该研究聚焦于非小细胞肺癌（NSCLC）治疗中的免疫逃逸和代谢重编程问题，特别是在肿瘤微环境中乳酸的积累及其引发的蛋白质乳酸化修饰。由于乳酸是肿瘤代谢特有的副产品，并且乳酸化修饰在肿瘤细胞中的赖氨酸残基上发生，这种新型的翻译后修饰可能对肿瘤进展和免疫疗法抵抗性有重要影响。研究背景强调了免疫检查点抑制剂在提升NSCLC患者生存率方面的潜力，同时也指出了患者对这些治疗产生抵抗性的挑战。因此，该研究旨在探索乳酸化修饰在肿瘤微环境中的作用，以及它如何通过调节免疫细胞和代谢途径来促进肿瘤的免疫逃逸和治疗抵抗。该研究于2024年7月发表在《ADVANCED SCIENCE》，IF=14.3。
通过采集NSCLC患者的正常组织和肿瘤组织样本进行总蛋白乳酸化质谱分析，研究人员发现肿瘤组织中非组蛋白乳酸化的种类和复杂性远高于组蛋白。通过非组蛋白乳酸化组学分析，他们确定了Kla基序，并验证了肿瘤中Kla位点普遍上调而非下调的现象。此外，通过细胞区室分析，发现39.58%的乳酸化蛋白位于细胞质中，这可能与细胞质中较高的乳酸含量有关。同时，35.41%的乳酸化蛋白位于细胞核中，在肿瘤组织中上调的乳酸化蛋白比例高于下调的。通过KEGG通路分析，研究人员发现上调和下调的乳酸化蛋白参与了多种生理和病理信号通路，但在遗传信息处理中，如翻译和转录，没有观察到下调的乳酸化蛋白，而在脂质代谢中下调的乳酸化蛋白数量超过了上调的，暗示了肿瘤组织中脂质代谢调节的复杂性。总的来说，研究揭示了具有不同亚细胞定位的非组蛋白乳酸化蛋白与多样信号通路的关联。
通过在乳酸处理的NSCLC细胞中观察游离脂肪酸（FFA）水平的变化，研究人员发现细胞外和细胞内的FFA水平显著增加。通过抑制CD36表达的实验，验证了细胞内FFA水平的增加主要是由于FFA的摄取，而非细胞内合成。总蛋白乳酸化组分析揭示了在碳水化合物代谢和脂质转运及代谢过程中乳酸化非组蛋白Kla的高表达水平。通过代谢组学研究，研究人员在乳酸处理的NSCLC细胞中鉴定了显著代谢差异，并识别了改变的小分子代谢物或信号通路。此外，研究人员通过评估H1299肿瘤细胞在乳酸处理后的FFA水平，验证了乳酸对脂质代谢的调节作用。通过敲除CD36的实验，发现细胞内FFA水平的增加主要是由于FFA的摄取。使用不同的抑制剂探索细胞外或细胞内乳酸对细胞外脂肪分解的影响，结果显示细胞内乳酸足以诱导细胞外FFA水平的增加。最后，通过应用针对乳酸转移酶的抑制剂，研究人员发现乳酸化蛋白在乳酸诱导的FFAs中是必需的，表明乳酸诱导的细胞外FFAs从甘油三酯（TG）释放依赖于乳酸化蛋白。
通过WB和质谱分析技术，研究人员发现APOC2是响应乳酸处理而乳酸化水平上调的唯一蛋白，且乳酸化发生在第70位赖氨酸（K70）。通过siRNA敲除技术，研究者验证了只有APOC2-Si能够抑制乳酸诱导的细胞外FFAs的增加，而APOA1-Si或APOA2-Si则不能。通过与脂蛋白脂肪酶（LPL）形成复合体的分析，研究人员揭示了APOC2在促进甘油三酯（TG）水解和产生细胞代谢所需的FFAs中的作用。通过敲除APOC2的实验，发现细胞外FFA水平没有被诱导，而APOC2过表达后细胞外FFA水平增加，表明乳酸诱导的细胞外FFAs释放依赖于APOC2。通过质谱分析，研究人员鉴定了APOC2的所有乳酸化位点，并发现K70是APOC2的唯一乳酸化位点。此外，通过产生乳酸化缺陷突变体（K到R）和在K70位点的突变体（K到E）的实验，观察到泛Kla抗体不能识别APOC2-K70突变体，但能识别APOC2-WT，进一步确认了K70是APOC2的乳酸化位点。最后，通过乳酸处理细胞的实验，发现乳酸增强了APOC2在K70位点的乳酸化，导致细胞外脂肪分解。
