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肾透明细胞癌(ccRCC)是肾癌中占比最高的病理类型，其进展的具体机制尚不清楚。在本研究中，研究人员分析了肾透明细胞癌的scRNA-seq数据集，发现MIOX是一个在肾透明细胞癌肿瘤上皮细胞中特异性下调的基因。TCGA数据库分析进一步验证了MIOX mRNA水平降低与ccRCC恶性表型和不良预后的关系。免疫组化结果显示，MIOX在ccRCC组织中的表达明显低于配对的癌旁组织，且原发灶转移患者的原发灶中MIOX的表达明显低于未转移患者。MIOX低表达患者的无转移生存期(MFS)明显短于MIOX高表达患者。体外实验结果显示，在ccRCC细胞中过表达MIOX可抑制细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡。机制上，上调MIOX可通过抑制自噬，提高ROS水平，从而抑制STAT3/c- myc介导的ccRCC细胞上皮-间质转化。体内数据进一步证实，MIOX表达增加抑制肾癌细胞的生长和增殖，降低肾癌细胞在肺内形成转移的能力。MIOX是ccRCC的重要调控分子，有助于了解ccRCC进展的潜在分子机制，并可能为ccRCC的临床治疗提供新的选择。本文于2024年2月发表在《Redox Biology》，IF：11.4。技术路线：
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主要实验结果：
1. MIOX在肾透明细胞癌中具有潜在的调控作用
为了探索肾透明细胞癌的潜在调控基因，作者对肾透明细胞癌的scRNA-seq数据集进行了进一步的生物信息学分析。经过质量控制，从正常组织鉴定出7786个单细胞，从肿瘤组织鉴定出16,764个单细胞，其中几乎没有肾源性再生细胞(图1A)。根据主要细胞类型的标记物鉴定各细胞簇的细胞类型，最终将细胞分为15种细胞类型(图1B)。随后，作者关注了肿瘤细胞中基因表达谱的变化。提取上皮细胞，根据样本来源筛选DEGs(图1C)。与正常上皮细胞相比，肿瘤上皮细胞中有152个基因表达上调，114个基因表达下调，作者从中筛选出前10个下调基因(图1D)。在前5个下调基因中，ALDOB、GPX3和FBP1在肾癌中的调控功能已有报道。因此，作者在TCGA ccRCC数据库中进行了进一步的研究。对S100A2的生存分析显示，低表达组和高表达组的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）无显著差异（Logrank p值分别为0.11和0.15），这表明S100A2在ccRCC中的表达与ccRCC患者的预后无关。据我们所知，目前还没有关于MIOX在ccRCC中的研究。对于MIOX，对scRNA-seq数据的分析表明MIOX在肿瘤上皮细胞中显著下调(图1E)。此外，对TCGA数据库的分析显示，与癌旁正常组织相比，MIOX在癌组织中显著下调。(图1)。进一步分析MIOX表达与ccRCC患者临床特征的相关性。MIOX表达降低与较高的肿瘤病理分级(Furhman 3+4级)、临床分期(Ш+Ⅳ期)和肿瘤分期(T3+T4)相关，并且初诊转移性患者(M1)的原发肿瘤中MIOX表达显著低于非转移性患者(M0)(图1G)。进一步的预后分析显示，MIOX高表达患者的OS和DFS均显著高于MIOX低表达患者(OS: p<0.0001, HR=0.5403, 95%CI:0.4006-0.7288;
DFS:p=0.0001, HR=0.4769, 95%CI:0.3296-0.6901)(图1H-I)。MIOX与ccRCC的进展密切相关，可能是ccRCC中具有抑癌功能的基因。![]()
图1：MIOX作为ccRCC抑制基因的鉴定
