基于糖工程的αPD-1-iRGD肽偶联物通过T细胞结合增强抗肿瘤疗效

 背景：

近年来，以免疫检查点抑制剂（ICIs）为代表的肿瘤免疫治疗为晚期肿瘤患者带来了显著的生存获益。随着时间的推移，ICI的适应证不断扩大，但在多种实体肿瘤中，ORR仅为10%~30%，这促使研究者开发具有更好抗肿瘤疗效的新型ICI。双特异性T细胞衔接器（Bispecific T cell engager,BiTEs）是一种新兴的免疫疗法，具有很好的治疗肿瘤的潜力。由于其与T细胞和肿瘤细胞的亲和力，BiTEs表现出结合效应，与天然抗体相比，可以在较低的剂量下介导有效的肿瘤控制。然而，传统的BiTEs含有一个或多个CD3结合域来实现T细胞结合，绕过T细胞受体（T cell receptor，TCR）和肽-主要组织相容性复合体（peptide-major histocompatibility complex,pMHC）的相互作用，可能导致非选择性T细胞活化和严重的副作用。考虑到PD-1+T细胞主要具有肿瘤特异性，研究尝试设计一种基于PD-1抗体的BiTE形式，将传统BiTE诱导的T细胞一般活化转化为肿瘤特异性模式。

然而，与嵌合抗原受体T细胞免疫疗法类似，BiTEs在血液系统肿瘤中的疗效尚未在实体瘤中获得成功。其中一个关键障碍是实体瘤致密的微环境导致的穿透困难。目前临床常用的PD-1/程序性细胞死亡蛋白-1（PD-L1）通路抑制剂均属于相对分子质量约为150kDa的抗体。巨大的肿瘤体积阻碍了PD-1抗体和PD-1抗体衍生的BiTEs在肿瘤组织中的分布。最近，一项使用锆89标记的帕博利珠单抗进行的正电子发射断层扫描成像研究表明，抗体在肿瘤区域达到峰值浓度大约需要5~7天。多维血管造影显示，天然抗体穿透肿瘤的范围局限于血管周围区域，约占肿瘤总量的35%。肿瘤局部分布缓慢且不均匀限制了PD-1单克隆抗体的疗效。一项小样本临床试验结果提示，局部PD-1抗体最大标准化摄取值与患者的临床应答、无进展生存期和总生存期呈正相关。然而，临床疗效与PD-1/PD-L1免疫组织化学染色评分无相关性，提示增强穿透性是提高PD-1阻断和PD-1抗体衍生的BiTEs疗效的潜在策略。为了便于在同系小鼠肿瘤模型中进行免疫学研究，研究选择了苏州基石药业开发的抗体CS1003作为后续开发的靶点。CS1003是一种人源化抗体，对人和鼠PD-1蛋白的亲和力相似(Kd 6.13 x 10-9 M for hPD-1,3.99 x 10-9 M for mPD-1)。其结合位点与已批准的抗体（如帕博利珠单抗和纳武利尤单抗）不同。与临床使用的帕博利珠单抗相比，CS1003具有相似的亲和力和药代动力学特征。在MC38-hPD-L1小鼠结肠癌模型中，在等效剂量条件下，CS1003和纳武利尤单抗表现出相当的抗肿瘤作用。

内化RGD（iRGD,c(CRGDKGPDC)）是一种很有前景的靶向药物递送工具，它通过与肿瘤血管上的αv整合素结合，促进药物进入肿瘤组织。随后，蛋白水解裂解暴露出CendR基序（CRGDK），使iRGD与肿瘤和内皮细胞上的神经纤毛蛋白-1（NRP-1）相互作用。这种相互作用激活了跨细胞转运过程，促进了药物渗透到肿瘤深处。因此，iRGD的多步骤机制，包括血管结合和蛋白水解激活，强调了其在改善实体肿瘤治疗药物靶向递送方面的潜力。iRGD通过与整合素和神经纤毛蛋白-1（NRP1）相互作用，被应用于递送药物，包括化疗药物、单链单克隆抗体和纳米粒子。团队已经报道了iRGD修饰的T细胞膜显著增强了T细胞的穿透和抗肿瘤效果。理论上，iRGD的黏附也可促进αPD-1的肿瘤穿透。然而，尚未见iRGD修饰天然双链单克隆抗体（mAb）的报道。传统方法是通过质粒转染和真核或原核表达对iRGD进行修饰。原核系统不能表达双链单克隆抗体，而真核系统在完全转换中难以构建iRGD的环结构（常出现部分环化）。因此，研究采用了一种非遗传糖工程方法，LacNAc-conju平台，将Fc结构域保守的糖基化位点与αPD-1连接起来。LacNAc-conju平台是团队前期构建的一种位点特异性的天然IgG一步修饰技术，该技术可将iRGD肽以接近2的肽抗体比进行位点特异性修饰。

