胰腺导管腺癌（PDAC）是一种毁灭性的癌症，由于远处转移，即使在早期，预后也很差。通过RNA测序和多重免疫荧光，本研究发现与非转移性（T1M0）患者相比，早期肝转移（T1M1）患者的PDAC中混合谱系激酶结构域样激酶（MLKL）表达升高，坏死性凋亡途径增强。在机制上，MLKL驱动的坏死性凋亡招募巨噬细胞，增强肿瘤CD47“不要吃我”信号，诱导巨噬细胞胞外陷阱（MET）形成，从而激活CXCL8。CXCL8进一步启动上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT），上调ICAM-1表达，促进内皮细胞粘附。METs也降解细胞外基质，最终支持PDAC肝转移。同时，靶向坏死性凋亡和CD47可减少体内肝转移。因此，本研究的研究表明，坏死性凋亡通过逃避免疫监测促进PDAC转移，同时也表明CD47阻断剂联合MLKL抑制剂GW806742X可能是一种有希望的新辅助免疫治疗方法，可以克服T1M1困境，恢复根治性手术的机会。该文章于2024年发表在《Nature communications》，IF：16.6。
为了鉴定早期T期PDAC中可能导致肝转移的基因，本研究对T1M1期（原发肿瘤大小≤2cm，伴有肝转移，n = 6）和T1M0期（原发肿瘤大小≤2cm，无肝转移，n = 6）肿瘤和匹配的癌旁组织（图1a-c）的临床PDAC组织样本进行了RNA-seq测序。该分析显示，通过KEGG和GO分析发现2142个差异表达基因（DEGs）与坏死性坏死相关（图1d, e），其中MLKL是上调幅度最大的基因。然后，本研究将这2142个DEGs与T1M1和T1M0 PDAC病例中PDAC组织中相对于正常组织中上调的基因进行交叉对照，从而得到一组216个重叠的DEGs（图1f）。再一次，根据KEGG和GO分析，这216个DEGs在与坏死性坏死相关的途径中富集（图1g）， MLKL仍然是该亚群中最显著上调的基因（图1f）。
本研究进一步研究了坏死性凋亡的功能性抑制剂MLKL在早期T期PDAC肝转移发展中的作用。本研究的研究结果显示，与正常组织和胰腺导管上皮细胞相比，PDAC组织中的MLKL表达显著上调，这与TCGA队列和本研究内部队列的研究结果一致。MLKL表达升高与较差的生存相关，特别是肿瘤长度≤2cm，较小肿瘤的肝转移较大，分化较低，肿瘤分期较晚期（图1）。此外，在本研究的PDAC队列中，本研究注意到MLKL磷酸化随着MLKL表达的增加而增加，这表明坏死性凋亡增加（图1i）。T1M1和T1M0肿瘤原发组织的WB分析证实了MLKL及其磷酸化形式p-MLKLS357/S358/T360的上调（图1j），表明坏死性凋亡的激活。其他坏死相关分子，包括RIPK1、RIPK3、p-RIPK1和p-RIPK3的水平没有显著差异。这些发现表明，MLKL介导的坏死性凋亡的异常升高在T1M1 PDAC患者中起着关键作用。
为了研究MLKL介导的坏死性凋亡在T1M1 PDAC中的作用，本研究从T1M1和T1M0 PDAC患者的相应临床原发肿瘤组织中创建了类器官，用于RNA-seq（图1k）。随着MLKL表达水平的升高，坏死性凋亡活化的T1M1 PDAC患者源性类器官（PDOs）的生长速度显著降低（图1k，图2a）。用MLKL抑制剂GW806742X （GW）治疗可以有效逆转T1M1 PDOs的生长停滞和坏死性凋亡水平（p-MLKL水平）的增加，而用RIPK1/3抑制剂（Nec-1, GSK-872）治疗则没有（图2a）。这些结果表明，MLKL的异常增加通过促进坏死性凋亡来抑制肿瘤，并且MLKL的激活依赖于T1M1 PDAC中与RIPK3无关的机制。
