肝癌（HCC）是癌症相关死亡的第二大原因。虽然手术切除和肝移植仍然是早期HCC最有效的治疗选择，但总复发率高阻碍了长期生存。驱动HCC复发和系统治疗产生耐药性的复杂分子机制仍然知之甚少。癌症的特征之一是癌细胞的表型可塑性，即肿瘤细胞重新编程为具有胚胎特征的癌干细胞样细胞。肿瘤生态系统的癌-胚重编程导致免疫抑制特征。本研究采用单细胞RNA测序、空间转录组学和批量RNA测序来描述参与HCC复发和免疫治疗反应的特定细胞亚群。确定POSTN+细胞外基质癌症相关成纤维细胞（EM CAFs）是一个突出的癌-胚相互作用的中心，促进肿瘤进展。细胞-细胞通信和空间转录组学分析揭示了参与癌-胚重编程的核心细胞亚群POSTN+CAFs、FOLR2+巨噬细胞和PLVAP+内皮细胞的串扰和共定位。进一步的分析表明癌-胚重编程与上皮-间质转化（EMT）、肿瘤细胞增殖和Treg细胞募集之间的关联，最终影响早期复发和对免疫治疗的反应。总之，本研究将POSTN+CAFs确定为HCC癌-胚生态位的一部分，并强调其在EMT、复发和免疫治疗反应中的潜在影响，为使用癌-胚特征进行治疗分层铺平了道路。该研究于2024年1月发表在《Nature Cancer》，IF：23.5。
为描述HCC TME的概况，作者整合了一个单细胞图谱，其中包含来自六项研究（图1a、1b）的83个供者的251,761个细胞。将来自Sharma_2020数据集的原始簇注释映射到集成的簇上显示PLVAP+ECs可以分配到簇E5、E6和E7，而FOLR2+TAMs在簇M4中大量富集（图1b-1f）。这些结果证实了对癌-胚细胞类型的分类是可靠的。
考虑到CAFs在HCC进展和复发中的重要作用，作者进一步研究了CAFs在肝癌中的异质性。共6,163个间充质细胞被重新聚集，划分为9个亚组（图1b）。簇F1-F3显示MYH11、BCAM和参与肌肉系统过程的基因的特异性表达，提示其具有血管平滑肌细胞（VSMC）特征（图1g-1i）。簇F4和F5中FABP4、FABP5、APOA2和CYP2E1高表达，与脂质分解代谢和代谢有关。称之为脂质相关（LA）CAFs。簇F6-F9显示PDGFRA的高表达（图1h），PDGFRA是肝硬化肝脏瘢痕相关间充质细胞的标志物。簇F6选择性表达PI16、CD34和DPT，类似于通用的PI16+成纤维细胞，是可特化成纤维细胞和稳态样成纤维细胞的祖细胞。将F6命名为通用（UNI）CAF。簇F7和F8显示EM组分和粘附分子（包括COL1A2、POSTN和SPP1）的表达明显升高，因此将这组称为EM CAF。DEG分析显示EM CAFs显示出参与TGFβ、轴突发生和白球迁移的基因的优先表达（图1j）。簇F9富含CD74、MHC II类和细胞趋化介质，与免疫调节（IM）CAFs的特征一致。
组织分布分析显示，UNI CAFs主要存在于非肝硬化的邻近肝脏和淋巴结中，符合其祖细胞特征（图1k）。LA CAFs主要富集于肿瘤组织和邻近肝硬化的肝脏中，而IM CAFs主要从肿瘤组织中耗尽。此外，肿瘤组织中的成纤维细胞以VSMC样细胞、LA CAFs和EM CAFs为主。HCC Viium数据集表明，UNI CAFs和IM CAFs从肿瘤组织中耗尽，而VSMC样CAFs和EM CAFs优先观察于肿瘤前沿区域和肿瘤组织，符合HCC图谱得出的组织偏好。总的来说，作者通过HCC图谱分析提供了人类HCC中间充质细胞亚型的无偏倚分层。
