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侵略性三阴性乳腺癌（TNBC）仍然缺乏批准的靶向治疗，需要进一步探索其潜在机制。先前的研究表明，SAT1在癌症中可能发挥作用，这需要在乳腺癌中进行进一步阐明。在本研究中，TNBC中高表达的SAT1预示着患者预后较差。SAT1敲减有效抑制了TNBC细胞在体外和体内的增殖和迁移能力。在机制方面，转录因子JUN通过与其启动子区域结合，增强了SAT1的转录活性。然后，细胞质中的SAT1蛋白与YBX1直接结合，通过E3连接酶HERC5介导的去泛素化作用维持YBX1蛋白的稳定性。此外，SAT1被发现通过稳定mTOR mRNA，并借助YBX1介导的m5C修饰积累，显著抑制自噬。这些发现证明了SAT1通过SAT1/YBX1/mTOR轴驱动TNBC进展，这可能为晚期TNBC的靶向治疗提供了潜在的候选目标。本文于2024年7月发表于“Advanced Science”（IF=14.3）上。
技术路线：
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结果：
1）SAT1上调危及TNBC患者的生存结果
在我们之前的研究中，在乳腺癌转移中发现了一部分标记有SAT1的细胞，然而，关于乳腺癌中SAT1的证据非常有限。为了探究这一点，首先，对两个单细胞测序队列（GSE176078和GSE75688）的分析显示，SAT1可能作为乳腺癌某些细胞群体的标志基因（图1A）。我们检查了SAT1在不同分子亚型乳腺癌中的存在，并发现与ER/PR阳性或HER2阳性乳腺癌相比，SAT1在TNBC中极为丰富（图1B,C）。在三个TNBC数据集（GSE38959、GSE45827和GSE65194）中，SAT1的表达在肿瘤中与相邻正常组织相比显著上调（图1D），这一发现也在SYSUCC的患者来源TNBC样本中得到证实，无论是在mRNA水平还是蛋白质水平（图1E–G）。包含100名TNBC患者肿瘤标本的组织微阵列证明，无论其表达如何，升高的SAT1都会对患者的生存结果产生不利影响（图1H,I）。![]()
2）高表达的SAT1促进TNBC的进展
为了确定SAT1在体内的关键功能，我们分别在雌性BALB/c裸鼠中建立了皮下异种移植和肝脏转移模型。从异种移植模型中观察到，由SAT1KD细胞发展的肿瘤体积显著减小（图2A），这也体现在肿瘤生长的减少（图2B）。从SAT1KD异种移植模型中取出的肿瘤中，EMT相关蛋白的表达水平也如预期下降（图2C）。在成功建立肝脏转移模型6周后，体内生物发光成像显示SAT1KD组的肝脏转移减少（图2D）。在来自转移模型的HE染色的肝脏组织中，我们也观察到SAT1KD组中的转移结节更少且更小（图2E）。上述结论为我们后续研究奠定了基石。![]()
3）JUN通过结合SAT1启动子增强SAT1转录活性
鉴于SAT1在TNBC中的上调重要性，我们研究了其上游转录因子。针对SAT1启动子序列，我们从JASPAR数据库中获得了十个转录因子（图3A）。在匹配得分最高的三个转录因子中，发现JUN与SAT1的正相关性最为显著，这意味着JUN在转录水平上调节SAT1表达的可能性最大（图3B）。在预测的JUN结合SAT1启动子的13个位点中，我们通过JASPAR数据库确定了四个最可能的结合位点进行验证（位点A: GGATCCTGAGTCACCCTGG；位点B: CCGCTATGACTAAG；位点C: AGGTAGTGAGTTATCTCAG；位点D: GTGTCATCATTAG；图3C,D）。在指定细胞中用siRNA沉默JUN后，SAT1在mRNA（图3E）和蛋白质水平（图3F）上明显下调。将全长SAT1启动子序列克隆到双荧光素酶载体中后，双荧光素酶报告实验显示，随着JUN的敲减，它们的结合减弱，而JUN过表达时结合增强（图3G）。为了确定JUN与SAT1启动子之间的确切结合位点，使用JUN抗体的ChIP实验确认了JUN直接不同程度地结合到SAT1启动子序列的所有四个位点（图3H）。在双荧光素酶载体中同样生成了这四个位点的删除突变体，并将其转染到BT549细胞中。双荧光素酶报告实验表明，针对位点C的删除突变体主要影响了JUN与SAT1启动区域的结合，表明位点C对于JUN增强SAT1转录活性起主导作用（图3I）。![]()