通过siRNA敲除技术，研究人员发现P300是APOC2-K70乳酸化的主要酶，它通过增强APOC2蛋白的稳定性来促进其积累。通过环己亚胺（CHX）和蛋白酶体抑制剂MG132的处理实验，观察到乳酸稳定了APOC2蛋白，而MG132则破坏了这种稳定性。此外，通过比较乳酸处理的APOC2-WT和乳酸化缺陷突变体APOC2-K70R的蛋白水平和降解速率，发现乳酸化有助于减少APOC2的泛素化，从而增强其稳定性。通过共转染实验，研究人员发现HDAC3作为APOC2-K70的去乳酸化酶，能够降低乳酸化水平。通过观察P300和HDAC3与APOC2的相互作用以及它们对APOC2乳酸化和乙酰化水平的影响，进一步证实了P300作为乳酸化酶和HDAC3作为去乳酸化酶的角色。此外，通过质谱数据分析，研究人员提出需要进一步探索APOC2的乳酸化和乙酰化之间的相互作用，以及SIRT1去乙酰化APOC2的能力。
APOC2-K70在TME中通过与脂蛋白脂肪酶（LPL）相互作用，促进甘油三酯（TG）的水解，从而释放游离脂肪酸（FFAs），为肿瘤细胞提供代谢所需的能量。这一过程在乳酸化APOC2-K70的工程细胞系中得到了验证，其中APOC2-K70R突变体在乳酸处理下无法与LPL相互作用，导致细胞外FFA水平显著降低，表明乳酸化的APOC2-K70是FFAs释放的关键。此外，乳酸化的APOC2-K70不仅促进了FFAs的释放，还与肿瘤细胞的迁移和转移密切相关。研究发现，APOC2-WT能够促进肿瘤细胞的迁移，而APOC2-K70R则没有这种效应。在细胞划痕和transwell实验中，添加FFAs能够增加APOC2-K70R肿瘤细胞的迁移能力。体内实验也显示，APOC2-WT能够促进肺转移，而APOC2-K70R则没有这种能力。这些结果表明，乳酸化的APOC2-K70通过促进FFAs的释放，增强了肿瘤细胞的代谢能力和迁移能力，从而促进了肿瘤的转移。这一发现为肿瘤治疗提供了新的靶点，特别是针对乳酸化APOC2-K70的干预策略，可能有助于抑制肿瘤的转移和扩散。
鉴于FFAs能够为Tregs提供代谢优势，研究者研究了乳酸化APOC2在延长Tregs存活中的作用。为了评估APOC2 K70突变对肺癌TME的免疫学效应，研究者建立了APOC2敲除挽救的WT和K70R突变型的LLC细胞。来自健康个体的PBMCs与APOC2-WT或-K70R癌细胞共培养。流式细胞术分析显示，与APOC2-WT细胞共培养后，CD4+ FOXP3+ Tregs的频率显著增加，而CD8+效应T细胞的频率降低。此外，体外添加FFAs导致与APOC2-K70R共培养的CD4+ FOXP3+ Tregs频率增加，表明乳酸化APOC2促进Tregs增加依赖于FFAs的释放。研究者进一步在体内实验进行验证，发现与APOC2-K70R肿瘤相比，PD-1单抗未能抑制APOC2-WT肿瘤的生长。与APOC2-WT肿瘤相比，APOC2-K70R肿瘤的肿瘤间质液中的FFAs也减少，表明乳酸化APOC2-K70促进了FFAs的释放。与APOC2-K70R肿瘤相比，APOC2-WT肿瘤中Treg细胞的频率增加，CD8+ T细胞的频率降低，导致Treg细胞与CD8+ T细胞的比例更高，Tregs的活性标志物（CTLA-4、GITR、LAG-3和OX-40）的频率更高。这些结果表明，APOC2在K70位点的乳酸化通过体外和体内促进FFAs的释放，导致NSCLC对免疫疗法产生抗性。