考虑到数据整合过程中不可避免的偏差，作者专注于Sharma_2020数据集进行分析，该数据集分析了14例HCC患者的肿瘤和邻近正常组织。对1,712个间充质细胞进行无监督聚类产生了9个聚类（图2a，2b）。三簇在正常组织中表现出类似富集的聚类被标记为正常成纤维细胞（Fibs），而其余肿瘤特异性聚类被定义为CAFs。将新的聚类标签映射回HCC图谱显示CAF亚群广泛重叠：ABCA8+Fib映射到UNI CAF，MYH11+和HSP+CAFs映射到VSMC样表型，SDC2+和POSTN+CAFs映射到EM CAF，APOA2+CAF映射到LA CAF。进一步剖析从ABCA8+Fib开始的轨迹，推断出HCC中CAFs的两条主要路径：一条通过HSP+CAFs到MYH11+CAFs，第二条通过SDC2+CAFs到POSTN+CAFs。作者还分析了胚胎肝脏中间充质细胞的异质性（图2c，2d）。在这些簇中，来自COL1A1+和ITM2C+Fib的细胞位于两个不同的分支，代表不同的发育潜能。总之，研究结果揭示了肝癌和胚胎肝脏中间充质谱系的复杂性和异质性，这为研究CAF亚型是否重现胚胎肝脏相关特征提供了可能性。
作者发现HCC中TME存在胚胎样重编程，肝癌中的FOLR2+TAMs和PLVAP+ECs与胚胎肝脏中的对应细胞共享转录程序。然而，尚不清楚CAFs是否可能经历类似的过程。整合来自肝癌、邻近正常组织、胚胎肝脏和健康肝组织的scRNA-seq数据（图2e）。结果表明，只有簇4显示肿瘤CAFs和胚胎成纤维细胞的整合以及健康肝脏中成纤维细胞的可比消耗。令人惊讶的是，两个专门的长期分化簇ITM2C+Fibs和POSTN+CAFs，以及它们发育连接的细胞APOC3+Fibs和SDC2+CAFs，形成了簇4（图2f），表明肝癌中POSTN+CAFs的癌胚重编程的可能性。同时，相似性分析和层次聚类也确定了胚胎肝脏ITM2C+Fibs和肝癌POSTN+CAFs之间的对应关系。
为描述胚胎肝脏和肿瘤成纤维细胞间的共有转录程序，比较POSTN+CAFs和ITM2C+Fibs中特异性上调的基因（图2g）。结果发现，POSTN+CAFs和ITM2C+Fibs中上调的基因参与了血白球介导的免疫途径、抗原加工提呈以及对IL-1和IFN-β的反应。此外，作者还发现POSTN+CAFs显示了LUM、GPNMB、INHBA和IL32的特异性上调。基因集富集分析显示EM组织、血管发育、细胞迁移和血管生成途径的调节强烈富集，进一步表明了它们的促肿瘤发生特性。此外，癌-胚CAF特征和单独POSTN水平较高的患者在未接受治疗的患者中与较差的总生存期相关（图2h，2i）。综上，研究结果揭示癌-胚重编程的POSTN+CAFs在肝癌和指示其动员免疫抑制TME的潜在作用。
POSTN+CAFs上调了血管系统发育和髓系激活程序，这进一步促进作者探究癌-胚生态系统中的细胞通信。通过NicheNet分析，观察到癌-胚调节因子的预测配体的表达在癌-胚细胞中也普遍上调（图3a），突出了癌-胚细胞类型之间的密切相互作用。值得注意的是，POSTN+CAFs显示了免疫调节趋化因子如CCL2和CXCL12的优先表达（图3b），这些因子被报道在招募巨噬细胞和ECs中具有重要作用。
NicheNet分析使作者确定了一组定义为核心癌-胚配体的10个基因，这些基因被预测为驱动所有三种癌-胚细胞类型表型的潜在配体（图3c）。VEGFA和PGF被确定为调节癌-胚生态系统的核心配体，据报道，它们调节PLVAP的表达，激活PLVAP+EC，调节肝癌中的血管生成。还将TGFB3描述为一种重要的癌-胚调节因子，与其与EMT和肿瘤免疫抑制相关的功能一致。TGFβ信号传导也被报道对癌症相关肌成纤维细胞的发育至关重要。作者还注意到许多优先的癌-胚调节配体是由一些旁邻细胞产生的，如SPP1+TAM2、MYH11+CAF、恶性肝细胞P7_2细胞和Treg，这表明这些旁邻细胞产生癌-胚配体是癌-胚生态系统的相关部分。随后使用Cellchat来定量地破译配体-受体相互作用。发现传入和传出的信号都由癌-胚细胞类型主导，特别是POSTN+CAFs（图3d），这表明这些癌-胚细胞类型构成了肝癌细胞-细胞相互作用网络的核心。在与POSTN+CAFs相关的配体-受体对中（图3e，3f），CXCL16-CXCR6和CXCL12-CXCR4在Tregs中显着富集，这意味着POSTN+CAFs在招募免疫抑制Treg中的潜在作用。