在大约70%的鼻咽癌（NPC）患者治疗失败中，远处转移是主要原因，但其背后的机制尚不明确。RNA 5-甲基胞嘧啶（m5C）是一种新兴的调控修饰，它控制基因表达并在肿瘤进展中发挥关键作用。然而，关于RNA m5C修饰在NPC转移中的潜在作用，目前信息甚少。在本研究中，我们发现m5C阅读器Aly/REF输出因子（ALYREF）在NPC中显著上调，其高表达与转移和预后不良相关。ALYREF过表达被发现能促进NPC细胞的肿瘤转移，在体外和体内实验中均得到了证实。从机制上讲，m5C修饰的NOTCH1 mRNA被鉴定为ALYREF的靶标。此外，ALYREF通过以m5C修饰依赖的方式增强其RNA稳定性，从而上调NOTCH1表达，进而促进NOTCH信号通路的激活，促进NPC转移。总的来说，我们的数据揭示了ALYREF在NPC转移中的关键作用，并为NPC提供了潜在的治疗靶点。本文于2024年8月发表于“Cell Death and Disease”（IF=8.1）上。
为了研究NPC中m5C相关基因的差异表达，我们分析了来自GEO数据库的三个微阵列数据集（GSE12452、GSE53819和GSE61218），比较了NPC和非NPC组织。我们发现NSUN2和ALYREF在NPC组织中显著上调（图1A）。进一步分析22个NPC和10个非NPC的临床组织样本发现，NSUN2和ALYREF在NPC组织中显著上调（图1B），与GEO数据集分析的结果一致。最近发现，NSUN2与NPC的远处转移相关，而RNA m5C阅读蛋白ALYREF在NPC中的功能和调控在很大程度上尚未被探索。因此，我们接下来检测了11个NPC细胞系和两个非恶性上皮细胞系中的ALYREF表达水平。qRT-PCR（图1C）和western blot分析（图1D）的结果确认了ALYREF在NPC细胞系中上调。这些结果提示ALYREF可能在NPC进展中发挥致癌作用。然后我们分析了192名NPC患者（161名无转移患者，31名远处转移患者）和22名非NPC人的鼻咽组织样本中的ALYREF蛋白水平。NPC组织中的ALYREF表达显著高于非NPC组织，而在远处转移患者的鼻咽组织中观察到ALYREF表达最高（图1E）。根据IHC结果，161名非转移性NPC患者根据ALYREF的中值评分（以8分为截断点）分为两组，将其分类为高ALYREF或低ALYREF。生存分析表明，ALYREF高表达的患者远处转移无病生存期（DMFS）和总生存期（OS）较短（图1F）。进一步分析表明，高ALYREF表达是NPC患者DMFS和OS的独立不良预后因素。此外，与仅肿瘤分期相比，ALYREF和肿瘤分期的结合为NPC患者的DMFS提供了额外的预测价值（图1G）。总之，我们的结果提示ALYREF的上调与NPC的远处转移和不良预后显著相关。
为了探索ALYREF在NPC中的功能，我们使用siRNA在SUNE1和SUNE2细胞中敲减ALYREF，之后进行了RNA测序分析。GSEA结果表明，敲减ALYREF抑制了与肿瘤转移相关的基因表达（图2A）。为了证实这些结果，我们在SUNE1和SUNE2细胞中敲减了ALYREF（图2B），并在HK1和HONE1细胞中过表达了ALYREF（图2C）。Transwell实验的结果显示，敲减ALYREF显著抑制了SUNE1和SUNE2细胞的侵袭和迁移能力（图2D）。相反，HK1和HONE1细胞中ALYREF的过表达增加了它们的侵袭和迁移能力（图2E）。此外，我们进行了CCK-8实验来检测ALYREF敲减和过表达对NPC细胞增殖的影响。此外，我们使用裸鼠肺转移异种移植模型来探索ALYREF在体内的功能。我们观察到ALYREF过表达组比载体对照组有更强的荧光素酶信号（图2F）和更多的转移性肺结节（图2G），表明ALYREF过表达促进了HONE1细胞的肺转移。总的来说，这些结果揭示了ALYREF在促进NPC转移中的关键作用。
为了探究ALYREF促进NPC转移的分子机制，我们对RNA-Seq数据进行了GSEA分析，结果显示ALYREF与Notch信号通路之间存在正相关关系（图3A）。由于之前发现NOTCH1能够增强NPC转移，我们假设ALYREF可能通过激活Notch信号通路来发挥其作用。然后我们在过表达了ALYREF以及载体对照组HONE1细胞中进行了Flag-RIP实验。ALYREF蛋白下拉显著富集了37倍的NOTCH1 mRNA（图3B）。值得注意的是，ALYREF的过表达增加了HONE1细胞中NOTCH1的蛋白和mRNA水平（图3C）。相反，ALYREF的敲减在SUNE1细胞中抑制了NOTCH1的蛋白和mRNA表达（图3D）。此外，Notch信号通路的下游靶标，如HES1和HEY1，在SUNE1细胞中ALYREF敲减后显著受到抑制，这一点通过qRT-PCR和western blot分析得到证实（图3E）。我们通过组织学染色验证了转移性肺异种移植的存在，并确认与对照条件相比，ALYREF过表达的荷瘤小鼠中NOTCH1蛋白水平升高（图3F，G）。为了确定NOTCH1抑制是否能逆转ALYREF表型，我们用50 mg/L的LY3039478处理了过表达ALYREF和对照的HONE1细胞，LY3039478是一种新的γ-分泌酶抑制剂，用于阻断NOTCH1信号通路。我们的结果显示，LY3039478处理显著消除了ALYREF过表达的HONE1细胞中侵袭和迁移能力的增强（图3H）。总之，这些结果表明ALYREF通过激活Notch信号通路促进了NPC转移。