4）YBX1介导SAT1在TNBC进展中的作用
为了阐明SAT1如何促进TNBC的进展，我们从BT549和SUM159PT细胞中的CoIP-MS分析中识别出了79个相互作用蛋白（图4A）。在这些蛋白中，发现YBX1在乳腺癌的TNBC亚型中表达最高。在银染凝胶上也检测到了与YBX1蛋白大小相匹配的清晰条带（图4B）。上述发现提示我们，SAT1的作用可能通过与YBX1相互作用来实现。如图4C所示，在BT549和SUM159PT细胞中验证了SAT1与YBX1的结合。在TNBC细胞（图4D）和患者来源的组织（图4E）中观察到了SAT1和YBX1的共定位。在SAT1敲减后，YBX1在蛋白质水平上（图4G,H）而不是mRNA水平上（图4F）发生了显著变化。在SAT1WT细胞中重新过表达YBX1后，SAT1蛋白没有发生变化，因此确定YBX1是SAT1的下游（图4I）。因此，SAT1促进TNBC进展的功能是通过YBX1来调节的。![]()
5）SAT1通过E3连接酶HERC5介导的去泛素化作用稳定YBX1
随后，用CHX（50 μM）处理增强了SAT1KD细胞中YBX1的减少（图4J），而用MG132（50 μM）处理增加了YBX1蛋白的水平（图4K）。随着SAT1的减少，YBX1蛋白的泛素化水平明显增加（图4L），这表明上调的SAT1阻止了YBX1经历泛素介导的降解。为了进一步了解SAT1如何通过去泛素化维持YBX1蛋白的稳定性，我们研究了YBX1蛋白的质谱数据，并发现了两个E3连接酶，包括HERC2和HERC5（图5A）。由于HERC5具有更高的丰度和更多匹配的肽段，它被认为是实现YBX1泛素化的主要E3连接酶。通过CoIP实验（图5B）和细胞共定位（图5C）验证了HERC5能够与YBX1结合。增加HERC5导致YBX1蛋白显著减少，而在HERC5抑制后YBX1蛋白略有上升（图5D）。在CHX干预下，上调HERC5的TNBC细胞中YBX1蛋白的降解更为明显（图5E）。泛素化实验表明，YBX1蛋白的泛素化降解随后被HERC5敲减所减弱（图5F），相反，这一过程被HERC5过表达所加速（图5G）。此外，SAT1KD细胞中增强的YBX1蛋白泛素化水平可以通过降低HERC5成功逆转（图5H）。这些结果表明SAT1可以通过HERC5介导稳定YBX1蛋白。![]()
6）SAT1/YBX1诱导的自噬抑制促进TNBC进展
通过对多个TNBC队列（GSE38959、GSE45827和GSE65194）的转录组矩阵进行GSEA分析，我们发现SAT1在自噬中起着重要作用（图6A,B）。在自噬诱导剂EBSS存在的情况下，与SAT1WT细胞相比，SAT1KD细胞中的LC3-II/I蛋白水平明显升高，而p62相比对照组细胞下降得更明显（图6C,D）。同时，在用溶酶体抑制剂Baf-A1（图6E）和CQ（图6F）处理SAT1KD细胞后，观察到LC3-II/I和p62的增加。为了进一步观察自噬流，我们发现SAT1抑制增加了BT549细胞中稳定转染GFP-mRFP-LC3的红色和黄色颗粒，而Baf-A1处理减少了红色颗粒（自溶酶体）并增加了黄色颗粒（自噬体）（图6G,H）。这一发现证明了SAT1KD细胞中自噬的激活。SAT1KD细胞中YBX1的表达恢复能够降低LC3-II/I水平并提高p62水平，暗示细胞自噬被恢复到抑制状态（图6I）。这种效果也在自噬流中观察到。如图6J所示，YBX1的存在减少了红色颗粒，并且在使用Baf-A1处理后进一步增强。也就是说，YBX1确实干扰了SAT1引起的自噬调节。![]()