为了进一步探索这一假设，本研究首先研究了RIPK1、RIPK3和MLKL在TCGA PDAC样本和CCLE PDAC细胞系中的表达，然后，本研究使用RIPK3null的PANC1细胞系和RIPK3high的AsPC-1细胞系，同时异位过表达MLKL来模拟T1M1 PDAC中MLKL驱动的坏死性凋亡的异常升高。MLKL过表达不影响RIPK1/3的表达或磷酸化，但确实增加了p-MLKL水平和MLKL低聚物的水平（图2b）。通过检测裂解型caspase-3和裂解型caspase-8的水平，MLKL过表达并未显著改变细胞凋亡水平（图2b）。MLKL过表达导致坏死性凋亡显著增加，其特征为质膜穿孔、细胞质渗漏、细胞肿胀和核破裂（图2c）；这些影响伴随着MLKL磷酸化、MLKL寡聚物水平升高、坏死、ATP和HMGB1释放以及细胞活力降低，这些都是由GW而不是Nec-1或GSK-872所拯救的（图2d-h）。此外，本研究在胰腺导管上皮细胞（HPNE细胞系）中没有观察到类似的MLKL表达模式和RIPK3独立的坏死性凋亡模式，这进一步支持了MLKL异常升高介导肿瘤细胞而不是胰腺导管上皮细胞坏死性凋亡的特异性。综上所述，这些结果表明，肿瘤细胞中MLKL异常升高介导的坏死性凋亡（MLKL驱动的坏死性凋亡）与早期T期PDAC的肝转移有关。
由于MLKL与肝转移增加有关，但肿瘤大小减小，本研究进一步研究了MLKL驱动的坏死性坏死对PDAC细胞增殖和转移能力的影响。在类器官同源基质中，与T1M0 PDAC来源的肿瘤细胞相比，T1M1 PDAC组织来源的肿瘤细胞形成更小的聚集体，但具有更强的侵袭性表型（图3a）。在体外，MLKL过表达降低癌细胞生长，破坏细胞间连接，诱导间质纺锤样形态（图3b）；增殖细胞核抗原（PCNA）水平的测量和3D肿瘤球测定反映了MLKL过表达对PDAC的影响：抑制生长，但增强侵袭性（图3c, d）。相反，MLKL敲除会降低肿瘤的起始和转移能力。
本研究以NOD-SCID和C57BL/6小鼠为模型评估肝转移性坏死。从KRASG12D/+收集的PDAC肿瘤细胞；p53R172H / +；将过表达MLKL的pdx-1Cre/+（KPC）自发性癌小鼠模型或免疫荧光可追踪的对照载体注入脾脏。MLKL过表达小鼠脾脏荧光较弱，与体外实验结果一致（图3e）。值得注意的是，MLKL过表达的C57BL/6小鼠的肝转移增加，而NOD-SCID小鼠的肝转移无显著差异，说明MLKL促进转移的作用依赖于免疫系统（图3e）。此外，脾脏检查显示MLKL过表达小鼠的巨噬细胞浸润增加（图3f），这与先前的报道一致22。GW治疗和巨噬细胞消耗逆转了肝转移的增加，而不影响脾脏的原发性肿瘤病变（图3g）。为了进一步研究巨噬细胞依赖的MLKL驱动的坏死性凋亡的促转移作用，本研究进行了体外共培养实验，结果表明，通过细胞骨架染色，在2D或3D条件下，MLKL过表达的PDAC细胞与巨噬细胞共培养时，侵袭行为增加。这种效应在GW治疗后是可逆的（图3h）。
在本研究的原位异种移植C57BL/6小鼠模型中，MLKL驱动的坏死性上闭对转移能力有显著影响。过表达MLKL的小鼠表现出大量肝转移的发生率增加（图3i），相反，敲除MLKL的小鼠表现出肝脏转移的肿瘤负担减轻。在原发肿瘤大小方面，OE-MLKL组观察到原发肿瘤较小（图3i），而敲除MLKL并没有显著促进体内原发肿瘤大小。这可能表明MLKL驱动的坏死性性凋亡与肝转移能力之间存在更直观的联系。本研究还观察到MLKL过表达小鼠的巨噬细胞浸润增加。GW治疗和巨噬细胞消耗降低了肝转移的发生率（图3j）。这些结果表明，免疫能力对于MLKL驱动的坏死性凋亡引起的肝转移是必不可少的，这反映了一种牺牲性损伤促进转移的机制。