2. 验证MIOX在肾透明细胞癌样本和细胞系中的表达及其临床相关性
作者对ccRCC的临床样本进行了进一步的研究。收集26对ccRCC癌组织和癌旁正常肾组织，采用qRT-PCR检测其MIOX mRNA表达水平。24/26例(92.3%)肾透明细胞癌组织中MIOX表达明显低于癌旁组织。(图1J)。收集2015年接受手术治疗的153例ccRCC患者的石蜡包埋组织，构建TMA。IHC结果显示，MIOX在ccRCC组织中的表达明显低于癌旁组织(图1K-L)。此外，MIOX表达降低与较高的肿瘤分期(T3+T4)和TNM分期(III+IV)相关(图1M−N)。有原发转移的患者(M1)的MIOX表达也低于无原发转移的患者(M0)。(图1O)。接受手术治疗的患者术后至少随访5年。以术后是否发生转移为终点，绘制无转移生存(MFS)曲线。如图1P所示，MIOX低表达患者的MFS明显短于MIOX高表达患者。此外，进一步通过qRT-PCR和western blot检测发现，与人肾小管上皮细胞株HK-2相比，人肾癌细胞株786-O、769-P、ACHN、A498和Caki-1的mRNA和蛋白表达均显著降低。MIOX在ccRCC组织和细胞株中表达下调，且MIOX在ccRCC中的表达下调与肿瘤的恶性表型有关。3. MIOX过表达可抑制ccRCC的恶性表型
为了研究MIOX在ccRCC中的调节作用，作者首先在过表达质粒或siRNA的786-O和769-P细胞中过表达或敲低MIOX(图2A)。MTT实验表明MIOX过表达显著抑制了细胞增殖，而MIOX敲低后这一过程被逆转(图2B)。Transwell实验和划痕实验检测ccRCC细胞的迁移和侵袭能力。在786-O和769-P细胞中过表达MIOX显著抑制了细胞的迁移和侵袭(图2C和E)，而敲低MIOX则增加了细胞的迁移和侵袭(图2D和F)。此外，作者发现MIOX过表达显著促进了ccRCC细胞的凋亡(图2G)，敲低MIOX后凋亡细胞的比例显著降低，说明MIOX对ccRCC细胞的凋亡有促进作用(图2H)。细胞凋亡可干扰细胞的增殖表型。为了排除凋亡对增殖的影响，作者进行了Ki67染色，发现MIOX过表达后Ki67染色的阳性率降低，而MIOX敲低后Ki67染色的阳性率升高，证实了MIOX对增殖的影响。作者的研究结果证明MIOX在ccRCC的进展中发挥着潜在的抑癌基因的功能。![]()
图2：MIOX过表达可抑制ccRCC细胞的体外侵袭性
4. MIOX可抑制ccRCC细胞的自噬和EMT
接下来，作者探索了MIOX在ccRCC中的调控机制。据报道MIOX上调导致肾小管上皮细胞自噬受到抑制，自噬抑制可在肿瘤进展中发挥抗肿瘤作用，因此作者将携带GFP-RFP-LC3质粒的慢病毒转染到786-O和769-P细胞中。在正常条件下，MIOX瞬时过表达细胞中黄色点状(GFP+ RFP+)和红色点状(GFP- RFP+)的数量均减少(图3A-D)。饥饿(无FBS)2h后，vector转染细胞和miox过表达细胞的黄色点状斑点和红色点状斑点数量均增加，但miox过表达细胞的LC3点状斑点仍然少于vector转染细胞(图3A-D)。此外，TEM扫描显示，在MIOX过表达的786-O和769-P细胞中，自噬体和自噬溶酶体数量减少(图3E)。进一步利用TCGA ccRCC数据库中的RNA-seq数据进行MIOX表达的基因集富集分析(GSEA)。作者发现，在MIOX的负相关通路中，EMT通路排名第一(NES=−1.91,p<0.01)(图3F-G)，表明MIOX可能抑制ccRCC的EMT。通常，EMT过程的特征是细胞形态的改变和上皮标志物E-cadherin表达的变化。因此，通过分析细胞形态和E-cadherin表达来证明EMT。作者发现MIOX过表达扰乱了细胞极性，恢复了细胞的圆形上皮型形态，并导致E-cadherin在免疫荧光染色中荧光强度增强。