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据报道，微凝块存在于SARS-CoV-2感染（PASC）的急性后遗症和血栓形成性疾病中(如肺栓塞)。通过淀粉样蛋白染色检测到，微凝块含有纤维蛋白(原)以及其他与炎症有关的凝血因子和分子。由于这些含有淀粉样纤维蛋白(原)的聚集物对纤维蛋白溶解具有相对抵抗性，它们被认为会引起广泛的微血栓形成，并产生不良预后。然而，它们作为疾病的生物标志物或在免疫血栓发病机制中的作用尚不清楚。
该研究旨在探讨淀粉样蛋白-纤维蛋白（原）聚集体所定义的微血栓与危重患者之间的相关性，危重患者通常会出现凝血和循环障碍，从而影响其预后。
方法
1.收集了入院的危重患者的血液标本，健康人血液标本为对照。
2.用硫黄素T对贫血小板血浆(PPP)标本进行染色，使用荧光显微镜观察，Image J软件来识别和量化微凝块。
3.为了评估微凝块的组成，进行蛋白质组学分析。荧光显微镜观察血浆与AlexaFluor647标记的抗纤维蛋白原β抗体共定位情况；
为了评估冻融和长期储存对微凝块存在的影响，对10名健康献血者的标本分别进行了新鲜时和储存（-80°C）七天后的分析。
结果
图 1.微凝块分析方法
(A) 微血凝块定量：将重症患者和健康对照组的静脉血标本收集到柠檬酸钠管中。通过离心分离贫血小板血浆（PPP）。用硫黄素 T（ThT）孵育贫血小板血浆，并用荧光显微镜评估微凝块的存在。
(B) 微凝块组成：离心 PPP 后，有微凝块的危重病人的 PPP 含有可见的颗粒，而无微凝块的病人或健康对照组的 PPP 则不含这种颗粒。用胰蛋白酶消化颗粒后进行质谱分析。
(C）淀粉样纤维蛋白共定位：将 PPP 、荧光标记的抗纤维蛋白原抗体和 ThT 一起孵育。通过荧光显微镜评估共定位情况。
图 2.微血块与危重症有关
(A）根据每个视野中的小凝块数量（计数/视野）对小凝块进行表征。图为典型图像。
(B）比较入住重症监护室（ICU）的患者（104 人）与配对的新鲜和冷冻对照组(10 人)以及历史正常健康对照组（10 人）的微血凝块数量（计数/视野）。
(C）根据大小（像素/视野）对微血块进行表征。图示为典型图像。
(D）比较入住重症监护室的患者（104 人）与配对的新鲜和冷冻对照组（10 人）和历史正常健康对照组（10 人）的微血凝块大小（像素/视野）。
(E）比较了ICU非败血症患者（n=62）和败血症患者（n=42）的微凝块数量和大小。
(F）对诊断为弥散性血管内凝血（DIC；19 人）和非 DIC（85 人）患者的微凝块数量和大小进行比较。
图 3.重症患者微凝块的蛋白质组学分析
(A)获取所有胰蛋白酶碎片离子谱-质谱（SWATH-MS）分析了 3 名重症监护室患者的胰蛋白酶消化小凝块。并表示了三名患者中相对 SWATH-MS 信号强度最高的 20 种蛋白质（总计），并与对照血浆库进行了比较。通过 DDA 和 SWATH 鉴定出的肽的代表性 MS/MS 图谱显示了纤维蛋白原-α 链（B）、-β 链（C）和-γ 链（D）。
缩写：FGB = 纤维蛋白原β链，FGA = 纤维蛋白原α链，FGG = 纤维蛋白原γ链，APOA1 = 载脂蛋白 A-I，KIF4A = 染色体相关驱动蛋白 KIF4A，ALB = 白蛋白，ILF3 = 白细胞介素增强因子结合因子 3，TGFBI = 转化生长因子β诱导蛋白 ig-h3，CILP2 = 软骨中间层蛋白 2、SAA2=血清淀粉样蛋白 A-2 蛋白，APOB=载脂蛋白 B-100，APOA2=载脂蛋白 A-II，POSTN=包膜组织蛋白，SERPINA1=甲型-1 抗胰蛋白酶，FSIP2=纤维鞘相互作用蛋白 2、IGHA1=免疫球蛋白重常数α1，HRG=富组氨酸糖蛋白，GSTP1=谷胱甘肽 S-转移酶 P，MSN=膜联蛋白，C5=补体 C5。
图 4.淀粉样蛋白聚集体与纤维蛋白共定位
对健康对照和危重患者 （n=3） 的贫血小板血浆（PPP）进行多色免疫荧光显微镜检查，用硫黄素 T（左）和抗纤维蛋白原-AlexaFluor647 抗体（中）共同染色。合并后的图像（右）演示了共定位。
图5.微凝块的存在是危重患者弥散性血管内凝血 （DIC） 和死亡率的独立预测因子
(A)粗比值比和调整比值比的多变量分析（根据年龄和性别调整患者）。由微凝块数 （>1/视野） 或大小 （>200 像素/视野）定义的微凝块的存在与弥散性血管内凝血 （DIC） 的发展独立相关。
(B)粗比值比和调整比值比的多变量分析（根据年龄和性别调整患者）。微凝块的存在与 28 天死亡率独立相关。
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与健康对照组相比，危重症患者的微凝块的数量和大小都有所增加，并与脓毒症相关。拥有较高数量或较大尺寸微凝块的患者发生弥散性血管内凝血(DIC )，且28天死亡率的概率增加。入院危重症护理时测量的微血块水平可预测弥散性血管内凝血发展和死亡风险。
总之，研究者认为，新的临床观察证明微凝块和ICU患者的预后呈现相关性。由淀粉样纤维蛋白（原）聚集物定义的微凝块，在识别脓毒症和预测不良凝血病变和临床结果方面可能有一定作用。
参考文献
Schofield J, Abrams ST, Jenkins R, Lane S, Wang G, Toh CH. Amyloid-Fibrinogen Aggregates ("Microclots") Predict Risks of Disseminated Intravascular Coagulation and Mortality. Blood Adv. Published online March 20, 2024.
感谢浙江省人民医院输血科来稿
公众号｜输血人
本期编译｜张程晨、陈秉宇