为了揭示MLKL驱动的坏死性凋亡如何促进免疫依赖性PDAC肝转移，本研究对原位C57BL/6小鼠模型的原发肿瘤进行了scRNA测序（每组n = 3；图4）。从原位肿瘤样本中，本研究鉴定出115,691个单细胞，这些细胞聚集成28个独特的簇（图4b, c）。然后，本研究根据对这些簇（2、4、8、10、16和17）的拷贝数变异（CNV）分析进一步鉴定出上皮基因转录物显著富集的癌细胞（非整倍体），包括EHF、PIL5、CST3、TNC、LPLl、IL11、CADM1、COL18A1、GM6093、FST、GM49504、NEAT1和TSC22D3（图4d, e）。在代表不同细胞类型的其他22个簇中，巨噬细胞群体中OE-Vector组与OE-MLKL组之间存在显著差异（图4f）。
进一步分析巨噬细胞群体，发现OE-Vector组和OE-MLKL组存在明显的极化现象，前者M2巨噬细胞较多，后者M1巨噬细胞较多（图4h）。然后，本研究通过单细胞轨迹分析检查巨噬细胞（图4i）。根据OE-MLKL组的伪时间轨迹，M1标记基因H2-Aa的增加表明M1极化增加（图4i）。此外，基于QuanTIseq分析，对T1M1和T1M0 PDAC患者肿瘤的RNA-seq分析显示，T1M1 PDAC患者肿瘤中M1巨噬细胞浸润评分更高（图4j）。
接下来，本研究将PANC-1细胞与THP-1来源的巨噬细胞（M0）共培养72小时，并通过RNA-seq分析巨噬细胞（图4k）。与过表达MLKL的PANC-1细胞共培养，导致M1巨噬细胞标志物CD86上调，M2巨噬细胞标志物CD163下调（图41）。KEGG分析显示巨噬细胞活化富集，GO分析显示多种细胞因子和趋化因子信号通路富集，提示对MLKL驱动的坏死性凋亡和巨噬细胞募集有免疫应答（图4 m，n）。流式细胞术进一步验证了与PANC-1-OE-MLKL或AsPC-1-OE-MLKL细胞共培养的巨噬细胞M1极化增加。对PDAC TCGA数据集的QuanTIseq分析也表明，PDAC中MLKL表达与M1巨噬细胞浸润呈正相关。
MLKL驱动的肿瘤细胞坏死导致细胞内容物、细胞因子、抗原和碎片的释放，吸引吞噬细胞进行清除。本研究探索了PDAC细胞和巨噬细胞之间的相互作用，特别是肿瘤杀伤M1 tam之间的相互作用。在共培养模型中，本研究观察到肿瘤细胞活力或增殖没有进一步降低，但确实观察到侵袭性表型增加，正如本研究之前报道的那样（图5a, b）。巨噬细胞，尤其是M1巨噬细胞，可以清除碎片并杀死呈递抗原的肿瘤细胞。通过scRNA-seq分析对照载体和MLKL过表达的小鼠肿瘤巨噬细胞，发现抗原呈递途径存在显著差异。本研究研究了吞噬作用，发现MLKL过表达促进肿瘤细胞逃避巨噬细胞的吞噬作用，但这种作用被GW处理消除了（图5a - f）。
为了研究吞噬能力降低的机制，本研究首先测量了巨噬细胞对gfp标记的大肠杆菌的吞噬能力，结果显示巨噬细胞具有完整的吞噬能力。这促使人们对肿瘤细胞的抗吞噬潜能进行研究。本研究重点研究了“不要吃我”信号——CD47/SIRPα轴和CD24/Siglec10轴。本研究的RNA-seq结果显示CD47上调，但SIRPα、CD24或Siglec10的表达没有变化（图41）。在共培养实验中，PANC-1-OE-MLKL细胞中CD47的表达增加，而其他因子的表达保持不变（图5g）。拟时序分析显示，OE-MLKL C57BL/6原位模型巨噬细胞中SIRPα表达相似，癌细胞中CD47表达增加（图5h）。此外，在共培养实验中观察到CD47表达增加，并且通过添加GW逆转了这种变化（图5i）。然而，抗cd47的使用挽救了增强的抗吞噬能力（图5j）。
