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最近，细胞程序性死亡（PCD）被认为与急性心肌梗死（AMI）中中性粒细胞的清除有关。然而，与中性粒细胞相关的程序性细胞死亡的临床意义和生物学机制仍有待探索。我们采用了一种基于机器学习的综合计算框架，在来自 AMI 患者外周血的五个独立微阵列队列中生成了一种预测性中性粒细胞衍生 PCD 特征（NPCDS）。利用非负矩阵因式分解开发了基于 NPCDS 的 AMI 亚型。为了阐明 NPCDS 的生物学机制，我们对从实验性 AMI 小鼠心脏中分离出的 Cd45+ 细胞进行了单细胞转录组学研究。最后，我们进行了孟德尔随机化（MR）研究和分子对接，以探讨 NPCDS 对 AMI 的治疗价值。我们报告了 NPCDS 在 AMI 预测中的稳健性和优越性能，它促成了随机森林和逐步回归的最佳组合，并适用于九个中性粒细胞相关 PCD 基因（MDM2、PTK2B、MYH9、IVNS1ABP、MAPK14、GNS、MYD88、TLR2、CFLAR）。我们发现了两种不同的基于 NPCDS 的 AMI 亚型，其中亚型 1 的特点是炎症激活，中性粒细胞活动更活跃，而亚型 2 则相反。我们从机制上揭示了 NPCDS 的表达动态，以调控 AMI 中的中性粒细胞从促炎阶段向抗炎阶段转化。我们发现，MDM2 表达的遗传易感性与 AMI 风险之间存在明显的因果关系。我们还发现，利多卡因嗪、异噻曲林和头孢噻啶可以稳定地靶向 MDM2。总之，NPCDS 对 AMI 的预测、分层和治疗管理具有重要意义。本文于2024年7月发表于《Journal of Translational Medicine》，IF：6.1。
技术路线：
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主要研究结果：
1. 通过全面筛选鉴定 25 个关键的中性粒细胞相关 PCD 基因我们最初收集了 1554 个基因，包括 17 种 PCD 模式，如图 2A 所示。随后，我们利用 1554 个 PCD 相关基因对 GSE123342 的表达谱进行了 ssGSEA。与对照病例相比，我们观察到有 8 种 PCD 模式的 ssGSEA 评分在 AMI 中显著升高（P 值均小于 0.05），包括细胞凋亡、热凋亡、自噬、NETosis、LDCD、alkaliptosis、anoikis 和二硫化硫（图 2B）。上述 PCD 模式包括在后一项分析中。此外，我们还观察到中性粒细胞相关基因的ssGSEA得分在AMI中上调（P值<0.05）。接下来，我们以特征图（10 × 10 网格）为输入空间，对 AMI 病例的表达谱进行了 SOM 聚类（图 2C）。SOM 与分层聚类相结合，可将基因表达模式划分为特征图中的相邻聚类[66]。共确定了六个聚类（图 2C），其中三个聚类（C4、C5 和 C6）被定义为 AMI 敏感表达模式。各簇中的基因见补充表 4。如图 2D 所示，我们在 AMI 病例和对照病例之间筛选出了 435 个 DEGs，其中包括 388 个上调基因和 47 个下调基因。DEGs 的详情见补充表 5。为了深入了解参与 PCD-中性粒细胞串联的基因，我们计算了 8 种 PCD 模式与中性粒细胞相关基因表达之间的皮尔逊相关系数。我们得到了 801 个与中性粒细胞相关的 PCD 基因（R > 0.6 且 P 值 < 0.001），与中性粒细胞基因强相互作用的前 50 个 PCD 基因如图 2E 所示。从三个 SOM 确定的簇的 3231 个基因、388 个 AMI 上调基因和 801 个中性粒细胞相关 PCD 基因的交集中，我们收集了 58 个重叠基因（图 2F）。