POSTN+CAFs还表达了高水平的GAS6，据报道，GAS6通过刺激MERTK来增加肿瘤的生长和转移，MERTK是一种由FOLR2+TAMs高度表达的基因。涉及POSTN+CAFs和PLVAP+ECs之间相互作用的配体-受体对包括NOTCH3-DLL4和ADGRER2+。FOLR2+TAMs表达的受体CSF1R可以与两种不同的配体相互作用，分别是POSTN+CAFs表达的IL34和PLVAP+ECs表达的CSF1。据报道，IL34-CSF1R轴在诱导单核细胞分化和肿瘤组织中的免疫抑制巨噬细胞中具有关键作用。总之，作者在HCC TME中构建了一个细胞-细胞相互作用网络，并指出POSTN+CAFs是塑造癌-胚生态系统的关键通信“枢纽”。
鉴于癌-胚细胞之间的相互作用，推断这些癌-胚细胞的共定位以建立癌-胚生态位。采用基于DNA纳米球（DNB）的空间增强分辨率组学测序（Stereo-seq）来捕获空间转录组。将数据分割成100个分辨率（100×100个DNB，直径约50μm），并分别从HCC01和HCC03肿瘤的36,776个和23,941个转录组中检索转录组信息。首先在空间图谱上绘制了癌-胚簇特异性标记基因，观察到FOLR2、PLVAP和POSTN基因的共富集（图4a）。根据癌-胚特征基因的表达值，我们将前2.5%的bins及其周围的bins定义为癌-胚细胞高表达的bins（图4b）。进一步评估POSTN+CAF特征表达显示，在PLVAP+EC富集和FOLR2+TAM富集的bins中，POSTN+CAFs的富集和空间相关性相当，但POSTN+CAFs没有（图4c），证明了癌-胚细胞类型在TME中的共定位。
接下来，作者试图将“癌-胚生态位”定义为包含或包围所有三种癌-胚细胞类型的Stereo-seq bins。单独来看，HCC01中的癌-胚生态位分布在切片周围，而HCC03中的癌-胚生态位显示出集中分布模式（图4d），可能反映了患者间的异质性。此外，立体间隔能够放大特定的癌-胚生态位，并产生更高分辨率的空间分辨特征。通过将数据分割成10个分辨率（10×10 DNB，直径约5μm），即真正的单细胞分辨率，证实癌-胚细胞类型的共同富集及其在定义的癌-胚生态位中的紧密接近（图4d中的红色区域）。对100个分辨率进行聚类，并观察到HCC01中的聚类C3和HCC03中的聚类C5与癌-胚特征的共表达相区别，与上述定义的癌-胚生态位一致。
通过RNAope实验进一步验证了癌-胚生态位的存在，并观察到在肝癌肿瘤和胚胎肝脏中POSTN+CAF细胞邻域中FOLR2和PLVAP转录本的表达增加（图4e，4f）。使用CosMx空间分子成像仪在单细胞分辨率下对约1,000个mRNAs进行空间分析。通过使用scRNA-seq数据中定义的簇的标记转移方法，定性和定量地证实了癌-胚细胞的共定位和癌-胚生态位的存在（图4g，4h和）。综上所述，这些结果清楚地表明癌-胚细胞类型，包括POSTN+CAFs，FOLR2+TAMs和PLVAP+ECs，在肝癌TME中共定位于同一生态位，并将多个配体聚集在一起来协调这一生态位。
为研究癌胚细胞的存在是否会影响肝癌患者的临床预后，使用PLANET队列（代表来自55个手术切除的肝癌的250个多部门配对组织的转录谱）。为了解这些癌-胚细胞类型及手术切除肿瘤后其对复发的影响，在确认CIBER-SORTx 框架的精确性后将其用于数据集。首先分析特定细胞亚群的浸润，然后进行了推断比例的分层聚类（图5a），并在富含PLVAP+ECs的标本中观察到FOLR2+TAMs和POSTN+CAFs的比例较高。将“癌-胚评分”定义为每个标本中所有三种癌-胚细胞类型的比例加和，并进一步将患者分为癌-胚高（OF hi）或癌-胚低（OF low）亚组。观察到手术后HCC复发患者的OF hi标本显著丰富（图5b，5c）。还对复发的癌-胚细胞类型的各种组合进行了比较分析，强调了POSTN+CAFs对肝癌复发的主要影响。此外，归类为OF hi的患者似乎优先与微血管侵袭相关（图5b），这是已报道的肿瘤复发的强预测因子。与此同时还观察到TNM I期OF hi标本的耗尽，但未观察到病毒状态对癌-胚重编程的任何特定影响。综上所述，这些结果为癌胚编程在肝癌复发中的潜在作用提供了前所未有的见解，并强调了评估其疾病管理的必要性。
