞的侵袭
癌症细胞产生迁移体与其侵袭潜力之间具有相关性，接下来研究者对迁移体通过细胞间转移的侵袭机制进行探索。研究者共培养HCCLM3-TSPAN4-GFP细胞和Hep3B-TSPAN4-RFP细胞在共聚焦显微镜下连续捕获图像，观察到HCCLM3-TSPAN4GFP细胞产生的迁移体被邻近的Hep3B-TSPAN4-RFP细胞吞噬（图4a）。为了更好地了解细胞如何定位迁移体，研究者从高度侵袭的HCCLM3细胞中分离出这些囊泡，并通过透射电镜和WB分析证实了迁移体的存在，而不是外泌体（图4b）。在Transwell室下引入迁移体，并将侵袭性较弱的癌症细胞如MHCC97H-CD151sh、HCCLM3CD151sh、Huh7和Hep3B加入室中，结果显示细胞侵袭数量显著增加（图4c）。这表明，迁移体具有独特的信号定位效应，将细胞吸引向它们。为研究侵袭性较弱的肝细胞在吞噬迁移体后的变化，研究者分离高侵袭性HCCLM3细胞的迁移体并将其添加到腔室上方，使侵袭性较弱的Huh7和Hep3B细胞与CD151敲降的MHCC97H和HCCLM3吞噬迁移体。结果表明，Huh7和Hep3B细胞的侵袭性显著增强，同时MHCC97H-CD151sh和HCCLM3-CD151sh细胞在吞噬迁移体后的侵袭能力部分恢复（图4d）。因此，迁移体作为定位信号，影响和调节癌症细胞的特异性特征，特别是其侵袭性。![]()
图4 迁移体作为定位信号影响和调节癌症细胞的侵袭
4.CD151通过迁移体促进HCC迁移
为了评估CD151对体内肿瘤生长的影响，研究者采用了两种小鼠肿瘤模型。最初，将1×10^7 HCCLM3/MHCC97H Mock-luc或HCCLM3/MHCC97H-CD151sh-luc细胞皮下注射到BALB/c裸鼠体内。值得注意的是，与对照组相比，HCC97H-CD151sh治疗组体内肿瘤生长明显减缓，肿瘤体积减小（图5a）。随后，利用如上所述产生的肿瘤，研究者构建原位肿瘤模型，将约1 mm^3的肿瘤碎片植入裸小鼠的肝脏，肿瘤生长与肿瘤体积与皮下肿瘤实验的结果一致，CD151敲除显著阻碍了肝肿瘤的生长并减少了肿瘤体积（图5b）。肝切片染色显示，HCCLM3/MHCC97H Mock组小鼠的肝脏中存在大量迁移体样结构，而HCCLM3/MHCC97H CD151sh组则很少（图5c）。为了更清楚地观察组织中的迁移体，采用SEM检查了正常和原位肿瘤组织的小鼠肝脏。结果显示，对照组样品中存在大量的迁移体丝状结构和迁移体样结构，而治疗组样品的数量较少。迁移体样物质在正常组样本中很难捕获（图5c）。值得注意的是，对照组的小鼠中观察到可见的肺转移，而HCCLM3/MHCC97H-CD151sh组的肺组织没有显示出明显的肺转移。因此，CD151的高表达可以促进体内更多迁移体的产生，从而促进HCC细胞的迁移。![]()
图5 CD151对体内肝癌迁移体生成及肿瘤转移的影响
5.迁移体影响血管生成
为了揭示CD151促进癌症细胞中转移和侵袭特征的增强的机制，HCCLM3/MHCC97H-CD151sh治疗组与对照组细胞进行了高通量测序，进行差异表达分析，其中符合FDR|log2（FoldChange）|＞1和FDR＜0.05标准的基因被认为是显著差异表达的基因。随后，对HCCLM3和MHCC97H细胞的差异基因进行GO分析，根据p值＜0.01筛选出显著富集的结果。将两个细胞组富集的生物过程（BP）相交（图6a和b），18种BP中只有“血管生成”途径与癌症转移表现出一定的相关性。为了验证这些发现，研究者使用HCCLM3/MHCC97H CD151sh进行荷瘤实验。随着皮下肿瘤的生长，对照组表现出显著的血管生成，其特征是血管增厚，而CD151sh组虽然诱导血管生成，但产生的血管细长，明显不如Mock组突出（图6d）。因此，CD151明显增强癌症的血管生成。迁移体可以促进血管生成源于迁移体中VEGFA的显著富集。研究者假设，CD151影响迁移体的产生，从而影响癌症的血管重塑和新血管形成。通过Matrigel分析验证了迁移体在血管新生和血管重塑中的作用。将不同细胞中提取的迁移体引入不完全培养基中，HUVEC培养实验表明，添加迁移体赋予了培养基诱导HUVEC形成帽状结构的能力（图6c）。HCCLM3和MHCC97H对照形成的血管样结构以迁移体产生增加为特征，显著超过了迁移体较少、侵袭性较低的Hep3B和Huh7细胞系。相反，抑制HCCLM3/MHCC97H细胞中CD151的表达导致迁移体产生的实质性减少，并导致血管样结构长度缩短。为了更好地观察迁移体在体内促进血管生成和促进癌症转移的能力，在小鼠双侧大腿注射HCCLM3-CD151sh、MHCC97H CD151sh、Huh7和Hep3B细胞进行荷瘤实验。随后，从高度侵袭性细胞中提取的迁移体每五天在肿瘤一侧附近注射一次，而在对照侧仅注射PBS。在使用迁移体的一侧观察到血管明显扩张（图6e）。