我们进一步采用 Boruta 算法将这 58 个交叉基因缩小到 25 个与 AMI 更为相关的基因。如图 2G 所示，Boruta 算法执行了 9828 次迭代，直到捕获所有基因并做出决定（确认或拒绝）。在比较了每个特征和阴影属性的重要性后，我们对每个基因的重要性进行了排序。我们保留了 25 个显示程度高于最大阴影属性的基因（图 2H）。随后，我们展示了 Boruta 选定的 25 个基因在对照组和 AMI 病例中的表达和 PCD 模式。如图 2I 所示，我们观察到这 25 个基因在 AMI 中上调，并且属于不同的 PCD 模式（凋亡、anoikis、自噬、NETosis、LDCD 和 pyroptosis）。然后，我们对这 25 个基因进行了 DO、GO 和 KEGG 富集分析，显著富集的术语见图 2I 和 J。DO 分析的主要 BP 术语是凋亡信号通路的调控、活性氧代谢过程和参与炎症反应的白细胞活化。此外，我们发现富集的 KEGG 术语有脂质和动脉粥样硬化、Toll 样受体信号通路、TNF 信号通路、白细胞跨内皮迁移、神经营养素信号通路、细胞凋亡和中性粒细胞胞外陷阱的形成。这些结果表明，这25个与中性粒细胞相关的PCD基因与AMI所涉及的生物学过程或通路密切相关。![]()
Figure 1 鉴定嗜中性粒细胞相关 PCD 基因以构建 NPCDS
2. 基于 ML 的综合框架生成的中性粒细胞相关 PCD 特征 (NPCDS)通过重叠五个独立队列（GSE123342、GSE29532、GSE60993、GSE61144和GSE97320）中的基因，我们确定了20个中性粒细胞相关的PCD基因用于构建NPCDS（图3A）。我们选择 GSE123342 作为发现 NPCDS 的训练队列，而 GSE29532、GSE60993、GSE61144 和 GSE97320 作为独立的测试队列（图 3A）。随后，对这20个中性粒细胞相关PCD基因的表达谱进行了基于ML的综合框架分析，以开发NPCDS。在该框架中，我们使用了 12 种 ML 算法，共建立了 113 个模型组合，其中在五个队列中平均 AUC 最高的组合被认为是最佳组合。如图 3B 所示，表现最好的模型是 RF 和 Stepglm（正向）的组合，在五个队列中平均 AUC 得分最高（0.94）。我们称这种 RF 和 Stepglm（正向）的组合为 NPCDS。值得注意的是，在所有五个队列中进行的 NPCDS 的 AUC 分数都大于 0.8，这表明 NPCDS 具有强大的泛化能力。图 3C 和 D 显示了 NPCDS 的生成过程。在 RF 算法中，在十倍 CV 下从 20 个输入基因中选出了前 9 个重要基因（MDM2、PTK2B、MYH9、IVNS1ABP、MAPK14、GNS、MYD88、TLR2、CFLAR）（图 3C）。然后用 Stepglm 算法拟合回归模型，并通过相应的回归系数对每个基因的表达量进行加权（图 3D）。利用 NPCDS 生成每个病例的预测概率和预测标签，生成训练队列（图 3E）和测试队列（图 3F）的混淆矩阵。除了 AUC 分数外，还计算了评估 NPCDS 的其他四个双类别指标，包括准确性、灵敏度、特异性和 F1 分数。就我们入组队列中的平衡和不平衡类分布而言，高准确性（> 0.85）、高灵敏度（> 0.75）、高特异性（> 0.9）和高 F1 评分（> 0.75）再次强调了 NPCDS 在区分 AMI 和对照病例方面准确可靠的诊断性能。此外，为了更严格地验证 NPCDS，我们在外部验证队列中测量了其预测能力。