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血管内皮生长因子（VEGF）是最强大的促血管生成因子之一，在多种疾病中起着重要的作用。糖酵解速率的增加和乳酸积累与病理性血管生成有关。在这里，我们展示了在内皮细胞中，H3K9乳酸化（H3K9la）和组蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）之间的反馈环路驱动了VEGF诱导的血管生成。我们发现，在VEGF刺激下，内皮细胞中的H3K9la水平会上调。糖酵解的药理抑制减少了H3K9乳酸化并减弱了新生血管形成。CUT&Tag分析揭示H3K9la在一组促血管生成基因的启动子上富集，并促进它们的转录。有趣的是，我们发现H3K9的过度乳酸化抑制了乳酸化擦除剂HDAC2的表达，而HDAC2的过表达减少了H3K9乳酸化并抑制了血管生成。总的来说，我们的研究说明H3K9la对VEGF诱导的血管生成至关重要，而打断H3K9la/HDAC2反馈环路可能代表了一种治疗病理性新生血管化的新型治疗方法。本文于2024年6月发表于“Genome Biology”（IF=10.1）上。技术路线
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结果：
1）内皮细胞中的H3K9乳酸化反应在VEGF刺激下增加
血管内皮生长因子（VEGF）是最强大的促血管生成因子。VEGF治疗以剂量依赖性的方式促进了原代人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）的增殖、迁移和管形成能力（图1A-C）。HRMECs在VEGF刺激下，乳酸脱氢酶A（LDHA）表达增加，并且乳酸水平上调（图1D）。我们研究了乳酸含量上调是否促进了内皮细胞中的组蛋白乳酸化。我们分析了一系列已知的组蛋白乳酸化残基的乳酸化水平，包括H4K12la、H4K5la、H3K18la、H3K14la和H3K9la。我们观察到，在VEGF刺激下，H3K9的乳酸化水平显著上调（图1E）。我们检查了氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型中的H3K9la水平。我们发现H3K9la随着OIR进展而增加，在P17（OIR中新生血管生成的峰值）达到峰值，并在第25天下降（图1F）。与同龄对照组相比，OIR小鼠的视网膜内皮细胞中的H3K9la水平升高（图1G）。这些结果表明，VEGF诱导的血管生成特征是H3K9乳酸化，并且可能参与视网膜新生血管生成。![]()
2）抑制H3K9la在体内和体外抑制血管生成
由于乳酸是乳酸化的底物，我们使用糖酵解抑制剂来抑制乳酸产生，以检验抑制组蛋白乳酸化是否能够抑制血管生成。如前所述，所使用的糖酵解抑制剂包括非代谢性葡萄糖类似物-2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG），丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）抑制剂-二氯乙酸盐（DCA），以及乳酸脱氢酶（LDH）抑制剂-galloflavin（GF）（图2A）。我们发现这些抑制剂显著降低了细胞乳酸产生和H3K9乳酸化（图2B–D）。值得注意的是，随着H3K9乳酸化水平的降低，内皮细胞的迁移、增殖和管形成能力显著受到抑制（图2E–G）。然后我们在OIR小鼠中应用了抑制剂治疗。因此，我们发现抑制剂治疗在体内降低了H3K9乳酸化，并减轻了OIR小鼠的病理性新生血管生成，但并未影响无血管区域的比例（图2H–K）。总之，上述结果表明H3K9乳酸化对血管生成至关重要，抑制H3K9乳酸化可能代表了一种有效抑制新生血管生成的方法。![]()
3）全基因组的CUT& Tag分析鉴定H3K9乳酸化的潜在下游靶点