作为一种m5C阅读器，ALYREF的生物功能依赖于目标mRNAs的m5C修饰。我们之前的研究发现表明，ALYREF可以与NOTCH1 mRNA结合并调节其表达。因此，我们假设NOTCH1 mRNA可能含有m5C修饰位点。在本研究中，我们使用RNA BS-Sanger测序方法鉴定了NOTCH1 mRNA的两个m5C修饰位点（位于chr9: 13939412和13939452位置）（图4A）。由于NSUN2和NSUN6之前已被确定为mRNA的m5C甲基转移酶，我们使用siRNA库（3种不同siRNA的混合物）在ALYREF过表达的HONE1细胞中敲减它们的表达（图4B，C），随后进行Flag-RIP实验。结果显示，NSUN2敲减显著降低了ALYREF在NOTCH1 mRNA上的富集比例，而NSUN6敲减没有观察到这种效果（图4D）。同样，NSUN2敲减显著降低了抗m5C抗体在NOTCH1 mRNA上的富集比例（图4E）。为了进一步确认NOTCH1 mRNA上的m5C修饰位点，我们通过克隆含有两个潜在m5C位点的等长片段或在这两个潜在位点进行C→G突变得到的突变片段，构建了编码特异性突变或野生型NOTCH1 mRNA的质粒。Flag-RIP实验的结果表明，ALYREF蛋白下拉含有比突变对照更多的野生型NOTCH1 mRNA（图4F）。为了监测ALYREF对NOTCH1 mRNA半衰期的影响，将ALYREF过表达和对照HONE1细胞用RNA合成抑制剂放线菌素D处理。qRT-PCR分析的结果表明，ALYREF过表达增加了NOTCH1 mRNA的稳定性（图4G）。为了进一步确定ALYREF对NOTCH1 mRNA表达的调控是否需要m5C修饰，我们分别用ALYREF质粒和野生型或突变型NOTCH1质粒共转染293 T细胞。我们发现，与突变对照转录本相比，ALYREF显著增加了野生型NOTCH1转录本的表达水平（图4H），这表明ALYREF促进NOTCH1表达可能依赖于m5C修饰和ALYREF的直接结合。总的来说，我们的结果表明ALYREF与NOTCH1 mRNA相互作用，并以m5C依赖的方式增加了其稳定性。
为了确定NPC组织中ALYREF和NOTCH1表达水平之间的关系，我们进行了免疫组化检测，以测量来自NPC的FFPE样本中相应的蛋白水平。IHC分析显示NOTCH1与ALYREF(图5A)和NSUN2蛋白水平高度相关(图5B)。此外，我们利用公开的鼻咽癌组织RNA谱数据(HRA000035)分析了ALYREF和NOTCH1在mRNA水平上的关系，发现NPC组织中ALYREF的mRNA表达水平与NOTCH1表达水平呈正相关(图5C)。这些数据强烈提示m5C修饰可调节NPC组织中的NOTCH1。根据我们的数据，我们提出了NPC细胞中RNA m5C修饰的工作模型，如图5D所示。在该模型中，NSUN2介导NOTCH1 mRNA的m5C修饰。随后，ALYREF作为一种读取蛋白，识别m5C修饰的NOTCH1 mRNA以维持其稳定性。最后，NOTCH1蛋白水平升高通过激活Notch信号通路促进转移。基于这些发现，ALYREF可能作为NPC预后的有用生物标志物，并可能指导NOTCH1抑制剂LY3039478在临床实践中的使用。
ALYREF是鼻咽癌中一种新的致癌基因。研究发现，ALYREF的上调与鼻咽癌患者的转移和不良预后有关。在鼻咽癌细胞中，ALYREF通过m5C依赖的方式激活NOTCH1来促进转移。重要的是，我们的研究结果强调了ALYREF作为使用LY3039478治疗鼻咽癌的潜在生物标志物和治疗靶点。
Jin Y, Yao J, Fu J, Huang Q, Luo Y, You Y, Zhang W, Zhong Q, Xia T, Xia L. ALYREF promotes the metastasis of nasopharyngeal carcinoma by increasing the stability of NOTCH1 mRNA. Cell Death Dis. 2024 Aug 8;15(8):578. doi: 10.1038/s41419-024-06959-1. PMID: 39117671; PMCID: PMC11310353.