为了更深入地了解 NPCDS 在 AMI 进展过程中的表达动态，我们在 GSE29532 和 GSE123342 中研究了不同时间点收集的 AMI 病例中 NPCDS 的表达模式。如图 3G 所示，我们发现 CFLAR、MYH9 和 IVNS1ABP 的表达在机械再灌注和支架植入后的 AMI 中有所下降。有趣的是，与首次诊断为急性心肌梗死的患者相比，在急性心肌梗死后 30 天和一年的病例中观察到了所有九个基因的表达下调模式（图 3H）。这些证据表明，NPCDS 在 AMI 早期阶段起着至关重要的作用，这也强调了它在早期预测和干预中的潜在应用。![]()
Figure 2 基于 ML 的综合框架开发出具有诊断意义的中性粒细胞相关 PCD 特征 (NPCDS)
随着测序技术和计算方法的出现，大量用于疾病预测的基因表达特征被开发出来。为了确保 NPCDS 和其他特征之间的可比性，我们对 AMI 预测中使用的 mRNA 表达特征进行了整理。最终，我们选取了 63 个已发表的特征。值得注意的是，其中一些特征来自不同的功能基因集，如免疫细胞特征、细胞外基质、铁变态反应、衰老和杯突症。我们过滤掉了五个独立队列中不匹配基因超过 30% 的特征，最终保留了 41 个特征。对于每个供比较的特征，我们估算了所有队列和元队列的 AUC 分数。接下来，我们将 NPCDS 的 AUC 分数与其他入选特征进行了比较。如图 4 所示，NPCDS 的 AUC 性能在 GSE123342、GSE29532、GSE61144、GSE97320 和 Meta-cohort 中排名第一，而在 GSE60993 中排名第十九。此外，我们还注意到，我们的 NPCDS 在两个外部验证队列中都有很强的预测性能，在 GSE48060 中排名第一，在 GSE194388 中排名第二。因此，在除 GSE60993 之外的队列中，我们的 NPCDS 模型几乎比所有收集到的特征都具有更好的诊断效果（P 值<0.05）。我们注意到，AUC得分排名第一的是特征10，这是一个由 TNF、CXCL8、FPR2、CXCL1、JUN、IL1B、PPBP、MMP9、FCER1G 和 LILRB2 组成的 10 个基因面板。然而，特征 10 在其他队列中表现较弱，尤其是在 GSE61144（42 个中排名第 39）和 GSE97320（42 个中排名第 42）中，这表明过度拟合导致其泛化能力较差。同样，在 GSE60993 中排名在 NPCDS 之前的其他特征也存在这个问题。此外，在整合了所有队列的元队列中，NPCDS 仍然是表现最好的一个。因此，我们的 NPCDS 模型再次证明了它能够精确预测 AMI，与其他已发表的特征相比，它还表现出了更强大的泛化能力。![]()
Figure 3 NPCDS 与已发表基因表达特征的比较
4. NPCDS的稳健预测性能和结合临床特征的列线图的开发评估 NPCDS 的外部验证也在 GSE34198 队列中进行，该队列包含 48 个对照组和 49 个 AMI 病例。接下来，我们按照 6:4 的比例将 GSE34198 随机分为 GSE34198 培训队列（29 例对照和 28 例 AMI 病例）和 GSE34198 测试队列（20 例对照和 20 例 AMI 病例）（图 5A）。NPCDS 在 GSE34198 中的稳健预测性能（图 5B）再次以 AUC（均大于 0.75）、准确性（均大于 0.65）、灵敏度（均大于 0.7）、特异性（均大于 0.65）和 F1 分数（均大于 0.65）等多倍指标为基准。关于 NPCDS 的临床普适性和模型优化，进一步构建了基于逻辑回归的列线图，其中包含 AMI 相关临床特征和 NPCDS。