此外，这些细胞系用于在小鼠中建立肝癌原位模型，每五天将迁移体注射到一些小鼠体内。添加迁移体的HCCLM3/MHCC97H-CD151sh的肿瘤不仅看起来更大，而且伴有肺转移。虽然Huh7和Hep3B形成的肿瘤由于迁移体的作用而显著增大，但没有发生明显的肺转移，这可能是由于这两种细胞系的内在侵袭性较低（图6f）。因此，来自高度侵袭性肝癌细胞的迁移体可以促进癌症的血管生成和远处转移。先前的研究表明，迁移体中VEGF含量丰富，表明它们在体外毛细血管形成和血管重塑中起着关键作用。为了证实这一假设，将等量的不同细胞系培养约12-15小时，纯化迁移体，重新悬浮在等量的不完全培养基中，并进行ELISA实验。结果显示，对照组的VEGF含量最高（图6g），而Hep3B、Huh7、HCCLM3-CD151sh和MHCC97H CD151sh的VEGF含量明显较低。总之，高侵袭性的细胞系表现出CD151表达升高，产生更多的迁移体，VEGF表达更高，促进血管新生和血管重塑。
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图6 CD151的表达影响迁移体的产生，从而调节肿瘤血管生成
6.CD151和迁移体标志物与HCC的预后和远处转移有关
肝癌中高CD151表达与迁移体活性之间的相关性表明它们参与血管生成和远端转移。为了验证这种关联，研究者使用组织芯片检测了90名HCC患者肿瘤组织中CD151和CD31的表达。CD31是血管内皮细胞的标志物，反映了血管生成水平。研究者的研究结果表明，与邻近的正常组织相比，HCC组织中CD151和CD31基因的蛋白质表达水平显著升高，这表明癌症组织中CD151高表达与血管形成增加有关（图7a）。此外，根据临床数据，研究者将淋巴转移和远处转移归类为“转移”，而其余的则被视为“非转移”。研究者的分析显示，转移组CD151、CD31表达较高，表明CD151表达增加与远处转移之间存在相关性，并且转移组血管生成更大（图7b）。相关性分析得出CD31表达和CD151之间的系数r=0.46，表明高CD151表达与血管生成之间存在关系（图7d）。此外，生存分析揭示了癌症患者高CD31表达与不良预后之间的相关性。然而，由于样本量的限制，仅CD151表达不能预测HCC患者的存活率（P＞0.05）。尽管如此，总体趋势表明，CD151高表达的HCC患者的存活率较低（图7c）。为了全面评估迁移体和CD151表达之间的相关性，研究者检查了SpatialTME数据库(http://www.spatialtme.yelab.site)发现CD151在癌症空间转录组中的恶性肿瘤区表达最多，其次是边界区。这两个区域都表现出比非恶性区域更高的表达值。此外，使用基因集变异分析（GSVA）计算移行酶相关标记物（如TSPAN4、NDST1、CPQ、EOGT和TSPAN7）的表达，研究者观察到迁移体表达区域和CD151表达之间的重叠，两者在恶性肿瘤和边界区域均最高（图7e），表明癌症中CD151和迁移体表达之间有很强的相关性。总之，研究者的研究结果表明，CD151的表达反映了迁移体的定位，并与癌症血管生成和远处转移显著正相关。![]()
图7 CD151与CD31的相关性及HCC组织中迁移体的表达
结论
该研究根据临床样本的数据库分析，揭示了癌症中CD151表达和迁移体标记物TSPAN4之间的显著相关性。CD151的高表达水平与HCC患者的不良生存结果密切相关。CD151的表达影响迁移体的产生，促进HCC中血管生成。迁移体通过血液或体液增强细胞间的沟通和调节细胞功能，比单个细胞更能促进动态侵袭和转移，从而加剧肿瘤进展。参考文献
Zhang K, Zhu Z, Jia R, Wang NA, Shi M, Wang
Y, Xiang S, Zhang Q, Xu L. CD151-enriched migrasomes mediate hepatocellular
carcinoma invasion by conditioning cancer cells and promoting angiogenesis. J
Exp Clin Cancer Res. 2024 Jun 6;43(1):160. doi: 10.1186/s13046-024-03082-z.
PMID: 38840183; PMCID: PMC11155183.
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常规分子实验：WB、IF、IHC、RT-qPCR、电镜技术、RNA-seq、ELISA
细胞实验：细胞培养、细胞转染、细胞共培养、Transwell侵袭实验、划痕实验、趋化性实验
动物模型及病理分析：荷瘤实验、原位肿瘤模型构建
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谢谢！
课题设计与申报|分子生物学实验|细胞功能|机制调控|多组学检测分析