有趣的是，当肿瘤细胞单独培养时，CD47的表达保持不变，这表明MLKL单独不上调肿瘤细胞中的CD47。因此，本研究进一步研究了共培养实验中CM对CD47的调节作用。PANC-1-OE-MLKL细胞和巨噬细胞共培养的CM更大程度上上调了CD47的表达，但GW处理消除了这种作用（图5k）。这些发现表明，CM可能通过细胞因子上调巨噬细胞CD47的表达。值得注意的是，在已知的CD47上调细胞因子（IL-6, IL-1β， TNF和IFN-γ）25中，IL-6在共培养实验中被发现是最高的，并且在此背景下负责CD47的上调（图51,m）。进一步的研究表明，IL-6主要来自共培养的巨噬细胞，而不是来自坏死细胞。在体内，CD47也被发现上调。抗IL-6和GW处理可逆转这种效应（图5n）。此外，肝转移灶保持高CD47表达。与肿瘤组织WB分析一致，PDOs的免疫荧光分析也显示T1M1 PDAC肿瘤中CD47表达上调（图5O）。这些发现表明，MLKL驱动的坏死性凋亡招募并激活了更多的巨噬细胞，这可能有助于肿瘤细胞对吞噬产生抵抗并确保其存活。
从吞噬中存活并不一定意味着转移，本研究假设癌细胞“先存活，然后转移”可能在起作用。本研究的重点转移到肿瘤细胞获得抗吞噬能力后的变化。3D侵袭和迁移实验显示，MLKL过表达的肿瘤细胞在与巨噬细胞共培养时具有更大的转移能力，而这种效应被GW处理逆转（图6a, b）。假时间分析显示了EMT轨迹，这得到了体外WB分析的支持（图6c, d）。与巨噬细胞共培养的MLKL过表达的肿瘤细胞在小鼠中表现出更高的肝转移发生率，而在GW处理的肿瘤细胞中则没有（图6e）。提示巨噬细胞相互作用后转移能力增强。
在检查形态学变化时，本研究注意到巨噬细胞与过表达MLKL的肿瘤细胞共培养时，巨噬细胞周围形成网状结构，类似于巨噬细胞细胞外陷阱（METs）。本研究通过MET标记（组蛋白H3、CitH3和MMP2的瓜氨酸化）的FISH染色证实了这些结构是MET，它们是共定位的（图6f）。在与肿瘤细胞共培养的巨噬细胞中，多种MET标记物（CitH3、MPO、MMP2、MMP9和MMP12）升高，但这种效果可以通过MET抑制剂（特定的PADI4抑制剂Cl-amidine）或GW治疗来恢复（图6g, h）。对过表达MLKL的C57BL/6原位模型小鼠的原发肿瘤组织进行荧光染色，结果显示MET增加，但用MET抑制剂或GW处理后，MET消失（补充图8d）。SYTOX-Orange染色还显示，在与OE-MLKL肿瘤细胞共培养的巨噬细胞中，DNA支架（METs的关键成分）增加，GW处理逆转了这种作用（图6i）。C57BL/6原位模型的血浆中CitH3水平显示巨噬细胞耗竭而非中性粒细胞耗竭导致CitH3增加，支持NETs上METs的形成（图6j）。这些证据表明MLKL驱动的坏死性凋亡诱导了METs的形成。
为了了解PDAC微环境中METs的形成，本研究研究了MLKL驱动的坏死性坏死对巨噬细胞的影响。来自坏死性凋亡细胞的CM增加了巨噬细胞中的METs标记物，而来自GW处理的肿瘤细胞的CM逆转了这一效应，表明在诱导METs中存在一种涉及坏死性凋亡释放的细胞因子的旁分泌机制。本研究使用细胞因子抗体阵列描绘CM成分，发现CXCL8、CCL5、CCL2、TGF-β1、GRO等显著增加。在这些细胞因子中，已知CXCL8促进致病性感染中METs的形成，而CCL5、CCL2和GRO招募巨噬细胞并促进巨噬细胞M1极化27。本研究证实了这些基因在过表达MLKL的肿瘤细胞中的转录增加。在单独培养的MLKL -过表达肿瘤细胞衍生的CM中，中和CXCL8不能诱导MET的形成，这在WB分析和SYTOX染色中可见。在体内，用抗CXCL15抗体（CXCL15，人类CXCL8的同源物）治疗可消除原发性C57BL/6原位肿瘤中MET的形成。这些结果表明，MLKL驱动的坏死性凋亡诱导的CXCL8释放可触发MET的形成。