采用逻辑回归后，我们得到了四个重要的临床特征（受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂、糖尿病状态、污点）和 NPCDS，从而建立了一个列线图（图 5C）。列线图最上方的刻度代表每个变量的点数分配。第二至第五个刻度分别代表列线图中的变量，即受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂、糖尿病状态、污点和 NPCDS。通过在变量和点标间建立一条垂直线，每个变量都将在点标上获得一个点值。对于每个人，列线图可以通过将所有变量的分配点数相加，得出总点数（第七刻度）。得到总点数后，就可以通过在总点数刻度上找到点值来预测概率分层（第八刻度）和急性心肌梗死的概率（最下刻度）。根据预测概率的范围，我们还定义了由低风险（0-0.3）、中风险（0.3-0.7）和高风险（0.7-1.0）组成的 AMI 分层。为了评估列线图的综合性能，我们随后采用了三个常用指标，包括区分度（AUC）、校准和 DCA。值得注意的是，在 GSE34198 培训队列中，我们的列线图显示出比 NPCDS 更好的诊断能力（AUC = 0.804），如图 5D 所示。与单独使用 NPCDS 相比，我们的列线图在 GSE34198 测试队列中的 AUC 分数有所降低（AUC = 0.720，图 5E）。校准曲线显示，在 GSE34198 培训队列（图 5F）和 GSE34198 测试队列（图 5G）中，列线图预测的概率与实际概率基本一致，这表明在预测偏差较小的情况下，列线图具有更好的性能。如图 5H 和图 I 所示，通过 DCA 曲线评估了我们的列线图的临床实用性。在 0.4 至 1.0 的高风险阈值范围内，列线图的净效益高于 "无 "和 "所有 "基线。这一结果表明，对于预测为中风险（0.3-0.7）和高风险（0.7-1.0）的 AMI 患者，列线图有助于临床决策。总体而言，我们的列线图综合了临床特征和 NPCDS，在预测 AMI 方面表现出色，尤其是那些被分层为中危或高危的患者。![]()
Figure 4 对 NPCDS 进行外部验证，并结合临床信息制定列线图
5. 利用NPCDS上的NMF聚类建立了两种分子亚型目前，临床上广泛根据心电图模式确定 AMI 的亚型，主要包括 ST 段抬高型心肌梗死和非 ST 段抬高型心肌梗死。然而，对 AMI 分子亚型的研究仍然不足。因此，对 AMI 患者的分区采用了 NPCDS 表达式上的 NMF 聚类。为保证聚类的稳定性，我们选取了 GSE123342、GSE60993 和 GSE34198 数据集，这些数据集均包含 15 例以上的 AMI 病例。根据 NMF 的指标标准（共轭、残差、RSS 和剪影），我们确定了共轭开始下降的最佳秩值（k = 2）（图 6A-C）。因此，我们利用最佳秩值确定了两种 AMI 分子亚型。最重要的是，我们生成了共识热图，以证明当 k 等于 2 时聚类的稳定性（图 6D-F）。此外，三维 PCA 图显示了 NPCDS 在两种已确定亚型中的不同分布（图 6G-I）。关于 NPCDS 衍生出的亚型在 AMI 患者临床特征方面是否存在差异，我们使用卡方检验评估了 GSE34198 数据集中两个亚型之间的差异。。这些结果表明，通过两个亚型可以更好地代表 AMI 患者的分区。然后，我们采用 ssGSEA 测量了两个亚型中与 NPCDS 相关的 PCD 模式（凋亡、自显、NETosis、LDCD、anoikis）和中性粒细胞的特征富集度。我们还评估了众所周知与 AMI 动态有关的中性粒细胞过程的 ssGSEA 评分，包括中性粒细胞脱颗粒和中性粒细胞外渗。