本研究通过糖工程和生物正交反应制备了程序性细胞死亡蛋白-1抗体-iRGD环肽偶联物（αPD-1-(iRGD)2）。与BiTEs类似，αPD-1-(iRGD)2与T细胞和肿瘤细胞结合，激活肿瘤特异性T细胞，促进肿瘤消除。在各种小鼠肿瘤模型中，全身注射αPD-1-(iRGD)2诱导了肿瘤微环境（TME）的调节和令人印象深刻的肿瘤生长控制。此外，αPD-1-(iRGD)2可能通过肿瘤特异性T细胞与肿瘤细胞的结合来激活和扩增表达干细胞和记忆相关基因（Tcf7,Il7r，Lef1和Bach2）的肿瘤浸润T细胞（TIL）亚群。

 结果：

1.αPD-1-(iRGD)2的合成与表征

2.αPD-1-(iRGD)2与肿瘤细胞和T细胞相互作用

3.αPD-1-(iRGD)2在肿瘤内的靶向分布和穿透

4.αPD-1-(iRGD)2的抗肿瘤疗效

5.αPD-1-(iRGD)2的抗肿瘤效应依赖于肿瘤内预先存在的CD8+T细胞

6.αPD-1-(iRGD)2重塑肿瘤微环境

7.αPD-1-(iRGD)2可扩增效果更佳的CD8+TIL细胞群

 主要结论：

在过去的10年中，以PD-1/PDL1阻断为代表的免疫治疗彻底改变了几种类型肿瘤的标准治疗。然而，较差的药物摄取和较差的免疫浸润在很大程度上限制了临床获益。本研究通过糖工程平台对人类和小鼠的αPD-1进行了位点特异性修饰。研究证明了αPD-1-(iRGD)2可以通过同时结合T细胞和肿瘤细胞，促进肿瘤特异性T细胞扩增，并扩大“更好的效应”T细胞群来增强癌症治疗的潜力。αPD-1-(iRGD)2代表了抗PD1治疗方法的范式转变，通过独特的组合机制，αPD-1-(iRGD)2能够重塑TME，并为抗体偶联物的临床应用奠定基础。

 讨论：

BiTE是一种新兴的、很有前途的癌症免疫疗法，具有良好的治疗效果。然而，目前基于抗CD3的BiTEs有几个缺点，包括募集具有免疫抑制性的CD3+T细胞簇、有引发全系统细胞因子风暴的风险、免疫检查点分子上调、存在具有免疫抑制性的TME、肿瘤抗原丢失或逃逸以及效能欠佳。由于几乎所有T细胞都表达CD3，因此基于抗CD3的BiTEs可能引起普遍的CD3+T细胞动员，而基于PD-1抗体的BiTEs可特异性靶向和重定向肿瘤特异性CD8+TILs，而研究表明，这些TILs表达较高水平的PD-1，并出现短暂的功能受损。因此，研究选择αPD-1作为修改对象。研究发现αPD-1-(iRGD)2主要作用于PD-1+TILs，并避免了非选择性T细胞活化和过度的TCR信号传导。考虑到iRGD的渗透促进作用，研究排除了与渗透相关的因素，发现αPD-1-(iRGD)2仍然可以显著增强T细胞的细胞毒性。此外，多种竞争性抑制剂，包括游离的iRGD、αNRP1和αPD-1，在一定程度上抑制了aPD-1-(iRGD)2介导的结合形成、肿瘤消除和T细胞活化。即使研究将αPD1-(iRGD)2的剂量限制在0.1mg/kg，并降低给药频率，αPD-1-(iRGD)2也能在不阻断CD8+T细胞上PD-1表达的情况下，同样地扩增肿瘤特异性CD8+T细胞亚群，并诱导持久的肿瘤控制。这进一步表明，αPD-1-(iRGD)2通过iRGD穿透肿瘤核心后，主要与肿瘤细胞和T细胞结合，而不仅仅是作为PD-1的阻滞剂发挥作用。