相反，敲低MIOX后，细胞向梭形间充质样表型转化，并减弱E-cadherin的荧光强度，表明MIOX对EMT的抑制作用(图3H-I)。然后，作者通过慢病毒转染筛选MIOX稳定过表达和敲低的786-O和769-P细胞系(图3J-M)。过表达MIOX导致E-cadherin表达上调，vimentin表达下调，表明EMT抑制，上皮标志物升高，间质标志物降低(图3J和L)，而敲低MIOX则相反(图3K和M)。自噬流是指货物通过自噬系统从吞噬体形成到运送到溶酶体降解的整个过程。作者还检测了LC3和SQSTM1的蛋白表达，它们通常用于表征自噬流，上调MIOX后，LC3 II减少，SQSTM1增加，自噬流减少(图3J和L)，而下调MIOX后，自噬流明显增加(图3K和M)，这些结果证实MIOX抑制ccRCC细胞的自噬和EMT。![]()
图3.MIOX调节ccRCC细胞的自噬和EMT
5. MIOX通过调控细胞自噬来调控EMT
自噬可调控肿瘤细胞的EMT。作者进一步探索MIOX是否通过调控自噬来调控EMT。采用自噬抑制剂氯喹(CQ)和自噬激活剂雷帕霉素干预ccRCC细胞的自噬状态。在786-O细胞中，CQ处理导致LC3和SQSTM1蛋白聚集，E-cadherin表达增加，vimentin表达减少。MIOX过表达引起的E-cadherin上调和vimentin下调被CQ处理加速，提示EMT进一步受到抑制(图4A)。CQ处理还逆转了MIOX敲低引起的E-cadherin的降低和vimentin的增加(图4C)。相反，雷帕霉素处理导致自噬流激活，并加速了MIOX敲低引起的E-cadherin降低和vimentin增加(图4D)。MIOX过表达对E-cadherin和vimentin的影响也被雷帕霉素处理逆转(图4B)。在769-P细胞中观察到类似结果(图4E-H)。这一数据证实了MIOX对EMT的调控作用是通过调节自噬实现的。![]()
图4：MIOX通过调控细胞自噬来调控EMT
6. miox介导的自噬抑制导致ROS水平升高，从而抑制STAT3/c- myc介导的EMT
为了进一步研究MIOX在ccRCC进展中的调控机制，使用786-O-Vector (MIOX-control)和786-O-MIOX(MIOX-过表达)进行RNA-seq实验，获得两种细胞中不同基因的表达水平，分析差异基因并进行GSEA(Con vs MIOX)分析。结果显示，MYC和IL6-JAK-STAT3通路在786-O-Vector(Con)中显著富集，表明MIOX可能与MYC和IL6-JAK-STAT3通路呈负相关(图5A-C)。STAT3和MYC(c-Myc)是两种促癌信号，可诱导EMT。STAT3还可以促进c-Myc的转录表达，STAT3/c-Myc信号轴在肿瘤进展中发挥关键作用。因此，作者推测MIOX对EMT的调控作用与STAT3/c-Myc信号轴有关。Western blot结果显示，MIOX过表达显著抑制ccRCC细胞株中p-STAT3和c-Myc的表达(图5D-E)。相反，MIOX敲低促进了p-STAT3和c-Myc的表达(图S6 A-B)。既往研究表明，抑制自噬可导致ROS在积聚。此外，在某些癌症类型中，ROS抑制p-STAT3并干扰STAT3的下游信号转导。作者进一步研究了MIOX是否通过抑制自噬来上调ROS水平，从而介导STAT3/c-Myc信号轴的抑制。首先，采用流式细胞术检测ROS水平;采用能够反映细胞整体氧化应激状态的DCFH-DA荧光探针进行细胞内ROS检测。作者发现MIOX过表达显著增加了786-O和769-P细胞中的ROS水平(图5F-G)。雷帕霉素处理后的自噬激活抑制了ROS水平的增加(图5F-G)。此外，敲低MIOX可降低ROS水平，而使用CQ处理抑制自噬可逆转这一情况。