本研究研究了M1 TAM富集微环境中met形成的增加是否会增强MLKL过表达肿瘤细胞的转移能力。结果显示，用PADI4特异性抑制剂CL-MI抑制METs，在体内可减轻MLKL过表达诱导的肝转移，在体外可减轻MLKL过表达诱导的EMT（图6k）。这种抑制作用还减少了注射过表达MLKL的肿瘤细胞的NOD-SCID小鼠的肝脏转移（图6l），证实MLKL驱动的坏死性凋亡诱导MET形成，增强肿瘤细胞转移。T1M1-PDAC肿瘤组织中EMT和METs增加的相似模式以及原位模型的体内免疫组化结果进一步支持了这一点。这些发现表明，MLKL驱动的坏死性凋亡促进METs的形成，增强PDAC细胞的转移能力，同时逃避巨噬细胞的吞噬。
然后本研究深入研究了MET形成的后果。本研究用含METs的CM处理野生型PANC-1细胞，并进行了RNA-seq和WB分析（图7a, b）。RNA-seq分析显示KEGG和GO数据库中与转移相关的术语上调，如“EMT的正调节”、“细胞粘附”、“细胞迁移”、“ECM组织”和“胶原降解”，这使本研究假设含METs的CM可以促进不同阶段的转移（图7c, d）。在DEGs中，EMT标记物的表达，包括N-cadherin、WB分析证实，VIM、Snail和ZEB1表达上调（图7e、f）。单独培养时，这些EMT标记在过表达MLKL的PDAC细胞中表达保持不变（图7g）。这些发现表明，仅MLKL不足以诱导PDAC细胞EMT，是坏死微环境诱导的一系列细胞因子将EMT信号传递给附近存活的肿瘤细胞，从而支持转移。
本研究随后研究了METs的形成如何影响TME中的细胞因子和趋化因子成分。来自共培养细胞的CM中的细胞因子和趋化因子表现出炎症相关细胞因子（IL-6、CXCL8、GM-CSF、CCL-8、CCL-7和CCL-2）水平升高（图7小时），已知这些细胞因子通过其受体增强EMT。为了了解METs在促进转移中的作用，本研究使用MET抑制剂（Cl-amidine）作为扰动方法，发现MET显著促进了CXCL8、IL-6和GM-CSF的升高（图7i）。这些细胞因子（CXCL8、IL-6和GM-CSF）通过其受体（分别为CXCR1/2、IL6R和GM-CSFR）增强肿瘤细胞EMT，从而促进肿瘤转移。有趣的是，过表达MLKL的肿瘤细胞上的受体表达保持不变。单独中和CXCL8、GM-CSF或IL-6并不能完全抑制共培养CM促进的EMT的增加（图7j）。虽然MET抑制剂在一定程度上抑制了EMT，但效果不如GW。这表明MLKL驱动的坏死性凋亡通过协调各种细胞因子的作用，包括与METs相关的作用，增强了PDAC的转移能力。
接下来，本研究进一步寻求确定关键的细胞因子受体途径，负责驱动转移超越EMT调节。通过分析T1M1-PDAC和T1M1-PDAC的RNA-seq数据，本研究的KEGG分析发现，CXCR通路是唯一的细胞因子相关通路，据报道，CXCR通路是CXCL家族的趋化因子受体，通过EMT、细胞内粘附、血管生成等多个步骤增强肿瘤转移，以支持远处转移。在丰度显著增加的细胞因子和趋化因子中，CXCL8是CXCR1/2受体广泛认可的配体，具有双重促瘤作用，包括促进肿瘤血管生成和通过CXCR1/2受体促进肿瘤细胞跨内皮的粘附。因此，本研究假设CXCL8-CXCR1/2轴在肝转移中起重要作用。