一些研究小组还开发了其他形式的基于αPD-1的BiTE。已报道的基于αPD-1的BiTE主要靶向HER2、VEGF等。这些双特异性抗体都利用了IgG1 Fc结构域，表明抗体依赖的细胞介导的细胞毒性也是其抗肿瘤作用的重要组成部分。相反，偶联物具有较弱的Fc效应，从而减少了肿瘤特异性T细胞丢失的可能性。此外，与其他采用抗体片段设计进行肿瘤靶向的双特异性抗体不同，其中一些抗体表现出强亲和力，可以在不需要TCR-MHC相互作用的情况下介导肿瘤细胞毒性，而偶联物对肿瘤细胞表现出相对较弱的亲和力。它仍然依赖于TCR-pMHC复合体的相互作用来启动后续的细胞毒性。这种结构差异构成了αPD-1-(iRGD)2所表现出的肿瘤特异性T细胞活化特征的基础。最近，基于αPD-1-αCLEC9A的DC-T细胞衔接器（BiCE）也被报道，其Fc功能无效，旨在增强有效抗肿瘤免疫所需的细胞回路和通讯途径。与传统BiTE不同，BiCE的重点已转向免疫细胞之间的相互作用，更像免疫疗法。基于不同的设计思路，αPD-1衍生物已成为治疗探索的新兴方向。

与基于单链可变片段（scFv）的抗CD3-iRGD质粒构建和表达不同，研究通过糖工程平台对人类和小鼠的αPD-1进行了位点特异性修饰，保留了抗体的天然特性。它有以下几个优点。由于其较大的分子大小和FcRn介导的循环过程，带有Fc区的αPD-1-(iRGD)2在循环中的半衰期可能也比scFvs长。此外，αPD-1-(iRGD)2纯化更方便，溶解度和稳定性更高。另一方面，由于实体肿瘤的纤维性和致密微环境在很大程度上限制了BiTEs的临床获益，因此目前BiTEs的临床成功仅限于血液系统恶性肿瘤。为了解决这一问题，研究偶联了iRGD肽。iRGD肽已被证明通过与整合素和NRP-1的先后结合来促进治疗药物对肿瘤的渗透。在一项开放、多中心、I期临床研究中，iRGD多肽联合化疗药物在转移性胰腺导管腺癌中初步显示出较好的抗肿瘤疗效。研究团队先前将iRGD锚定在T细胞表面，以促进T细胞向MCS和肿瘤组织的浸润。本研究还设计了一种双功能的抗CD3-iRGD药物，它对CD3和iRGD受体具有双重亲和性，并提供额外的激活信号以进一步增强抗肿瘤作用。预先存在的T细胞分布是可能抑制癌症患者对BiTEs的应答的另一个关键因素。研究表明，与以往的设计不同，肿瘤内特异性CD8+T细胞足以支持αPD-1-(iRGD)2的抗肿瘤作用。

此外，αPD-1+iRGD组的游离iRGD剂量（2.5mg）相当于本研究中与αPD-1偶联的iRGD的绝对规模。然而，与αPD-1组相比，αPD-1+iRGD组的抗肿瘤效果并没有改善。与研究观察不同的是，Sugahara等人发现，当iRGD以4mmol/kg（小鼠约7.58mg）的剂量每隔1次给药时，结合iRGD肽的白蛋白结合型紫杉醇（ABX）具有与ABX结合游离iRGD相当的抗肿瘤效果对于研究结果，一个可能的解释是游离iRGD的半衰期限制在几分钟，这需要频繁给药。同时，游离的iRGD和αPD-1结合不能介导T细胞与肿瘤细胞的结合。在研究中，剂量的缩减并没有阻碍αPD-1(iRGD)2的抗肿瘤作用，CD8+T细胞上的PD-1表达没有受到抑制，并且肿瘤特异性T细胞亚群（CD39+PD-1+）显著扩增。因此推测αPD-1-(iRGD)2引起肿瘤细胞与T细胞聚集，从而促进TCR-pMHC相互作用，促进肿瘤特异性T细胞活化和增殖。iRGD结合产生类似BiTE的抗肿瘤机制，显著降低iRGD所需剂量，延长注射间隔，提高治疗依从性和可行性。