如图 6J 所示，在两个亚型中观察到了中性粒细胞脱颗粒、中性粒细胞外渗和中性粒细胞NETosis 的整体高富集模式。值得注意的是，我们发现与亚型 2 相比，亚型 1 中的 NETosis、中性粒细胞、中性粒细胞脱颗粒和中性粒细胞外渗特征明显丰富（图 6K-M）。接下来，利用 GSEA 评估 NETosis、中性粒细胞、中性粒细胞脱颗粒和中性粒细胞外渗是否与亚型区分（亚型 1 与亚型 2）相关。图 6N-P 显示，在亚型 1 中，NETosis、中性粒细胞和中性粒细胞脱颗粒明显呈正相关趋势（NES > 1，FDR < 0.05）。这些活化的中性粒细胞功能通常预示着 AMI 的临床预后较差。因此，我们推测亚型 1 中的 AMI 患者表现出中性粒细胞的高浸润水平，以及活跃的 NETosis 和中性粒细胞脱颗粒活性（图 6Q）。我们的研究结果可能支持根据 NPCDS 对 AMI 患者进行新的分层。![]()
Figure 5 利用 NPCDS 上的 NMF 算法构建 AMI 分子亚型
6. ScRNA-seq分析揭示了NPCDS在中性粒细胞转化过程中的多样化动态模式为了深入研究 NPCDS 在 AMI 进展中的作用机制，我们采用 scRNA-seq 分析来说明 NPCDS 在中性粒细胞转化过程中的动态变化。我们采用了 GSE163465 数据集进行分析，该数据集包含在 AMI 后不同时间点（LAD 结扎建模后 0、3、7、14 天）从小鼠心脏分拣的 Cd45+ 细胞。整体分析流程如图 7A 所示。经过质量修剪和过滤，我们共收集到高质量的 17,384 个高表达 Cd45 的细胞。结合无监督聚类和 t-SNE 还原，我们最终确定了 Cd45+ 细胞的六个聚类。随后，我们利用成熟的心脏免疫细胞标记基因对这六个假定的细胞簇进行了注释。图 7B 描述了心脏 Cd45+ 细胞的单细胞图谱，包括巨噬细胞/单核细胞、T/NK 细胞、中性粒细胞、B 细胞和树突状细胞。图 7C 进一步显示了在 AMI 进展过程中各细胞群比例的动态变化。值得注意的是，我们观察到中性粒细胞在急性心肌梗死后第 3 天到第 7 天大幅增加，而在急性心肌梗死后第 14 天则明显减少。这一结果与之前描述 AMI 中嗜中性粒细胞浸润变化的研究结果一致。为了更深入地了解 AMI 中嗜中性粒细胞的异质性，我们使用促炎和抗炎标记基因定义了两个不同的嗜中性粒细胞亚群（N1 和 N2）。如图 7E 所示，我们注意到在 AMI 进展过程中，N1 和 N2 的变化模式正好相反。N1亚型反映为炎症标志物（Ccl2、Ccl7、Ccl9、Isg15、Ifitm6和Mmp8）的高表达，在AMI后第3天急剧增加，随后显著下降。而 N2 亚型则表现出较高的凋亡和抗炎标志物（Sod2、Mif、Bnip3、Lgals3、Vim 和 Il10）表达量，在急性心肌梗死后第 3 天有少量浸润，但在第 7 天有所回升。耐人寻味的是，我们发现了两种生物功能相反的中性粒细胞亚群，即 N1（炎症）和 N2（抗炎）。此外，我们还研究了 NPCDS 在这两个亚群中的表达分布。N1 亚群表现出 Myd88 和 Myh9 的显著表达，而 N2 亚群则表现出 Cflar 和 Mdm2 的强烈上调（图 7F）。利用 AUCell 算法，我们评估了从 NPCDS、NETosis 和中性粒细胞脱颗粒计算出的 AUCell 分数是否在中性粒细胞亚型中显著富集。我们观察到，来自细胞凋亡的特征（图 7G）在 N2 中明显富集，但 NETosis（图 7H）和中性粒细胞脱颗粒（图 7I）在 N1 中明显富集。这一结果表明，N1 亚型对应于活跃的炎症阶段，伴随着更丰富的 NETosis 和中性粒细胞脱颗粒，而 N2 亚型代表了抗炎阶段。