分析发现大多数被归类为OF hi的患者发生了复发性肿瘤，同时一个复发性肿瘤亚组（约37%）的癌胚评分低（图5b）。作者发现OF hi评分的患者倾向于在六个月内复发，高癌胚评分与早期复发呈正相关（图5d）。进一步研究OF hi和OF low条件下复发性肿瘤（RTs）的差异，观察到低RTs表现出CYP2家族基因、G6PC、ADH1B和LECT2的高表达，而OF hi RTs表现出较高水平的CXCL1、CXCL5、KRT7、KRT19和MMP7。使用GSVA评估已知途径的表达，发现OF low RTs中的脂质代谢、胆固醇代谢和急性炎症途径强烈富集（图5e）。相比之下，OF hi RTs上调EM组织、细胞运动、细胞增殖和EMT途径。我们在scRNA-seq数据中检查了这些差异表达基因的表达，观察到代谢和EMT基因在恶性肝细胞中都有特异性表达。这些结果表明，来自癌-胚生态系统的肿瘤亚型可以反映恶性肝细胞的差异。为了验证观察结果，对124例复发肿瘤标本进行了基于基因表达的无监督聚类，并确定了5个聚类（图5f）。观察到OF hi标本在聚类1和2中强烈富集，OF low标本在聚类3和5中富集。同时，EMT基因在聚类1和2中上调，而非EMT基因在聚类4和5中大幅增加。断基于比例的聚类和基于表达的聚类揭示了肝癌复发的两种亚型：OF hi相关的EMT样和OF low相关的非EMT复发。
随后比较了在不同癌症类型中发现的一些复发基因模块的表达，发现细胞周期模块和部分EMT模块在OF hi复发标本中显著上调（图5g）。在来自结直肠癌的高复发细胞中上调的核心基因表达程序也仅限于OF hi复发标本（图5g），表明复发特征超越了特定的癌症类型。为进一步确认恶性肝细胞的两种亚型的存在，将EMT样和非EMT基因特征映射到Stereo-seq空间图谱上。令但观察到肿瘤组织中两种类型的恶性细胞之间存在相互排斥的模式（图5h）。用NicheNet对OF hi复发特征基因进行分析预测，癌-胚细胞来源的配体，如FN1、CTGF、INHBA、THBS2和GSTP1，可以诱导EMT驱动的表型，并支持它们与EMT程序的关联。此外还观察到被确定为EMT样HCC肿瘤细胞的bins被癌-胚生态位包围，距离为10-20 bins（500-1000μm）（图5i）。这些结果表明癌-胚生态位可能形成利于EMT样肿瘤细胞重编程和增殖的环境，进一步促进HCC肿瘤的复发。
为进一步了解癌-胚细胞和肿瘤复发，重新对scRNA-seq数据进行分析，并推断肝癌中复发特异性癌-胚生态位。观察到与非复发肿瘤（NRTs）相比，RTs中癌-胚生态位的差异富集（图6a）。为研究癌-胚重编程中的信号变化，将scRNA-seq数据分离到RT和NRT样本中，并使用Cellchat。观察到与NRTs相比，RTs中更多的相互作用。在信号转导（发送）的输出端，观察到POSTN+CAFs和PLVAP+ECs的相互作用强度显著增加，而PLVAP+ECs和FOLR2+TAM1的传入信号（接收）在RT样本中上调。具体来说，RT中癌-胚生态系统内的相互作用增加（图6b）。进一步剖析基于信息流的显著变化的信号通路，观察到与癌-胚重编程相关的通路，如PTN、VTN、CXCL、VEGF和NOTCH，在RT中高度活跃。针对CXCL信号，配体CXCL12及其受体CXCR4被确定为RTs中最显著的上调信号，有助于从POSTN+CAFs到Treg和FOLR2+TAMs的通信（图6c），与以前的报道大体一致。总的来说，这些数据描述了复发性HCC肿瘤中癌-胚重编程驱动的细胞-细胞通信的增加。