最后但并非最不重要的是，αPD-1-(iRGD)2增强了CD8+T细胞，并增加了“更好效应”的PD-1+TCF-1+CD8+T细胞群，这些细胞已成为慢性感染和癌症中免疫应答的重要决定因素，而它们的丰度对癌症免疫疗法的成功至关重要。在研究中给予αPD-1-(iRGD)2后，表达干细胞和记忆相关基因、中间效应基因和低水平耗竭标志物的T细胞亚群的丰度增加。根据之前的研究，将其定义为“效果更好的人”。研究假设，αPD-1-(iRGD)2的双重亲和力维持了CD8+TIL的干性和记忆性特征iRGD的受体，包括整合素αv和NRP1，已被报道调节抗肿瘤CD8+T细胞免疫和对PD-1阻断的反应。进一步的研究需要阐明iRGD对整合素αv和NRP1的调控。

肿瘤特异性TILs的丰度和iRGD受体的表达可能是αPD1-(iRGD)2应用的潜在标志物。然而，尽管B16F10和4T1被定义为免疫浸润较差的“冷肿瘤”，但在B16F10和4T1小鼠肿瘤模型中，αPD1-(iRGD)2仍保持了其抗肿瘤功效。同时，各种非恶性情况，如炎症和伤口愈合会导致肿瘤靶向性中相同的靶分子的上调。临床转化前还需要进一步的安全性评估。iRGD联合白蛋白结合型紫杉醇和吉西他滨治疗转移性胰腺导管腺癌的I期临床研究（NCT03517176）。最常见的3级或4级事件是中性粒细胞减少、贫血、白细胞减少和肺栓塞，这些情况与白蛋白结合型紫杉醇组和吉西他滨组相似。然而，由于患者数量有限，需要更广泛的试验来进一步确定iRGD及其衍生物的安全性。

在过去十年中，以PD-1/PDL1阻断为代表的免疫疗法彻底改变了多种肿瘤的标准治疗。然而，药物吸收不佳和免疫浸润较差在很大程度上限制了临床益处。在这项工作中，研究通过糖工程平台对人类和小鼠的αPD-1进行了位点特异性修饰。研究证明了αPD-1-(iRGD)2可以通过同时结合T细胞和肿瘤细胞，促进肿瘤特异性T细胞扩增，并扩大“更好的效应”T细胞群来增强癌症治疗的潜力。αPD-1-(iRGD)2代表了抗PD1治疗方法的范式转变，通过独特的组合机制，αPD-1-(iRGD)2能够重塑TME，并为抗体偶联物的临床应用奠定基础。

 小结：

尽管近年来免疫检查点抑制剂取得了重要突破，但客观缓解率仍然有限。本研究通过糖工程方法合成了程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）抗体-iRGD环肽偶联物（αPD-1-(iRGD)2）。除增强组织穿透外，αPD-1-(iRGD)2通过双重靶向同时与肿瘤细胞和PD-1+T细胞结合，从而介导肿瘤特异性T细胞的活化和增殖，而对非特异性T细胞的影响较小。在多种同系小鼠模型中，αPD-1-(iRGD)2可有效抑制肿瘤生长，且具有良好的生物安全性。此外，流式细胞术和单细胞RNA测序结果显示，αPD-1-(iRGD)2重塑了肿瘤微环境，并扩大了一群效果更好的CD8+肿瘤浸润T细胞群，这些T细胞表达干细胞和记忆细胞相关基因，包括Tcf7，Il7r，Lef1和Bach2。综上所述，αPD-1-(iRGD)2是一种有前景的抗体偶联物，在肿瘤免疫治疗中具有超越抗体-药物偶联物的作用。

（翻译及审校：梁嘉伟、李彦慧）