7）SAT1/YBX1通过m5C修饰增强mTOR mRNA稳定性
mTOR信号通路一直是限制自噬激活的中心。因此，我们假设SAT1/YBX1复合物所展示的抑制性自噬很可能是通过mTOR信号通路介导的。首先，早期TNBC数据集（GSE38959）的GSEA分析显示，SAT1和YBX1分别与mTOR信号正相关（图7A）。SAT1KD细胞中mTOR及其下游分子显著减少（图7B），这可以通过YBX1的过表达来恢复（图7C）。RT-qPCR分析表明，减少的SAT1和YBX1显著降低了mTOR的转录水平，这提示我们SAT1/YBX1复合物能够在转录水平上监测mTOR（图7D）。因此，我们检查了SAT1或YBX1是否会影响mTOR mRNA的稳定性，使用放线菌素D进行实验。随着放线菌素D暴露时间的延长，YBX1沉默的BT549细胞中mTOR mRNA的数量下降得更多，而在YBX1过表达的细胞中则积累得更多（图7E）。更令人印象深刻的是，SAT1KD BT549细胞中减少的mTOR mRNA可以通过YBX1的过表达来恢复（图7F）。这些数据表明，SAT1通过YBX1的介导在TNBC中维持mTOR mRNA的稳定性。值得注意的是，最近的研究已经确定YBX1是一种细胞质中的mRNA m5C修饰的读取器。我们推测SAT1/YBX1复合物可能通过YBX1介导的m5C修饰对mTOR mRNA产生影响，从而导致自噬的抑制。首先，通过YBX1抗体的RIP实验显示，YBX1蛋白直接与BT549细胞中的mTOR mRNA结合（图7G）。一致地，YBX1可以通过特异性识别mTOR mRNA的生物素化探针被拉下来（图7H）。点印迹实验揭示，YBX1的抑制导致了较低的m5C水平，而过表达的YBX1导致了较高的m5C水平（图7I）。我们还观察到，SAT1KD细胞中降低的m5C水平可以通过YBX1的过表达来挽救，这暗示了由SAT1/YBX1轴调节的mTOR mRNA的稳定性主要受m5C修饰的控制（图7J）。从RIP实验中可以清楚看到，mTOR mRNA不仅可以被m5C抗体检测到结合（图7K），而且由于SAT1下调导致的结合减少也可以通过YBX1逆转（图7L）。基于这些结果，我们得出结论，SAT1通过YBX1介导的m5C修饰维持mTOR mRNA的稳定性来抑制自噬，从而有利于TNBC的进展（图7M）。![]()
结论：
本研究确定了SAT1作为TNBC患者靶向治疗策略的潜在候选者。并且证实TNBC中SAT1的上调通过SAT1/YBX1/mTOR轴促进肿瘤进展。参考文献：
Tian W, Zhu L, Luo Y, Tang Y, Tan Q, Zou Y, Chen K, Deng X, Tang H, Li H,
Cai M, Xie X, Ye F. Autophagy Deficiency Induced by SAT1 Potentiates Tumor
Progression in Triple-Negative Breast Cancer. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul
29:e2309903. doi: 10.1002/advs.202309903.![]()
常规分子实验：免疫组化，RT-qPCR，Western Blots，免疫荧光，ChIP，双荧光素酶报告基因检测，RIP，点印迹法
细胞实验：CCK8，transwell
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课题设计与申报|分子生物学实验|细胞功能|机制调控|多组学检测分析