采用NAC和H2O2探究ROS对ccRCC细胞中STAT3/c-Myc信号轴的影响。NAC治疗挽救了MIOX过表达引起的p-STAT3和c-Myc的下降(图5H-I)。H2O2处理逆转了miox敲低细胞中p-STAT3和c-Myc的增加。最后，作者研究了STAT3/c-Myc信号轴对肾透明细胞癌细胞EMT的诱导作用。Colivelin是STAT3的激活剂，促进STAT3磷酸化。10058-F4是c-Myc的抑制剂。Colivelin处理逆转了MIOX过表达介导的E-cadherin的升高和vimentin的降低，恢复了786-O和769-P细胞的迁移和侵袭能力(图5J-M)。然而，当Colivelin与10058-F4联合处理时，Colivelin的作用被部分消除(图5J-M)。作者证实MIOX通过抑制自噬增加ROS水平，从而抑制STAT3/c- myc介导的肾透明细胞癌EMT。![]()
图5：MIOX抑制自噬导致ROS水平升高，从而抑制STAT3/c- myc介导的肾透明细胞癌EMT和侵袭性
7. 过表达MIOX可抑制肾癌细胞在体内的生长和转移
在小鼠模型中进一步探讨MIOX对肾癌的调控作用。作者首先构建了MIOX稳定过表达的小鼠肾癌细胞株Renca(图6A)。将细胞注入小鼠背部中部皮下。3周后处死携带肿瘤的小鼠，取皮下肿瘤。与Vector组相比，MIOX过表达显著降低了肿瘤体积和重量(图6B-C)。然后将各组细胞静脉注射入小鼠体内，建立肺转移模型。注射后2周对小鼠进行活体成像。与对照组相比，MIOX过表达组肺转移灶信号强度明显降低(图6D-E)。注射后3周处死小鼠取肺组织。与对照组相比，作者观察到MIOX过表达组的肺转移显著减少(图6F)。苏木素-伊红染色也显示MIOX过表达组肺转移灶的大小和数量减少(图6G-H)。接下来，作者进一步研究了MIOX在体内对STAT3/c-Myc信号轴的调控作用。IHC染色显示，MIOX过表达导致肺转移灶中LC3降低，SQSTM1增加，p-STAT3和c-Myc抑制(图6I)。Western blot检测肺转移瘤组织中STAT3/c-Myc信号通路的表达。结果显示，MIOX过表达组中p-STAT3和c-Myc的表达降低，与IHC染色结果一致。![]()
图6：过表达MIOX可抑制肾癌细胞在体内的生长和转移。
参考文献：Meng L, Gao J, Mo W, Wang B, Shen H, Cao W, Ding M, Diao W, Chen W,
Zhang Q, Shu J, Dai H, Guo H. MIOX inhibits autophagy to regulate the ROS
-driven inhibition of STAT3/c-Myc-mediated epithelial-mesenchymal transition in
clear cell renal cell carcinoma. Redox Biol. 2023 Dec;68:102956. doi:
10.1016/j.redox.2023.102956. Epub 2023 Nov 7. Erratum in: Redox Biol. 2024
Feb;69:102997. PMID: 37977044; PMCID: PMC10692917.
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常规分子实验：scRNA-seq、qRT-PCR、免疫组化、Western blot、免疫荧光
细胞实验：质粒转染、MTT实验、转移孔和划痕愈合实验、慢病毒转染、自噬通量检测
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谢谢！
课题设计与申报|分子生物学实验|细胞功能|机制调控|多组学检测分析