然后，我们通过伪时间分析来推断中性粒细胞的不同轨迹。不出所料，N2 主要出现在假时间较高的轨迹末端（图 8A、B），表明了从 N1 到 N2 的过渡。由于之前证明 NPCDS 的表达模式在 N1 和 N2 中并不明显分散，我们探讨了 NPCDS 在中性粒细胞转化过程中是否会发生动态变化。如图 8C（左）所示，我们通过对沿轨迹差异表达的基因进行聚类，收集了六种动力学模式（以 C1、C2、C3、C4、C5、C6 表示）。关于NPCDS沿假定时间的动态变化，我们注意到Mapk14、Myd88、Myh9、Ptk2b和Tlr2被分配到一个相似的方向面板上，显示最初沿假定时间（C3、C4、C5）的表达，这表明它们在假定时间较低的N1亚型中过早活化。然而，Gns、Mdm2 和 Cflar 在整个假时（C1、C2、C6）中的变化越来越渐进，表明它们在假时较高的 N2 亚型中被延迟激活。接下来，我们进行了 GO 和 KEGG 富集分析，以揭示从 N1 到 N2 转化的分子程序（图 8C，右）。值得注意的是，C3、C4 和 C5 模式主要参与了与白细胞活化、迁移、氧化磷酸化和蛋白质翻译相关的生物过程或通路。C1、C2和C6模式则明显富集于与凋亡相关的过程或通路，如溶酶体、内在凋亡通路、Toll样受体信号通路和NF-kB信号通路。总之，这些结果表明，N1 亚型在 AMI 早期具有较强的促炎活性，在晚期将通过凋亡相关通路的活化转化为 N2 亚型。鉴于凋亡中性粒细胞在限制梗死后炎症方面的巨大潜力，我们推测 N1 向 N2 的转变可能代表了 AMI 期间从炎症阶段向修复阶段的转换，而 NPCDS 在这些阶段中起着动态调节作用。![]()
Figure 6 以单细胞分辨率研究 AMI 进展过程中 NPCDS 的表达模式![]()
Figure 7 AMI 进展过程中中性粒细胞的多样性和动态性揭示了 NPCDS 在中性粒细胞转变过程中的表达动力学
7. 网络推理揭示了AMI中NPCDS的生物学机制为了解读 AMI 中 NPCDS 的生物学机制，我们首先从 KEGG 数据库中检索了 NPCDS 主导的信号通路p53 信号通路（MDM2 参与）、细胞凋亡（CFLAR 参与）、溶酶体（GNS 参与）和白细胞跨内皮迁移（PTK2B 和 MYH9 参与）。IVNS1ABP 在 KEGG 数据库中没有记录，但据说有助于肌动蛋白细胞骨架的动态稳定。然后，我们利用 NPCDS 及其互动基因参与了 GRN 的构建。如图 9A 所示，在实施贝叶斯网络分析后，我们明确推断出了包含 NPCDS 和交互基因的 GRN。有趣的是，我们发现 TLR2 与 MAPK14 和 MYD88 的相互作用具有很高的可信度，这与已知的 NETosis 和细胞凋亡中的相互作用在方向上是一致的。关于参与细胞凋亡的 MDM2 和 CFLAR，我们注意到 MDM2、CFLAR、TP53 和 CASP8 之间存在密切的定向联系，其中 MDM2 调节 TP53，而 TP53 又作用于 CASP8。我们还观察到了 CFLAR 和 CASP8 之间的相互作用。此外，我们还描绘了 PTK2B 和 IVNS1ABP 对稳定 MYH9 与 ACTB 结合的调节作用，从而促进了中性粒细胞的迁移。值得注意的是，我们观察到了 GNS 对 MDM2 和 MYD88 的调控作用，这表明 GNS 上调可促进细胞凋亡，从而拓宽了我们对 GNS 除了溶酶体标记之外的潜在功能的认识。更重要的是，结合之前的 scRNA-seq 分析揭示了中性粒细胞转化过程中动态表达的 NPCDS，我们推测了 AMI 中性粒细胞转化过程中 NPCDS 的生物学机制（图 9B）。引人注目的是，在 N1 亚型早期阶段高表达的基因，包括 TLR2、MAPK14、MYD88、PTK2B 和 MYH9，出现在其相应靶向通路的上游。我们发现，在 N2 亚型晚期出现上调的 MDM2、CFALR 和 GNS 是细胞凋亡和 LDCD 的下游调节因子。总之，我们的研究结果表明，通过 NPCDS 调节的通路（包括 NETosis、细胞凋亡、中性粒细胞迁移和 LDCD）可能代表了 AMI 进展过程中支配 N1-N2 转化的分子程序。![]()