氧化石墨烯分析显示细胞粘附变化明显（图7c），有报道称CXCL8上调ICAM1，促进PDAC细胞与内皮细胞之间的粘附，导致PDAC肝转移。根据本研究的RNA-seq数据，除了CDH1/CDH2 （E-cadherin/N-cadherin）外，ICAM1在T1M1 PDAC组织和含有METs的CM处理的PDAC细胞中均上调，这表明METs可能通过ICAM1影响肿瘤细胞粘附（图7e，图7k）。本研究发现，在与巨噬细胞共培养的过表达MLKL的肿瘤细胞中，CXCL8增加了ICAM1的表达，而单独培养过表达MLKL的肿瘤细胞时，没有观察到任何变化。这表明共培养实验中的CM可以上调肿瘤细胞中的ICAM1。共培养实验中的CM处理野生型PANC-1和AsPC-1细胞，增加了这些细胞上ICAM1的表达。在CM中和CXCL8或将CM与MET抑制剂或GW共培养实验中的CM进行处理，可以消除ICAM1的增加。在肿瘤细胞-内皮细胞相互作用黏附模型的功能实验中，黏附持续受到影响（图71，m），表明CXCL8也上调ICAM1，促进肿瘤细胞与内皮细胞之间的黏附。在体内，抗CXCL15也降低了原位模型中肝转移的发生率。在T1M1 PDAC细胞中，ICAM1和CXCL8的水平也升高。这些结果强调了CXCL8在MLKL驱动的坏死性凋亡诱导的肿瘤转移的多个步骤中的关键作用。
本研究的研究结果表明，METs介导的细胞因子CXCL8通过增强EMT和内皮细胞粘附，在坏死介导的PDAC转移中发挥作用。本研究感兴趣的是METs是否与不同形式的CXCL8（激活或非激活）相关。本研究的ELISA和细胞因子阵列数据表明，MLKL驱动的坏死性凋亡导致CXCL8的释放，从而诱导MET的形成，这些MET进一步导致共培养系统中CXCL8水平的增加。考虑到ELISA对不同形式的CXCL8的检测缺陷，本研究开发了一种结合分子排斥色谱法的ELISA来分析CXCL8的活性单体形式（图8a）。与单独培养的肿瘤细胞衍生的CM相比，在共同培养实验衍生的CM中，参与MLKL驱动的坏死性凋亡的CXCL8（单体）活性形式的数量要大得多（图8b）。
为了进一步证实METs在增加活性CXCL8单体中的作用，本研究引入了METi，它降低了CM中CXCL8单体的水平（图8c）。CXCL8的活化涉及基质金属蛋白酶（MMPs）。MMPs可以将CXCL8切割成不同长度的片段，其中72AA形式的CXCL8被认为是最具生物活性的。METs与DNA支架上的MMP相关。因此，本研究假设METs将CXCL8捕获在DNA支架上，在那里它被MMPs切割。为了验证这种可能性，本研究使用了MMP抑制剂（MMP2抑制剂，MMP2-IN-1, 10Um；MMP9抑制剂，MMP-9-IN-1, 10µM；MMP12抑制剂，MMP408, 2 nM）和DNA支架消化器（Dnase I）共培养体系。DNase I和MMP12抑制剂有效地阻止了CXCL8的激活（基于CXCL8单体水平），而MMP9和MMP2抑制剂只有适度的作用（图8c）。本研究进行了共聚焦显微镜成像，观察到大量的CXCL8粘附在METs释放的DNA网络骨干上并与MMP12共定位，但只有少量与MMP2或MMP9共定位（图8d, e）。这进一步加强了METs的DNA支架为MMP12切割提供了一个位点的观点。
CXCL8的二聚化区（残基23-29）与MMP切割位点重合（图8f）。本研究用不同的MMP抑制剂进行的实验验证了MMP12是CXCL8切割的关键酶，它可以阻止二聚体的形成，并有利于单体形式（图8g）。这一发现支持了本研究的假设，即METs作为支架，捕获CXCL8，然后被met相关的MMP12有效地切割，释放CXCL8作为促进转移的活性单体。
METs触发的CXCL8在促进与肿瘤的串扰、增强EMT和其他可溶性细胞因子以及促进肿瘤细胞粘附内皮中发挥作用。如KEGG和GO分析所示，为了完成转移过程，肿瘤细胞必须通过ECM，这涉及胶原降解和MMPs活性（图7c, d）。T1M1 PDAC样品显示肿瘤转移友好的ECM，很少有胶原阻塞。本研究通过明胶酶谱分析发现，来自共培养实验（MLKL过表达的肿瘤细胞和巨噬细胞）的CM消化明胶的能力有所提高，但这种特性被MMP抑制剂、MET抑制剂和GW逆转，主要受MMP2和MMP9的影响。本研究对小天狼星红染色原位肿瘤的体内分析也显示ECM减少（，单独抑制MMP2或MMP9不如MET抑制剂或GW有效。这些发现表明，METs建立了一个促转移的ECM降解生态位，通过多个步骤促进肝转移。