组蛋白修饰在调节目标基因的转录中起着重要作用。全基因组CUT& Tag分析是研究蛋白质-DNA相互作用的一种新描述方法。因此，我们进行了CUT& Tag分析，以识别在内皮细胞（ECs）中受H3K9la调控的候选基因（图3A）。简而言之，将HRMECs用0或100 ng/ml VEGF处理24小时。使用针对H3K9la的抗体进行CUT& Tag分析，并用深度工具分析结果显示，H3K9la峰在内皮细胞中富集（图3B,C）。结果显示，在两组中均识别出13,279个H3K9la结合峰，超过55%的结合峰位于启动子序列（< 3 kb）（图3D, E）。为了分析VEGF刺激下内皮细胞中H3K9la的表观遗传调节效应，我们对具有差异结合峰的目标基因进行了GO和KEGG分析。有趣的是，我们发现上调的峰相关基因在多个与新生血管生成相关的途径中富集，包括细胞增殖、细胞迁移、粘着连接和血管生成（图3F, G）。![]()
4）H3K9乳酸化激活与血管生成相关的多个基因的转录
考虑到H3K9la的乳酸化水平在VEGF刺激的内皮细胞中上调，并且过度乳酸化的H3K9在与血管生成途径相关的基因中富集，我们进一步研究了这些基因的表达是否在VEGF刺激下升高。具体来说，CUT& Tag分析显示，在VEGF刺激的HRMECs中，候选基因的启动子上H3K9la的水平上调，包括NECTIN1 、TGFBR2、ABL1、PTGFR、LAMA4、CLASP2、PRCP和EGFR，这些基因与上述感兴趣的途径相关（图4A–D）。此外，qPCR检测确认了这些基因在VEGF刺激的内皮细胞中的表达水平显著上调（图4E–H）。总的来说，这些结果表明H3K9乳酸化可能通过促进编码促血管生成蛋白的多个基因的表达来参与血管生成，以响应VEGF刺激。![]()
5）由H3K9乳酸化和HDAC2驱动的反馈回路促进血管生成
有趣的是，CUT& Tag分析显示，在VEGF刺激的内皮细胞中，HDAC2启动子上的H3K9la水平降低（图5A）。我们观察到在VEGF刺激的内皮细胞中，HDAC2的mRNA和蛋白质水平表达都下降了（图5B,C）。先前的一项研究报道，HDAC2是一种有效的乳酸化擦除剂。我们假设存在一个反馈环路，其中VEGF刺激增加了H3K9乳酸化，然后抑制了HDAC2表达；HDAC2表达的减少反过来促进了H3K9乳酸化并提高了目标血管生成基因的表达（图5D）。为了确认VEGF/H3K9la/HDAC2反馈环路对内皮细胞的功能影响，我们使用慢病毒在VEGF刺激的内皮细胞中过表达HDAC2。转染效率超过90%（图5E）。我们观察到HDAC2的过表达导致H3K9乳酸化显著降低（图5F）。与我们之前显示H3K9la激活基因表达的结果一致，我们发现这些血管生成基因在HDAC2过表达的内皮细胞中的水平下降了（图5G,H）。同时，HDAC2的过表达抑制了内皮细胞的血管生成（图5I–K）。总的来说，这些结果揭示了HDAC2的过表达破坏了内皮细胞中的VEGF/ H3K9la/ HDAC2反馈环路并抑制了血管生成。![]()
结论：
我们发现糖酵解的上调促进了VEGF刺激的内皮细胞中H3K9la的乳酸化。抑制乳酸化有效抑制血管生成。在机制上，CUT& Tag分析显示H3K9乳酸化促进了一组与血管生成相关的基因的转录。此外，我们在内皮细胞中发现了H3K9la和Kla橡皮擦HDAC2之间的反馈回路，该回路调节血管生成。总的来说，我们的数据将病理性血管生成与糖酵解衍生的乳酸化联系起来，并表明在血管生成途径中H3K9la和HDAC2之间存在反馈回路。参考文献：
Fan W, Zeng S, Wang X, Wang G, Liao D, Li R, He S, Li W, Huang J, Li X, Liu
J, Li N, Hou S. A feedback loop driven by H3K9 lactylation and HDAC2 in
endothelial cells regulates VEGF-induced angiogenesis. Genome Biol. 2024 Jun
25;25(1):165. doi: 10.1186/s13059-024-03308-5.![]()
常规分子实验：RT‑qPCR，Western blotting，免疫荧光，CHIP实验，CUT& Tag
细胞实验：Transwell，管形成实验，EdU细胞增殖实验
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谢谢！
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