Figure 8 KEGG 数据库和贝叶斯推断相结合，揭示了以 NPCDS 为主导的 AMI 分子特征
我们试图研究 NPCDS 对 AMI 的因果关系和可药性。整体分析过程如图 10A 所示，我们报告了 MDM2 在 MR 检验中呈显著阳性的结果。通过整合暴露数据（MDM2；ID：prot-a-1873）和结果数据（AMIID：ebi-a-GCST90038610）的双样本 MR 分析，我们评估了 MDM2 的表达与 AMI 风险之间的因果关系。根据 MR 方法的三个假设，我们共选择了八个显著的 SNP 作为强 IV 进行分析（图 10B）。在这些被选中的 SNPs 中，rs2279744 是 MDM2 基因座（± 500 kb）上的哨点 SNP，这表明它与 MDM2 的表达有密切的遗传关系（图 10C）。如图 10D 所示，我们将 SNP-MDM2 关系的效应大小（x 轴，SD）和 SNPAMI 关系的效应大小（y 轴，OR）联系起来，在所有五种 MR 方法中都观察到了正的斜率截距。在剔除分析中，我们每次依次剔除一个SNP，以评估结果对每个基因变异的敏感性，结果发现没有一个SNP对结果有显著影响（图10E）。敏感性分析进一步表明，没有观察到异质性和水平多向性（所有 P 值均大于 0.05，补充表 14），保证了 MR 结果的可靠性。具有最强统计能力的 IVW 方法表明，MDM2 的表达可增加 AMI 风险（OR > 1，P 值 < 0.05；图 10F）。虽然其他四种 MR 方法没有产生明显的统计学意义，但 MDM2 与 AMI 之间的正相关性仍然存在，且方向变化一致（OR 均 > 1）。鉴于 MDM2 作为治疗靶点的巨大潜力，我们通过 Enrichr 数据库初步预测了一组靶向 MDM2 的小分子药物。在按 P 值和综合得分排序的前五种药物中，我们最初排除了据说有心脏毒性的钌和紫杉醇。我们最终保留了三种候选药物，包括利多嗪（图 10G）、异桔梗碱（图 10H）和头孢蒽啶（图 10I）。为了测量药物与靶体（MDM2）相互作用的亲和力，并由此了解 MDM2 的可药性，我们使用 AutoVina 将所选的三种药物（配体）与 MDM2（受体）进行了对接。此外，我们还通过 PyMOL 观察了结合亲和力最低且 RMSE 小于 2 Å 的对接模型（图 10J-L 左）。MDM2的结合口袋成功地包含了三种候选药物。此外，我们还分析了药物与 MDM2 氨基酸结合的氢键形式（图 10J-L，右），从而揭示了特异而稳定的结合模式。总之，我们的数据表明了 MDM2 对 AMI 风险的正向因果效应及其潜在的药物价值。![]()
Figure 9 通过磁共振分析和硅内对接，MDM2 被认为是 AMI 的前瞻性靶标