数据表明癌-胚生态系统、EMT样重编程和肝癌复发之间存在关联。接下来试图在RTs的空间分辨率上验证此发现。使用NanoString GeoMx DSP技术解析整个转录组（约18,000个基因）并从六张切片中分析了72个感兴趣区域（ROIs），包括胚胎肝脏的两张切片（图6d）。CIBERSORTx推断的肿瘤ROIs中POSTN+ CAFs的比例与PLVAP+ECs或FOLR2+TAMs一起增加，表明癌-胚生态系统的共定位。主成分分析（PCA）显示RTs（B017）和NRTs（B015）之间有显著差异。与批量RNA-seq分析相一致，观察到与NRTs相比，癌-胚细胞在RTs区域的富集（图6e）。此外，推断的细胞组成的层次聚类将肿瘤ROI分为癌-胚耗竭的C1和癌-胚富集的C2群体，反映了RTs和NRTs之间的异质性（图6f-6h）。C2显示免疫球蛋白基因、胶原基因、S100A11和LYZ的表达较高，这些基因在免疫细胞和成纤维细胞中上调。相比之下，肝细胞特异性基因在C1聚类中显著增加，与比例分析一致。当聚类包括胚胎肝脏ROI在内的所有72个区域时，观察到属于C2的肿瘤区域与大多数胚胎肝脏区域聚集在一起，并上调了癌-胚细胞的经典特征，证实了复发性肝癌生态系统中癌-胚重编程。还观察到癌-胚配体在癌-胚富集的C2中的高表达和低RTs的特征减少（图6i，6j）。总之，数据表明癌-胚细胞类型共定位的模型，形成了一个支持其串扰的生态位，并促进肿瘤细胞逃避抗肿瘤免疫，这表明癌-胚重编程在肝癌复发中的重要性。
最近在HCC中进行的一项研究发现了阿特珠单抗（抗PD-L1）+贝伐单抗（抗VEGF）反应特征（ABRS），其高表达与无进展生存期（PFS）的改善有关。将ABRS基因映射到scRNA-seq数据集显示Treg表达高水平的ABRS基因，尤其是ICOS、CTLA4、FCRL3和GBP5。在GO30140A和接受阿特珠单抗+贝伐单抗联合治疗的150名队列患者中探索了ABRS与Treg特征之间的关联（图7a）。使用Treg特异性基因特征，证实了ABRS基因高表达患者和应答者中Treg细胞的富集（图7b，7c）。一致地，Treg特征高表达的患者也显示了PFS的改善。这些发现与已发表结果一致，即Treg的高度存在与阿特珠单抗+贝伐单抗联合治疗的更有利反应和更长的生存期有关。
鉴于癌-胚细胞在与Treg细胞相互作用中的重要性，作者推测癌-胚重编程可能会影响联合治疗的临床反应。在IMbrave150和GO30140A队列中，FOLR2+TAMs、PLVAP+ECs和POSTN+CAFs的特征在ABRS高和Treg高人群中高表达（图7d h）。在Treg或ABRS高表达的患者中，OF hi复发相关的EMT样特征也上调，而非EMT特征显著下调。上述结果表明癌-胚重编程通过调节Treg和ABRS基因表达在阿特珠单抗+贝伐单抗的临床反应中的潜在作用。为进一步验证相关性，从2例早期肝癌患者的Stereo-seq初始切除中收集了额外的肿瘤组织。这些患者在复发后接受阿特珠单抗+贝伐珠单抗免疫治疗，并对联合治疗表现出临床反应（M311）或耐药（M316）（图7e）。基于特征基因的表达，计算了富含癌-胚细胞的bins的邻域指数。在有反应的M311中，观察到ABRS基因上调的bins中癌-胚细胞的富集，而无反应的M316没有统计学意义的变化和低空间相关值（图7f）。此外，在响应者M311中，表达更高水平EMT样特征的bins也被发现在空间上与TME内的癌-胚生态位、ABRS高和Treg富集区域共定位。这表明癌-胚重编程可能通过与Treg的相互作用影响联合治疗的治疗反应。
本研究介绍了POSTN+CAFs作为HCC癌-胚生态系统的主要枢纽。此外还展示了癌-胚细胞在HCC TME的共同定位。最重要的是，这项研究将肿瘤生态系统癌胚重编程的新发现与肝癌患者的临床结果联系起来。癌-胚重编程的存在可以为早期HCC的分层诊疗以预测肿瘤复发提供有希望的机会，并对联合免疫治疗靶向TME的治疗提供潜在方案。
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