为了进一步评估APOC2-K70乳酸化水平的临床重要性，研究者从另外30名乳腺癌（BC队列）和30名胃癌（GC队列）患者中收集了数据,观察到APOC2蛋白水平与总非组蛋白Kla之间存在显著相关性，在肿瘤样本中的APOC2蛋白水平明显高于邻近正常组织。这一观察强调了APOC2蛋白水平与非组蛋白Kla聚集之间的关联。随后，研究者制备了针对APOC2乳酸化K70位点的特异性抗体，并确认了其有效性和特异性。这种纯化的APOC2乳酸化K70抗体能够准确检测内源性APOC2-K70乳酸化。这些结果证实了APOC2乳酸化K70抗体的可靠性和特异性。研究者使用这种抗体通过IHC在临床样本中探索APOC2-K70乳酸化与肿瘤转移或免疫疗法抵抗之间的关系。研究者发现APOC2-K70乳酸化主要定位在肿瘤细胞和细胞外空间，而不是免疫细胞或CAFs。通过对临床样本的分析，研究人员发现APOC2-K70乳酸化水平与肿瘤转移、分期和对免疫治疗的抵抗性显著相关。
研究者假设通过APOC2乳酸化K70位点抗体或FX11（一种LDHA抑制剂）抑制乳酸化APOC2-K70可能显著改善NSCLC的免疫疗效。先前的研究表明，FX11单独使用可以抑制肿瘤生长。然而，与抗PD-1抗体联合治疗的疗效尚不清楚。在LLC细胞植入后，在指定天数腹腔注射抗PD-1单抗、APOC2K70乳酸化抗体或FX11。与单独使用抗PD-1单抗治疗相比，使用抗APOC2K70乳酸化抗体或FX11和抗PD-1单抗联合治疗的肿瘤体积和重量显著减少。在用抗APOC2K70乳酸化抗体或FX11和抗PD-1单抗治疗的肿瘤中，肿瘤间质液中的FFAs减少,减少了Treg细胞的频率，导致Treg细胞：CD8+ T细胞的比率提高，以及在LLC肿瘤中增加了它们的活性标志物（CTLA-4、GITR、LAG-3和OX-40）的表达。这些结果表明，APOC2在K70位点的乳酸化在介导NSCLC中FFA的致癌效应中发挥重要作用，抗APOC2K70乳酸化抗体是肿瘤免疫疗法中的有效增强剂。
该研究揭示了NSCLC中乳酸化修饰的概况，并确定了乳酸化修饰的APOC2在促进细胞外脂解和免疫逃逸中的关键作用。研究发现，细胞内乳酸通过增强APOC2在K70位点的乳酸化修饰，稳定APOC2蛋白，导致游离脂肪酸释放，进而促进调节性T细胞（Treg）积累和肿瘤转移。此外，研究还开发了一种针对乳酸化APOC2-K70的抗体，该抗体与PD-1抑制剂联合使用时，能显著降低免疫治疗抵抗性，为NSCLC的免疫治疗提供了新的策略。
Chen J, Zhao D, Wang Y, Liu M, Zhang Y, Feng T, Xiao C, Song H, Miao R, Xu L, Chen H, Qiu X, Xu Y, Xu J, Cui Z, Wang W, Quan Y, Zhu Y, Huang C, Zheng SG, Zhao JY, Zhu T, Sun L, Fan G. Lactylated Apolipoprotein C-II Induces Immunotherapy Resistance by Promoting Extracellular Lipolysis. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul 9:e2406333. doi: 10.1002/advs.202406333. Epub ahead of print. PMID: 38981044.