9. 体内实验表明，Mdm2 的丢失会导致中性粒细胞凋亡加重并抑制小鼠中性粒细胞活化为了深入了解Mdm2对中性粒细胞活动的分子调控机制，我们招募了GSE151571（Mdm2基因敲除组与Mdm2基因表达对照组）作为体内实验队列。我们首先对基因敲除组和对照组的四个基因集（包括 p53 信号转导、中性粒细胞凋亡过程和清除、中性粒细胞、参与免疫反应的中性粒细胞活化）进行了 GSEA 分析。如图 11A（左图）所示，GSEA 发现 Mdm2 基因敲除组中 p53 信号转导和中性粒细胞凋亡过程及清除活跃富集（NES > 1）。而参与免疫反应的中性粒细胞和中性粒细胞活化则受到抑制（NES < 1）。此外，我们还采用了ssGSEA来量化富集得分。如图 11A（右图）所示，与对照组相比，基因敲除组 p53 信号转导和中性粒细胞凋亡过程及清除的富集分值更高。同时，涉及免疫反应的中性粒细胞和中性粒细胞活化基因组的富集得分较低。此外，我们还观察到 p53 信号转导与中性粒细胞凋亡过程和清除（图 11B）以及参与免疫反应的中性粒细胞活化（图 11C）之间存在明显的正相关，这表明 p53 信号转导对中性粒细胞的活动具有密切的调控作用。总之，这些结果表明，Mdm2的缺失似乎提高了p53信号转导的活性，从而加剧了中性粒细胞的凋亡，减弱了中性粒细胞的活化（图11D）。![]()
Figure 10 敲除 Mdm2 会加剧小鼠中性粒细胞的凋亡并减轻中性粒细胞的激活
研究结论：
我们的研究提供了一种中性粒细胞衍生的程序性细胞死亡特征（简称 NPCDS），它在八个独立的外周血队列中显示出卓越的 AMI 预测性能。我们基于机器学习的整合框架生成了 NPCDS，它是 RF 和 Stepglm 在九个基因面板（MDM2、PTK2B、MYH9、IVNS1ABP、MAPK14、GNS、MYD88、TLR2、CFLAR）上拟合的组合。此外，我们还利用 NPCDS 发现了急性胰腺炎患者的新分子亚型，其中中性粒细胞活性较高的亚型 1 更容易出现不良临床结果。重要的是，我们发现了中性粒细胞从促炎状态向抗炎状态转化的 NPCDS 的生物学机制。通过磁共振分析，我们发现 MDM2 表达升高与急性心肌梗死风险之间存在正向因果关系。我们还揭示了 MDM2 在治疗急性心肌梗死方面的药物价值，它有可能通过触发中性粒细胞凋亡来缓解炎症。总之，我们的 NPCDS 模型在 AMI 患者的诊断、分层和治疗的临床应用中具有巨大潜力。参考文献：
Zhu Y, Chen Y, Zu Y. Leveraging a neutrophil-derived PCD signature to
predict and stratify patients with acute myocardial infarction: from AI
prediction to biological interpretation. J Transl Med. 2024 Jul 2;22(1):612.
doi: 10.1186/s12967-024-05415-0. PMID: 38956669; PMCID: PMC11221097.![]()
生信分析：鉴定嗜中性粒细胞相关 PCD 基因，基于基于 ML 的集成框架构建嗜中性粒细胞相关 PCD 特征（NPCDS），将 NPCDS 与已发表的 AMI 预测特征进行比较，使用 NPCDS 和临床信息开发临床列线图，使用 NPCDS 建立 AMI 分子亚型，预处理 scRNA-seq 分析，scRNA-seq分析，细胞类型注释和伪时间分析，基于 KEGG 数据库和贝叶斯网络的 NPCDS 通路分析，基于 ML 的集成框架构建嗜中性粒细胞相关 PCD 特征（NPCDS），基于KEGG数据库和贝叶斯网络的NPCDS通路分析，MDM2与AMI关联的双样本MR分析，候选药物预测和分子对接，Mdm2基因敲除小鼠中性粒细胞相关活动分析
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课题设计与申报|分子生物学实验|细胞功能|机制调控|多组学检测分析