为了进一步验证本研究的发现，本研究在微阵列上对96个不同水平MLKL表达的PDAC患者外部组织进行了多重免疫荧光染色（mIFS）。较高的MLKL水平对应于较低的E-cadherin水平和较高的CD47和CitH3水平，表明“不要吃我”信号增加和METs增加（图9a-c）。
在以MLKL、METs和CD47为靶点的体内实验中，本研究观察到巨大的治疗潜力。GW有效地抑制了与巨噬细胞共培养的KPC小鼠源性类器官的转移能力及其形成METs的能力，与METi （Cl-amidine）处理所观察到的结果相似（图9d）。Anti-mCD47有效抑制类器官生长（图9d）。GW联合抗mCD47抗体对类器官生长和转移能力的抑制作用最为显著，当T1M1 PDAC PDOs与外周血单核细胞（PBMC）来源的巨噬细胞共培养时，也获得了类似的结果（图9e, f）。
考虑到当MLKL过表达时，GW在抑制肿瘤转移潜能方面表现出显著的令人兴奋的表现（图9d，e，图3g，j），本研究进一步研究了它的脱靶效应，因为有报道称它也能抑制VEGFR2，一种关键的血管生成因子。本研究发现MLKL的过表达对原位肿瘤中VEGFR2的表达水平没有显著影响。在原位肿瘤中，GW对OE-Vector组血管生成没有明显影响。然而，在OE-MLKL组中，它可以有效抑制血管生成的升高。考虑到GW对OE-Vector组小鼠肝转移瘤负荷的类似影响（图3g），这些结果表明，在这种情况下，GW的VEGFR2抑制作用在减轻转移能力方面可以忽略不计或可有可无。
在肿瘤大小控制方面，当将过表达MLKL的KPC细胞皮下移植到C57BL/6小鼠体内时，联合方案在肿瘤大小控制和生存方面的改善最大，超过了单独阻断GW或CD47（图9g, h）。在肝转移小鼠模型中，GW表现出良好的抑制肝转移的表现，联合治疗方案诱导的治疗效果最好，减少了肝转移和原发肿瘤负担，提高了生存率（图9i, j）。当评估C57BL/6原位模型小鼠的总肿瘤负担时，联合治疗对肿瘤负担和肝转移发生率的降低效果最大（图9k, l）。未观察到体重的显著波动（图9m）。联合方案耐受性良好，无明显的全身毒性。
总之，本研究的研究揭示了MLKL驱动的坏死性凋亡在早期T期PDAC伴肝转移中的作用，包括吞噬抵抗、METs形成和创造促转移生态位。本研究建议一种有希望的联合治疗方案，包括GW和抗CD47，以解决治疗早期T期PDAC伴肝转移的临床挑战，旨在实现根治性手术。
Liao, C. Y., Li, G., Kang, F. P., Lin, C. F., Xie, C. K., Wu, Y. D., Hu, J. F., Lin, H. Y., Zhu, S. C., Huang, X. X., Lai, J. L., Chen, L. Q., Huang, Y., Li, Q. W., Huang, L., Wang, Z. W., Tian, Y. F., & Chen, S. (2024). Necroptosis enhances 'don't eat me' signal and induces macrophage extracellular traps to promote pancreatic cancer liver metastasis. Nature communications, 15(1), 6043. https：//doi.org/10.1038/s41467-024-50450-6
